專利名稱：提供作物廣譜病毒抗性的包含木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶基因的基因轉(zhuǎn)移載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于提供植物對于病毒的抗性的重組載體，其包含木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶基因(Papaya ringspot virus helper-componentprotease gene，PRSV HC-Pro gene)的編碼序列片段。本發(fā)明也涉及一種重組微生物。本發(fā)明也涉及一種用于使植物對病毒具有抗性的方法。本發(fā)明也涉及輔助組分蛋白酶的全長基因或其基因片段用于制造對病毒具有抗性的植物的用途。
背景技術(shù)：
木瓜(Carica papaya L.)為具有高度經(jīng)濟價值的作物，其病毒病害并無藥劑可以治療，近年來由于植物組織培養(yǎng)技術(shù)的提高，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的突破，加上病原誘導(dǎo)抗性理論(pathogen-derived resistance，PDR) (Sanford andjohnson 1985)的啟不，將病毒基因組的一部分轉(zhuǎn)移至宿主植物染色體內(nèi)，已達到抗病毒感染的目的，已成為目前熱門的方法。Fitch等人(Fitch et al. ,1992)首先將I3RSV夏威夷分離株的CP基因以微粒轟擊 (microprojectilebombardment)的方式轉(zhuǎn)入木瓜中，但他們的轉(zhuǎn)基因木瓜對于臺灣系統(tǒng)的 I3RSV永康分離株( isolate)不具抗性，其依賴序列同源性的抗性成為此轉(zhuǎn)基因木瓜在其他地區(qū)應(yīng)用的限制因素。申請人:以前將臺灣I3RSV (分離株的外殼蛋白(coat protein,CP)基因以農(nóng)桿菌 (Agrobacterium sp.)轉(zhuǎn)移方式獲得轉(zhuǎn)基因木瓜株系(Cheng，1996)，經(jīng)攻擊接種、分析后， 證明這些轉(zhuǎn)基因木瓜株系除了對臺灣I3RSWK具有良好抗性外，對其他不同地區(qū)較疏遠的 I3RSV病毒如夏威夷(HA)、墨西哥(MX)及泰國(TH)分離株也均有良好的抗性(Bau et al.， 2003)。顯示I的外殼蛋白轉(zhuǎn)基因木瓜對于I3RSV提供很高程度的抗性(Bau et al. 2004)。 現(xiàn)有技術(shù)借助對外殼蛋白轉(zhuǎn)基因木瓜的應(yīng)用，雖然可得到抗病的轉(zhuǎn)基因植物，其抗性原理為轉(zhuǎn)移的CP基因激發(fā)木瓜防御反應(yīng)作用的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)，使得木瓜產(chǎn)生分解入侵的I3RSVRNA基因組的能力，而具有病毒抗性。但此原理有序列同源性專一性問題，對于CP基因較疏遠的rasv不具抗性，這種病毒株系專一性抗性的缺點仍是普遍存在的問題(Tennant et al. 2001)，因此由不同株系病毒的外殼蛋白轉(zhuǎn)基因植物僅具有區(qū)域性的應(yīng)用價值。申請人:的研究團隊利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)(Agrobacterium-mediated)的手段，將臺灣 PRSV 系統(tǒng)的外殼蛋白基因?qū)肽竟衔闯墒炫咧?Cheng et al. 1996)，得到對I3RSV具不同程度抗性的株系，并且篩選出數(shù)個株系除了對本土的觀系統(tǒng)具良好抗性外，還對源自于夏威夷(HA)、泰國(TH)及墨西哥(MX)等不同地域的病毒均有良好的抗性(Bau et al. 2003)。所得到的I3RSVYK系統(tǒng)的外殼蛋白轉(zhuǎn)基因木瓜株系經(jīng)田間試驗證實對于I3RSV提供很高程度的抗性(Bau et al. 2004)。申請人:于rasv (系統(tǒng)的外殼蛋白轉(zhuǎn)基因木瓜的田間試驗期間發(fā)現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) PRSV (外殼蛋白轉(zhuǎn)基因木瓜會被超強的木瓜環(huán)斑病毒株擊垮，而探討其可擊垮由外殼蛋白基因介導(dǎo)的抗性的原因為病毒蛋白輔助組分蛋白酶(helper-component protease, HC-Pro)造成。HC-Pro為基因沉默阻抑物(suppressor)，其具有抑制轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用的能力(Anadalakshmi et al.