專利名稱：虎源性、豹源性dna的pcr檢測引物、試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及虎豹的基因檢測方法。尤其是虎豹基因的PCR檢測方法及其中所涉及 的特異性引物和相關(guān)試劑盒。
背景技術(shù)：
虎、豹均是貓科豹屬下的動物?；⑹鞘澜缟象w形最大的貓科動物，現(xiàn)存5個虎 亞種，包括東北虎(Panthera tigris altaica)、蘇門達臘虎(P. t. sumatrae)、華南虎 (P. t. amoyensis)、印支虎(P. t. corbetti)和孟加拉虎(P. t. tigris)。目前，中國境內(nèi)野生 虎的數(shù)量已十分稀少。豹在豹屬的四種大型貓科動物(其余三種為獅、虎、美洲豹)中體積最小。豹的顏 色鮮艷，有許多斑點和金黃色的皮毛，故又名金錢豹或花豹。為了野生動物貿(mào)易能夠持續(xù)發(fā)展，各國制定了相應(yīng)的野生動物保護法規(guī)，禁止 瀕危動物的捕殺和貿(mào)易。國際上于1975年簽署了《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約 (CITES)》，中國于1981年加入該公約。盡管公約的成員國已達160個.野生動物非法狩獵 和野生動物走私活動在世界各地仍非常猖獗.繼續(xù)威脅著野生動物的生存。一些對虎豹 皮、器官或制品有傳統(tǒng)需求的民族通過新近的發(fā)展獲得了新的經(jīng)濟水平，使得他們有足夠 的財力來獲得摯愛的皮革、器官及其制品，這種需求極大地刺激了貓科動物的非法貿(mào)易，而 國際間監(jiān)管、執(zhí)法的難度讓保護力量顯得過于蒼白。在野生動物取證過程中，有些情況下其產(chǎn)品經(jīng)加工處理后失去了可辨認的形態(tài)特 征，使虎豹制品的鑒定工作十分困難。由此可見，為了更有效地加強虎豹類的保護工作，建 立一種可以對虎、豹DNA進行特異性檢測的準確性高、實用性強的方法，從分子水平上對可 疑的來自于虎、豹的樣品(例如食品、藥品、皮毛等)進行特異性檢測鑒定，都是十分急需和 必要的。本研究中通過篩選虎、豹與其它動物在線粒體細胞色素b(Cyt b)基因片段的堿基 差異合成特異引物，經(jīng)過PCR擴增檢測，達到了特異性檢測鑒定虎、豹DNA的目的。由此建 立了一種靈敏、特異、簡便、快速、穩(wěn)定性好的虎、豹DNA檢測方法，為海關(guān)緝私、動物保護等 提供了 一個快速有效的檢測平臺。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即在于提供方便、快速、靈敏地定量檢測虎、豹DNA的PCR檢測方法， 以及檢測中所使用的包含特異性引物序列的試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供虎源性、豹源性DNA的PCR檢測引物，它們是引物序列正向引物(SEQID NO. 1) :5，GAATATACTATGGCTCCTACAC 3，，反向引物(SEQID NO. 2) :5，GGTTGGCGGGGATGTAGTTA 3，。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供虎源性、豹源性DNA的PCR檢測試劑盒，所述的試劑盒包括檢測溶液，該檢測溶液中含有10 XPCR緩沖液、10 ii mol/L正向引物、10 ii mol/L反向引 物、10mmol/L dNTP,5U/uL Taq DNA聚合酶；其中，所述的正向引物序列為SEQ ID NO. 1，反 向引物序列為SEQ ID NO. 2。本發(fā)明進一步提供了利用上述試劑盒檢測虎源性、豹源性DNA的PCR檢測方法，該 方法使用上述試劑盒，包括如下步驟①提取待測樣品DNA，得到模板DNA溶液；②反應(yīng)體系取lyl步驟①制得的模板DNA溶液，加入上述試劑盒中的溶液 6. 2 u 1，再加入滅菌超純水至總體積25 u 1 ；將以上各組分加入至0. 2mL PCR反應(yīng)管中，混 勻，5000r/min，離心 10s ；③步驟②的反應(yīng)體系按下述條件進行PCR檢測預(yù)變性94°C，3min；進入循環(huán)94°C變性60s，60°C退火60s，72°C延伸60s，35次循環(huán)；終止延伸72°C，7min；4°C保存反應(yīng)產(chǎn)物。本發(fā)明是采用PCR檢測技術(shù)，對虎源性、豹源性制品的DNA進行鑒定。本發(fā)明所建 立的對虎源性、豹源性DNA進行特異性檢測的方法，除具有高特異性、靈敏性外，因其具有 簡便易行、快速、成本低等特點而更具有實用性。此方法為海關(guān)、動植物檢疫以及動物保護 組織提供了快速檢測鑒定虎制品的有效方法。非法出售的虎、豹制品可能都經(jīng)過了加工處理過程，從而造成DNA的斷裂和損失， 顯然也會影響檢測的靈敏度。為了研究加工過程對檢測靈敏度的影響，本實驗采用加工烘 烤過的虎肉粉進行靈敏度檢測。本方法可以檢測到經(jīng)過這種處理后的樣品，檢測靈敏度是 10pg/y L0