，1998 ；Brigneti et al.，1998 ；Shi et al.，1997)，申請人推測I3RSV 5-19的HC-Pro的抑制基因沉默的能力超強，可使得I3RSV YK CP轉(zhuǎn)基因木瓜的基因沉默機制被5-19HC-Pro所抑制，而無法發(fā)揮作用，從而使得轉(zhuǎn)基因木瓜的抗性被抑制而失效?；趩为氁酝鈿さ鞍谆騺硖峁┛剐砸巡蛔阋詫Ω冻瑥姴《局晗?super virus strain)的事實，本技術(shù)領(lǐng)域特發(fā)展出對付超強病毒的新的轉(zhuǎn)基因策略。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的外殼蛋白轉(zhuǎn)基因植物對病毒的抗性為同源性依賴的抗性 (homology-dependent resistance)，因為此抗性會被攜有超強基因沉默抑制物HC-Pro的超強病毒株系擊垮的問題尚未解決，本發(fā)明的目的在于提供一種基因轉(zhuǎn)移載體及其應(yīng)用， 以木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白(HC-Pro)為靶基因，利用非翻譯性構(gòu)建策略將HC-Pro基因構(gòu)建于二元載體，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物可激發(fā)針對基因沉默抑制物HC-Pro基因的轉(zhuǎn)錄后沉默作用(PTGS)，將病毒保護自己對抗宿主防御反應(yīng)的最重要基因瓦解，如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物會具有廣譜抗病毒株系的特性，也就是具有能夠抵抗不同地理區(qū)域、不同系統(tǒng)的病毒的能力，并可解決田間超強I3RSV病毒株擊垮外殼蛋白轉(zhuǎn)基因木瓜應(yīng)用的問題。發(fā)明簡述為了達到上述目的，在一方面，本發(fā)明提供了一種用于提供植物對病毒的抗性的重組載體，其包含控制序列以及與該控制序列可操縱連接的木瓜環(huán)斑病毒(Papaya ringspot virus, PRSV)輔助組分蛋白酶基因的編碼序列片段。另一方面，本發(fā)明提供了一種重組微生物，其是用如前所述的重組載體轉(zhuǎn)化微生物所制得的。又一方面，本發(fā)明提供了一種用于使植物對病毒具有抗性的方法，其包含下列步驟將如前所述的重組載體轉(zhuǎn)移至植物內(nèi)，以令該植物以非翻譯性表達該重組載體的木瓜環(huán)斑病毒的輔助組分蛋白酶基因的編碼序列片段的轉(zhuǎn)錄物，但不表達輔助組分蛋白酶，借助RNA介導(dǎo)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用(PTGS)使該植物產(chǎn)生對于病毒的抗性。又一方面，本發(fā)明提供了一種植物細(xì)胞，其基因組中插入了選自于下列組中的核酸分子具有與SEQ ID NO :5具有85%以上同源性的核酸序列、與SEQ ID NO :6具有85% 以上同源性的核酸序列以及SEQ ID NO :7所示序列具有85%以上同源性的核酸序列。再一方面，本發(fā)明提供了一種木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶的全長基因或其基因片段用于制造對病毒具有抗性的植物的用途?；谏鲜鰞?nèi)容，本發(fā)明是以HC-Pro基因為靶基因來攻擊病毒HC-Pro基因的策略， 提供植物對于不同株系病毒的廣譜抗性，解決非依賴同源性抗性的問題，從而使產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物具有跨地理區(qū)域性的應(yīng)用價值。實施方案發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明的用于提供植物對于病毒的抗性的重組載體，其包含控制序列以及與該控制序列可操縱連接的木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶基因的編碼序列片段。
依據(jù)本發(fā)明，木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶為基因沉默阻抑物，其具有抑制轉(zhuǎn)錄后基因沉默的能力(Anadalakshmi et al. , 1998 ；Brigneti et al. , 1998 ；Shi et al.， 1997)。依據(jù)本發(fā)明，該木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶基因的編碼序列片段可以任何方法將該編碼序列片段構(gòu)建于質(zhì)粒中使其不表達蛋白質(zhì)，例如但不限于使該編碼序列片段位于該控制序列下游，且該木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶基因的編碼序列片段的5’端為具有至少一個終止密碼子；優(yōu)選具有多個終止密碼子；更優(yōu)選具有兩個連續(xù)的終止密碼子。依據(jù)本發(fā)明，木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶基因的編碼序列片段具有如SEQ ID NO 8所示序列。依據(jù)本發(fā)明，如此處使用的術(shù)語“可操縱連接”意指基因的表達是由空間上相連接的控制序列所控制。所述的控制序列可以位于該基因的5’端(上游)或3’端(下游)而使該基因受所述的控制序列所控制。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，該距離可以在不影響控制序列功能的條件下作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。依據(jù)本發(fā)明，所述的“編碼序列”意指基因中會被轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)且會被翻譯成蛋白質(zhì)的區(qū)域，因此所述的“編碼序列片段”意指前述區(qū)域的全長或片段。依據(jù)本發(fā)明，如本文所使用的術(shù)語“同源性”在本文中定義為兩個序列之間相關(guān)聯(lián)的程度，其可以序列間相同的比率來決定。術(shù)語“控制序列”如本文所使用，指一種能使基因或其片段啟動或關(guān)閉，從而影響該基因或其片段的表達的序列；例如該控制序列可為啟動子或終止子。依據(jù)本發(fā)明，其中該控制序列可以是任何適用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因HC-Pro表達的啟動子，例如但不限于35S啟動子。該控制序列可以是任何于植物中表達的啟動子，例如但不限于來自花椰菜花葉病毒35S啟動子(Cauliflower mosaic virus 35S promoter, CaMV 35S promoter)。依據(jù)本發(fā)明，該編碼序列片段可以以任何可造成該編碼序列片段不表達蛋白質(zhì)的方法進行修飾，優(yōu)選但不限于在其5’端插入有至少一個終止密碼子或含有讀框移位。依據(jù)本發(fā)明，該編碼序列片段優(yōu)選具有選自于由下列所構(gòu)成的組(i)與SEQ ID NO :5所示序列具有85%以上的同源性的核苷酸序列；(ii)與SEQID NO :6所示序列具有 85%以上的同源性的核苷酸序列；以及(iii)與SEQID NO :7所示序列具有85%以上的同源性的核苷酸序列。依據(jù)本發(fā)明，前述的重組載體除了上述控制序列外，還含有抗藥性基因，該抗藥性基因為任何抗生素基因或篩選性基因，例如但不限于npt II基因的卡那霉素的抗藥性基因。依據(jù)本發(fā)明，所述的重組載體可由任何二元載體(binary vector)借助基因工程技術(shù)插入木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶基因的編碼序列片段而得，該二元載體包括在任何植物中會表達的啟動子或終止子，例如但不限于PBI121及其衍生的載體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，該二元載體為一種被用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的克隆載體，其具有可以于大腸桿菌 (Escherichia coli)以及根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中復(fù)制的能力，其具有CaMV 35S啟動子及Nos終止子，該編碼序列片段優(yōu)選位于該二元載體的CaMV 35S啟動子及Nos終止子之間。
在本發(fā)明的重組載體的一個優(yōu)選的具體實例中，該用于提供植物對病毒的抗性的重組載體為PBI-519HCF，其以轉(zhuǎn)移于宿主的形式保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號 CCTCC M 2010112。在本發(fā)明的該重組載體的另一優(yōu)選的具體實例中，用于提供植物對于病毒的抗性的重組載體為PBI-519HCN或pBI-519HCC，其可以以pBI_519HCF為模板以基因工程技術(shù)如使用引物對 519HC^topA(SEQ IDNO :1)與 519HC&icA(SEQ ID NO :3);或引物對 519HCStopB(SEQ ID NO 4) % 519HCSacB (SEQ ID NO :2)，借助聚合酶鏈反應(yīng)以及一般克隆技術(shù)而得；或者以PBI-519HCF為基礎(chǔ)利用限制酶酶切以及克隆而得。