圖1虎、豹成分PCR特異性擴增結(jié)果；圖2虎源性成分PCR靈敏度檢測擴增結(jié)果；圖3豹源性成分PCR靈敏度檢測擴增結(jié)果。
具體實施例方式下面為本發(fā)明的具體實施例，它對本發(fā)明技術(shù)方案的建立及其應(yīng)用作進一步的說 明，但并不以任何形式限制本發(fā)明的內(nèi)容。若無特殊說明，本部分試驗所用東北虎血、東北虎肉、印支虎血、孟加拉虎血、亞洲 獅血、東非獅血、金錢豹血、雪豹血、黑熊血等樣品由大連森林動物園提供；牛骨粉、山羊骨 粉、豬骨粉、驢骨粉、兔骨粉、鹿骨粉、馬骨粉、狗骨粉等樣品為國家標準樣品；上述血液類試 驗樣品，采用Blood Genome DNAExtraction Kit試劑盒進行基因組DNA的提取，購自寶生 物工程(大連)有限公司，貨號D9081 ；其它組織類和骨粉類樣品采用動物源性植物飼料基 因組DNA提取試劑盒進行提取，購自天根生化科技(北京)有限公司，貨號DP323-03 ；普通 PCR儀(PE24000，美國)，高速離心機centrifuge 5804 (Eppendorf公司，德國)，核酸蛋白 分析儀(Beckman DUM0)，恒溫干燥箱(SANYO mov-213F,日本)。
實施例1虎、豹DNA的PCR檢測試劑盒及檢測方法的建立一、虎、豹DNA的PCR檢測弓丨物的設(shè)計根據(jù)虎、豹與其它多種貓科動物和哺乳動物mtDNA細胞色素b基因序列的差異，及 弓丨物設(shè)計原則，設(shè)計用于檢測的弓I物序列如下 正向引物(SEQID NO. 1) :5，GAATATACTATGGCTCCTACAC 3，，反向引物(SEQID NO. 2) :5，GGTTGGCGGGGATGTAGTTA 3，。二、虎、豹DNA的PCR檢測試劑盒的構(gòu)建在獲得上述特異性引物對的基礎(chǔ)上，設(shè)計用于虎、豹DNA的PCR檢測的試劑盒， 該檢測溶液中含有10XPCR緩沖液、lOymol/L正向引物、lOymol/L反向引物、lOmmol/L dNTP、5U/yL Taq DNA聚合酶；其中，所述的正向引物序列為SEQ ID N0. 1，反向引物序列為 SEQ ID N0. 2。三、虎、豹DNA的PCR檢測方法的建立1、DNA樣品的制備本實施例的DNA樣品制備方法參考《DNA及RNA基本實驗技術(shù)》(科學(xué)出版社， A.J.哈伍德主編，盛小禹等譯)，具體為(1)樣品制備虎肉樣品稱取約IOOg虎的肌肉組織，切碎，于120°C烘烤過夜，用組織研磨器研 磨成粉末狀。血液樣品每毫升血液樣品加入2mg的2%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝待用。骨粉樣品可直接用于DNA的提取。(2) DNA提取采用試劑盒提取法制備待測樣品DNA基因組血液類試驗樣品，采用Blood Genome DNA Extraction Kit試劑盒進行基因組DNA 的提取，購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D9081。其它組織類和骨粉類樣品采用動 物源性植物飼料基因組DNA提取試劑盒進行提取，購自天根生化科技(北京)有限公司，貨 號 DP323-03。對于提取的血液、組織及骨粉DNA樣本，采用紫外分光光度計檢測其濃度和純度。2、PCR 反應(yīng)取Iul待測樣品DNA溶液，加入上述試劑盒中的溶液6. 2 μ 1，再加入滅菌超純水至 總體積25 μ 1 ；將以上各組分加入至0. 2mL PCR反應(yīng)管中，混勻，5000r/min，離心IOs ；然后 按下列參數(shù)進行PCR擴增預(yù)變性94°C，3min；進入循環(huán)94°C變性60s，60°C退火60s，72°C延伸60s，35次循環(huán)；終止延伸72°C，7min；4°C保存反應(yīng)產(chǎn)物。3、結(jié)果判斷以IOObp marker為對比，在目標片段大小處出現(xiàn)特異性擴增條帶為陽性，沒有特 異性擴增條帶為陰性。實施例2特異性實驗采用實施例1的含有特異性引物的檢測試劑盒及檢測方法檢測虎源性、豹源性DNA樣品。同時檢測獅、熊、牛等其它動物DNA樣品，以對方法的特異性進行評估。檢測結(jié)果虎、豹物種特異性檢測結(jié)果的PCR電泳圖譜如圖1所示，圖1中1. H2O, 2.東北虎血，3.東北虎肉，4.印支虎血，5.孟加拉虎血，6.金錢豹血，7.雪豹血，8.亞洲獅 血，9.