本發(fā)明的一種重組微生物，其是用如前所述的重組載體轉(zhuǎn)化微生物所制得， 其中該微生物優(yōu)選為細(xì)菌，以及更優(yōu)選為去毒的根瘤農(nóng)桿菌(disarmedAgrobacterium tumefaciens)0依據(jù)本發(fā)明，所述去毒的根瘤農(nóng)桿菌意指具有轉(zhuǎn)移能力基因(vir genes)及 T-DNA，但不具有農(nóng)桿菌的致癌基因(oncogenes)的根瘤農(nóng)桿菌。本發(fā)明的一種用于使植物對病毒具有抗性的方法，其包含下列步驟將如前所述的重組載體轉(zhuǎn)移至植物內(nèi)，以使該植物非翻譯性表達該重組載體的木瓜環(huán)斑病毒的輔助組分蛋白酶基因的編碼序列片段的轉(zhuǎn)錄物，但不表達輔助組分蛋白酶，從而使該植物產(chǎn)生對于病毒的抗性。依據(jù)本發(fā)明，如此處所使用的術(shù)語“導(dǎo)入”以及“轉(zhuǎn)移”交替地被使用，意指將核苷酸片段、載體及其類似物以各種任何已知的轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入組織細(xì)胞中。依據(jù)本發(fā)明，所述的將如前所述的重組載體轉(zhuǎn)移至植物內(nèi)的步驟，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可借助例如但不限于農(nóng)桿菌、微粒轟擊、電穿孔法、微注射法以及超聲波法。依據(jù)本發(fā)明，所述的“非翻譯性表達”意指利用任何手段使基因表達僅止于基因翻譯階段前，即沒有表達完整蛋白質(zhì)，因此所述的手段包括使該編碼序列片段為讀框移位以及插入終止密碼子，其只會產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄物但不產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的蛋白，但轉(zhuǎn)錄物會因“轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用”而分解成小干撓RNA(small-interfering RNA, siRNA)，因此所得的具有病毒抗性的株系測不到轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄物，但有大量小片段siRNA產(chǎn)生。依據(jù)本發(fā)明，所述的植物是源自于選自下列所構(gòu)成的組的植物葫蘆科 (Cucurbitaceae)以及番木瓜科(Caricaceae)植物。優(yōu)選所述的植物是源自于木瓜 (Caricapapaya L.)，包括其根、莖、葉部以及胚。依據(jù)本發(fā)明，將如前所述的重組載體轉(zhuǎn)移至植物內(nèi)的步驟包括將該重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，以獲得重組農(nóng)桿菌；以及以該重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染至該植物，以獲得帶有該編碼序列片段的植物。本發(fā)明的一種木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶基因的全長或其基因片段用于制造對病毒具有抗性的植物的用途。優(yōu)選所述的全長基因具有如SEQ ID NO :8所示序列。更優(yōu)選所述的全長基因或其基因片段為選自于具有由下列所構(gòu)成的組的核苷酸序列(i)與SEQ ID NO :5所示序列具有85%以上的同源性的核苷酸序列；(ii)與SEQ IDNO :6所示序列具有85%以上的同源性的核苷酸序列；以及(iii)與SEQ IDNO :7所示序列具有85%以上的同源性的核苷酸序列。
優(yōu)選本發(fā)明的用途包括將含有該木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶的全長基因或其基因片段的非翻譯性構(gòu)建體導(dǎo)入植物。依據(jù)本發(fā)明，所述的非翻譯性構(gòu)建體衍生自于將該木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶的全長基因或其基因片段克隆至該表達載體內(nèi)，但其不表達木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白。 非翻譯性構(gòu)建體可能借助RNA的表達，而利用植物本身基因沉默的機制，以達到抑制與木瓜環(huán)斑病毒具有實質(zhì)性相同的輔助組分蛋白的病毒的目的。所述的非翻譯性構(gòu)建體優(yōu)選是插入有終止密碼子以及含有讀框移位的木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白的全長基因或其基因片段的二元載體。本發(fā)明的一種重組植物細(xì)胞，其基因組中插入有選自于下列組中的核酸分子具有與SEQ ID NO :5所示序列具有85%以上同源性的核酸序列、SEQ ID NO :6所示序列具有 85%以上同源性的核酸序列以及SEQ ID NO :7所示序列具有85%以上同源性的核酸序列的核酸分子；更優(yōu)選其基因組中插入有選自于下列組中的核酸分子具有與SEQ ID NO 5 所示序列具有90%以上同源性的核酸序列、與SEQ ID NO :6所示序列具有90%以上同源性的核酸序列以及與SEQ ID NO :7所示序列具有90%以上同源性的核酸序列的核酸分子。優(yōu)選該重組植物細(xì)胞是通過將如前所述的重組載體或如前所述的重組微生物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞所制得。更優(yōu)選該植物細(xì)胞源自于植物愈傷組織及體細(xì)胞胚。附圖簡述

圖1為raSV 5-19的輔助組分蛋白HC-Pro的全長及部分基因以非翻譯方式構(gòu)建成 pBI-519HCF，pBI_519HCN 及 pBI_519HCC 的簡易圖譜。圖2為高抗性5-19HC-Pro轉(zhuǎn)基因木瓜品系F3-2-2對PRSV 5-19及PRSV YK抗性情形的比較圖。圖3顯示以DNA印跡法分析轉(zhuǎn)基因木瓜轉(zhuǎn)基因插入拷貝數(shù)的凝膠電泳圖。圖4顯示以RNA印跡法分析轉(zhuǎn)基因木瓜的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄物(mRNA)及siRNA表達量的凝膠電泳圖。圖5A至D顯示不同地區(qū)I3RSV的HC-Pro核酸序列比對圖，其中「…」代表其與I3RSV 5-19的HC-Pro序列相同區(qū)域。
實施例本發(fā)明將進一步借助下面的實施例來作說明，但應(yīng)了解的是這些實施例僅做為說明的用途，而不應(yīng)被視為本發(fā)明的實施上的限制。實施例1.輔助組分蛋白HC-Pro基因的非翻譯性構(gòu)建體的制備PRSV 5-19 的 HC-Pro 基因(SEQ ID NO 8)經(jīng) RT-PCR 擴增后構(gòu)建于 pCRII -TOPO 載體(Invitrogen)，以非翻譯性方式構(gòu)建，設(shè)計一組特異性引物519H CStopA(5‘ -CGCATGAACATGCTCTAGATGAACGATTGATGAGAAAAATTTCTG-3' )(SEQ ID NO: 1)及 519HCSacB(5' -GTGGTTGGATCAAAGAGCTCACCGACAATGTAGTGTTTCATTTC-3‘ )(SEQ ID NO 2), 上游引物(519HCMOPA)上設(shè)計兩個終止密碼子(TGATGA)JbaI酶切位點(TCTAGA)并多加一個堿基(T)使整個蛋白讀框移位，下游引物(519HC&1CB)設(shè)計McI酶切位點(CTCGAG)， 經(jīng)PCR擴增TOPO載體上的HC-Pro全長基因(1371bp后)多加一個堿基T為1372bp (SEQ ID NO :5)，利用XbaI及SacI限制酶酶切后載入以相同限制酶酶切的pBI121 (Clontech，CA)，
7最后得到非翻譯性構(gòu)建體“PBI-519HCF”，其是以轉(zhuǎn)移于宿主的形式保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2010112，如圖1所示，含有兩個終止密碼子(如**標(biāo)示處) 以及一個核苷酸T (粗體字)，所得構(gòu)建體經(jīng)測序及限制酶確認(rèn)無誤后備用。同樣設(shè)計一對特異性引物，上游引物為519HCM0pA(SEQ ID NO :1)，下游引物為 519HCSacA(5' -TTTGTGGAGAATATGAGCTCACCAATGGCAACCTTTCGAATG-3‘ )(SEQ ID NO 3)，以 PCR擴增HC-Pro基因N端750bp片段(亦為讀框移位的非翻譯性構(gòu)建體)，多加一個堿基T 為751bp (SEQ ID NO :6)，利用XbaI及SacI限制酶酶切后載入以相同限制酶酶切的pBI 121 載體，最后得到非翻譯性構(gòu)建體“PBI-519HCN”，如圖1所示，(含有兩個終止密碼子(如# 標(biāo)示處)及一個核苷酸T (粗體)，所得構(gòu)建體經(jīng)測序及限制酶確認(rèn)無誤后備用。