東非獅血，10.黑熊血，11.牛骨粉，12.羊骨粉，13.豬骨粉，14.驢骨粉，15.兔骨粉， 16.鹿骨粉，17.馬骨粉，18.狗骨粉。試驗結(jié)果顯示，虎、豹物種中東北虎亞種的血液、肌肉 組織DNA樣本，印支虎亞種、孟加拉虎亞種和豹種中金錢豹、雪豹血液DNA樣本經(jīng)過PCR擴 增，得到陽性擴增結(jié)果。而獅、熊的3種血液DNA樣本，牛、羊、馬、豬、狗、兔、驢、鹿等8種哺 乳動物骨粉DNA樣本以及空白水對照的檢測結(jié)果均為陰性結(jié)果。上述結(jié)果表明試驗所設(shè) 計引物為虎、豹DNA的特異性擴增引物，而且對來自于不同個體和不同組織的DNA具有同樣 的擴增效果。實施例3靈敏度實驗 對于提取的東北虎血液DNA和金錢豹血液DNA模板，采用紫外分光光度計檢測其 濃度和純度。用TE溶液調(diào)整初始濃度至lOOng/yL，并進行10倍梯度稀釋，濃度分別為 IOng/ μ L，lng/ μ L，IOOpg/ μ L，IOpg/ μ L和lpg/ μ L。不同濃度的模板經(jīng)PCR反應(yīng)，確定其 檢測的靈敏度。按照PCR反應(yīng)條件進行試驗，東北虎血液DNA檢測結(jié)果如圖2所示，圖2中
1.IOOng/ μ L 虎血 DNA，2. IOng/ μ L 虎血 DNA，3. Ing/ μ L 虎血 DNA，4. IOOpg/ μ L 虎血 DNA， 5. IOpg/μ L虎血DNA，6. Ipg/μ L虎血DNA，7. 0.讓8/^1^虎血0嫩。試驗結(jié)果顯示，可在 IOOng/ μ L，IOng/ μ L，lng/ μ L，IOOpg/ μ L，IOpg/ μ L 東北虎血液 DNA 模板中檢測出特異性 的PCR擴增條帶。金錢豹血液DNA檢測結(jié)果如圖3所示，圖3中1. IOOng/μ L豹血DNA，
2.IOng/ μ L 豹血 DNA，3. Ing/ μ L 豹血 DNA，4. IOOpg/ μ L 豹血 DNA，5. IOpg/ μ L 豹血 DNA。實 驗結(jié)果顯示，可在 IOOng/ μ L，IOng/ μ L，lng/ μ L，IOOpg/ μ L，IOpg/ μ L 金錢豹血液 DNA 模 板中檢測出特異性的PCR擴增條帶。上述結(jié)果表明本試驗設(shè)計的特異性PCR引物可以檢 測出IOpg/μ L含量的虎源性成分和豹源性成分。
權(quán)利要求
虎源性、豹源性DNA的PCR檢測引物，其特征在于引物序列正向引物(SEQ ID NO.1)5’GAATATACTATGGCTCCTACAC 3’，反向引物(SEQ ID NO.2)5’GGTTGGCGGGGATGTAGTTA 3’。
2.虎源性、豹源性DNA的PCR檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒中包括一種檢測溶液， 該檢測溶液中含10XPCR緩沖液、10iimol/L正向引物、10iimol/L反向引物、10m mol/L dNTP、5U/ u L Taq DNA 聚合酶；其中，所述的正向引物序列為SEQ ID NO. 1，反向引物序列為SEQ ID NO. 2。
3.虎源性、豹源性DNA的PCR檢測方法，其特征在于使用權(quán)利要求2所述的試劑盒，包 括如下步驟①提取待測樣品DNA，得到模板DNA溶液；②反應(yīng)體系取1Pi步驟①制得的模板DNA溶液，加入上述試劑盒中的溶液6. 2 iU， 再加入滅菌超純水至總體積25 ill ；將以上各組分加入至0.2mL PCR反應(yīng)管中，混勻， 5000r/min，離心 10s ；③步驟②的反應(yīng)體系按下述條件進行實時熒光PCR檢測預(yù)變性:94°C,3min ；進入循環(huán)94°C變性60s，66°C退火60s，72°C延伸60s，35次循環(huán)；終止延伸:72°C,7min ；4°C保存反應(yīng)產(chǎn)物。
全文摘要
虎源性、豹源性DNA的PCR檢測引物、試劑盒及檢測方法，本發(fā)明建立了普通PCR檢測對虎源性、豹源性DNA的檢測引物、試劑盒以及檢測方法。引物序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；基于此，本發(fā)明公開了包含上述引物的虎源性、豹源性DNA的普通PCR檢測試劑盒及相應(yīng)檢測方法。本發(fā)明的引物特異性強，檢測試劑盒及方法簡便易用，結(jié)果準確，具有很高的特異性和靈敏度。
文檔編號C12N15/11GK101845508SQ201010202970
公開日2010年9月29日 申請日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者徐君怡, 曹際娟 申請人:徐君怡;曹際娟