同樣設(shè)計一對特異性引物，上游引物為519HC^topB(5' -GACAGAAATGGGCTCTAGAT GTGGGGTGAATGATGATATCATCGCCAAAAG) (SEQ ID NO :4)，下游引物為519HC&icB (SEQ ID NO: 2)，上游引物(519H(^topB)上設(shè)計兩個終止密碼子(TGATGA)、)(bal酶切位點(TCTAGA) 并多加一個堿基(T)使整個蛋白的讀框移位，以PCR擴增HC-Pro基因C端750bp片段 (亦為讀框移位的非翻譯性構(gòu)建體)，多加一個堿基T為751bp (SEQ ID NO :7)，利用XbaI 及Mel限制酶酶切后載入以相同的限制酶酶切的PBI121載體，得到非翻譯性構(gòu)建體 “pBI-519HCC”(含有兩個終止密碼子(如**標(biāo)示處)及一個核苷酸T (粗體字)，所得構(gòu)建體經(jīng)測序及限制酶確認(rèn)無誤后備用。將前述包含rasv 5-19的HC-Pr0全長基因、N端及C端的非翻譯性構(gòu)建體分別以電穿孑L方式轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404) (Invitrogen)中，所得的轉(zhuǎn)基因后的農(nóng)桿菌含有非翻譯性嵌合體，而可在木瓜轉(zhuǎn)基因中使用。實施例2.轉(zhuǎn)基因木瓜的制備為了縮短轉(zhuǎn)移及篩選的時間，利用申請人實驗室近年所發(fā)展出的一套快速的木瓜轉(zhuǎn)基因方法(Kimg et al.，2009)，其利用田間已知優(yōu)良性狀的木瓜，切取其頂芽，在實驗室組織培養(yǎng)系統(tǒng)進行木瓜瓶苗繁殖。在含有0. 02mg/l α -萘乙酸以及0. 2mg/l芐基氨基嘌呤的穆拉許給-史酷格培養(yǎng)基(Murashige-Skoog medium containing 0. 02mg/ 1 α -naphthaleneacetic acid andO. 2mg/l benzylaminopurine, MSNB) Ja ff M M Si 后，移至含吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培養(yǎng)基，經(jīng)暗培養(yǎng)一個星期后誘導(dǎo)根原基發(fā)生，此時處于根誘導(dǎo)時期(root induction period)[具植物生長激素依賴性(Auxin d印endent)]，再移至含1/2體積的MS的珍珠石中使根發(fā)展延長，此時處于根發(fā)展時期 (Root development period)[與植物生長激素?zé)o關(guān)(Auxin ind印endent)]，兩個星期后， 切取其根尖，在含lmg/1的2，4-二氯苯氧乙酸與0. lmg/1的6-芐基氨基嘌呤的MS固體培養(yǎng)基(Murashige-Skoog medium containing lmg/12,4-dichlorophenoxyacetic acid 與 0. lmg/1 benzylaminopurine，MSDB培養(yǎng)基)中誘導(dǎo)愈傷組織及體細(xì)胞胚產(chǎn)生。以此方法獲得木瓜體細(xì)胞胚。在下列實施例中，以日升品種木瓜不定根發(fā)展的體細(xì)胞胚當(dāng)作轉(zhuǎn)基因材料，于無菌水中加入金剛砂經(jīng)震蕩一分鐘使體細(xì)胞胚產(chǎn)生傷口(Cheng etal.，1996)，加入帶有前述不同構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌進行混合后靜置5分鐘，在含5mg/l的2，4- 二氯苯氧乙酸 (2-4D)的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)2天，再以無菌水漂洗農(nóng)桿菌，將體細(xì)胞胚移于含500mg/l羧芐青霉素(carbenicillin)及5mg/l的2-4D的培養(yǎng)基中，經(jīng)兩個星期后再加入50mg/l卡那霉素以篩選轉(zhuǎn)化成功的株系。再經(jīng)100mg/l卡那霉素篩選兩個月后，去除卡那霉素休養(yǎng)一個月，使轉(zhuǎn)化成功的體細(xì)胞胚能恢復(fù)原有的再生能力。移至含50mg/l卡那霉素的MSNB培養(yǎng)基中使其發(fā)芽，取得「擬轉(zhuǎn)基因植株」。實施例3.聚合酶鏈反應(yīng)檢測擬轉(zhuǎn)基因植物提取擬轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA作為模板，并以前述所得的pBI-HCF、pBI-HCN及 pBI-HCC構(gòu)建體做為陽性對照組，使用根據(jù)靶基因HC-Pro序列所設(shè)計出的特異性引物對， 其包括 519H(^topA/519HCSacB、519H(^topA/519HCSacA 及 519H(^topB/519HCSacB 弓丨物對， 分別對HC-Pro全長基因、N端片段及C端片段進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增。另一方面， 以引物對 nptll 5，引物 5' -CCCCTCGGTATCCAATTAGAG-3‘ (SEQID NO 9)及 nptll 3，引物 5‘ -CTGGAGTTCTTCGCCA-3‘ (SEQ ID NO 10)擴增 nptll 基因，并以凝膠電泳分析 PCR 產(chǎn)物。依據(jù)凝膠電泳結(jié)果分析，以前述PCR方式擴增出預(yù)期片段的為轉(zhuǎn)化成功的植株。結(jié)果確認(rèn)已轉(zhuǎn)入HC-Pro全長基因的有15個株系、轉(zhuǎn)入HC-Pro N片段基因的有31個株系以及轉(zhuǎn)入HC-Pro C片段基因的有14個株系。實施例4.轉(zhuǎn)基因木瓜溫室抗病毒能力的評估將轉(zhuǎn)化成功的60個株系植株經(jīng)微體大量繁殖后，進行溫室病毒抗性評估試驗，同一株系分別以機械接種超強病原性的I3RSV 5-19分離株及I3RSVYK分離株，接種7個星期后，選出無病征發(fā)展且抗性良好的株系，其中轉(zhuǎn)基因木瓜對病毒抗感病反應(yīng)分為三種(1)易感株系(Susceptible lines, S)接種14天后有嚴(yán)重花葉病征為易感株系。(2)延遲抗性株系(delayed-type resistant line, DR)比對照組非轉(zhuǎn)基因木瓜 (non-transgenic papaya plants, NT)具有1至2個星期延遲病征者為延遲抗性株系。(3)高抗性株系(highly resistant line, HR)在接種觀天后無病征發(fā)生為高抗性株系。圖2示出前述所得的60個轉(zhuǎn)基因株系中的部分株系分別于溫室中接種I3RSV 5-19 及I5RSWK病毒四星期后的病征發(fā)展情形，所述的部分株系包括一高抗株系F3-2-2及一易感株系F3-12-1以及18-2-4 UK-CP轉(zhuǎn)基因株系)及非轉(zhuǎn)基因木瓜(NT)，其中A區(qū)顯示 F3-2-2、F3-12-1、18-2-4 (I-CP轉(zhuǎn)基因株系)及非轉(zhuǎn)基因木瓜(NT)經(jīng)接種I3RSV 5-19病毒株的病征，其中對照組NT具有嚴(yán)重萎蔫型的病征(圖2的A區(qū)-a列，以下標(biāo)記為A-a， 其余同理類推)，另一對照組I3RSV YK-CP轉(zhuǎn)基因植株18-2-4也產(chǎn)生嚴(yán)重花葉型病征(圖2 的A-b)，而對照組18-2-4接種PRSV YK具有良好抗性(圖2的Β-b)。前述所得的60個株系中經(jīng)評估所得的結(jié)果如表一所示，其中有31個轉(zhuǎn)基因株系 (包括4個pBI-519HCF轉(zhuǎn)基因株系、20個pBI_519HCN轉(zhuǎn)基因株系以及7個pBI_519HCC轉(zhuǎn)基因株系)產(chǎn)生花葉病征。該60個株系中，有31個轉(zhuǎn)基因株系對于I3RSV 5-19是易感株系(S)，如 F3-12-1 (如圖2的A-c所示)，而該31個株系中有30個株系對I3RSV YK易感(S)，因而產(chǎn)生與NT —樣花葉型病征(如圖2的B-a以及-C所示)，另1個株系N10-3-1對I3RSV 5-19 為易感株系(S)，但對于I3RSV (具有延遲抗性，為延遲抗性株系(DR)。該60個株系中，有10個轉(zhuǎn)基因株系對于I3RSV 5-19具有抗性，其中7個株系對 PRSV YK為延遲抗性株系(DR)，然而另外3個株系對I3RSV YK則為高抗性株系(HR)。該60個株系中，其他19個株系在接種rasv 5-19及rasv (后皆沒有病征產(chǎn)生(圖2的A-d及圖2的B-d)，為高抗性株系0 )。進一步對前述株系進行接種病毒，接種后7周，共23個品系對I3RSV (均無病征產(chǎn)生，而其中有19個品系同時對5-19也無病征產(chǎn)生。如表一所示，15個pBI-5-19HCF轉(zhuǎn)基因木瓜株系有7個株系對5_19及I具高度抗性，抗病比為46. 6 %，31個pBI-5-19HCN轉(zhuǎn)基因木瓜株系有9個株系對此兩種病毒具高度抗性，抗病比為四％，14個pBI-5-19HCN轉(zhuǎn)基因木瓜株系有3個株系對此兩種病毒具高度抗性，抗病比為21. 4%，基于上述結(jié)果可見，三種構(gòu)建體均能提供木瓜抗木瓜環(huán)斑病毒超強病毒株I3RSV 5-19及典型病毒株I3RSV YK的抗性。表一 5-19HC-Pro轉(zhuǎn)基因木瓜對PRSV 5-19及PRSV YK的抗性分析
構(gòu)建體受測株系數(shù)目對于病毒的抗性aPRSV 5-19PRSV YKHRcDRSHRDRSpBI-5 19HCF1 57(46.6)448d(53.3)34pBI-5 1 9HCN3 19(29.0)2201 1(35.5)119pBI-5 1 9HCC143(21.4)474(28.6)37總計6019(3 1.6)103 123(36.7)730PRSV-YKb5005500NTd5005005YBI-519HCF、pBI-519HCN 及 pBI-519HCC 三個構(gòu)建體分別得到 15、31、14 個株系木瓜，每個株系五棵木瓜植株分別以I3RSV 5-19及rasv YK機械接種，在接種后28天記錄結(jié)^ οb以非轉(zhuǎn)基因木瓜(NT)及另一 I3RSV (外殼蛋白轉(zhuǎn)基因木瓜植株18-2-4 (Bau et al. ,2003)當(dāng)作對照組，此株系對于I3RSV (具有高度抗性但對I3RSV 5_19易感。e轉(zhuǎn)基因木瓜株系攻擊接種PRSV 5-19或I3RSV 的結(jié)果，接種14天后有嚴(yán)重花葉病征為易感株系(susceptible lines，S)，比對照組(NT)具有2個星期延遲病征的為延遲抗性株系(delayed-type line，DR)，而在接種觀天后均無病征發(fā)生為高抗性株系(highly resistant line, HR)。d所有對raSV 5-19具有高度抗性的株系木瓜對于I3RSV YK均具有高度抗性。實施例5.間接酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以hh&Gonsalves的方法(Yeh and Gonsalves，1984)實施間接酶聯(lián)免疫吸附測定。從每一經(jīng)PRSV感染的木瓜株系的葉片獲取葉部組織，收集接種后42天的材料并以包被緩沖液(coating buffer)(含有0. 01 %疊氮化鈉的50mM碳酸納緩沖液稀釋100倍，并加入 ELISA 96孔板，于37°C反應(yīng)1小時，使抗原附著于板上，并以稀釋2000倍的抗I3RSV CP的兔多克隆抗血清(Yeh et al. , 1984)反應(yīng)，進行間接酶聯(lián)免疫吸附測定分析。將堿性磷酸酶綴合的山羊抗兔 IgG (Alkaline Phosphatase-conjugated Goat anti-rabbitimmunoglobulin G, AP-Goat anti-rabbit Ig G) (KPL, Inc.，Gaithersburg, MD, USA)稀釋 5000 倍后作為第二抗體以檢測兔抗體。在加入堿性磷酸酶底物(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA)顯色，以酶標(biāo)儀(SLT LaWnstruments，Salzburg, Austria)測量 405nm 的吸收光譜。將各株系的每一植株，以抗I3RSV的CP蛋白的多克隆抗體以ELISA分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高抗性的植株中并無法檢測到病毒的CP蛋白，讀數(shù)與健康植株相同，非轉(zhuǎn)基因木瓜接種I3RSV 5-19或I有兩倍以上的讀數(shù)。實施例6. DNA印跡法(Southern blotting)分析轉(zhuǎn)基因插入拷貝數(shù)選取對I5RSV 5-19及I3RSV YK具高抗性的16個轉(zhuǎn)基因木瓜株系，其中包含5個 PBI-519HCF株系，9個pBI_519HCN株系以及2個pBI_519HCC株系，并以下列方式進行轉(zhuǎn)基因插入拷貝數(shù)的分析。首先，以DNeasy Plant Mini kit ^jiagen，Valencia，CA，USA)提取具病毒抗性的轉(zhuǎn)基因木瓜的基因組DNA，以限制酶Ase I酶切后，以0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳分離 DNA,將凝膠經(jīng)緩沖液去嘌呤、解旋及酸堿中和，然后將凝膠上DNA轉(zhuǎn)移至Hybond-N+膜 (Amersham Phamacia Biotech, UK)，于UV燈下交聯(lián)5分鐘，在60 °C預(yù)雜交1小時，以 519HCStopA/519HCSacB 引物對擴增出 pBI_519HCF 的 HC-Pro 全長片段。取 25ng HC-Pro 全長片段，力口入以 Primer It II random primer labeling kit (Stratagene, Lajolla, CA, USA)制備的α-32PSEmrasv 5-19HC-Pr0基因的特異性探針，于60°C進行雜交反應(yīng)，經(jīng)漂洗后，將尼龍薄膜放入含增強隔板的自動顯影片夾(Hyperscreen ，Amersham Phamacia Biotech)以 X_ray 膠片(Hyperfilm MP, Amersham Phamacia Biotech, UK)于 _80°C曝光 48小時，比較抗性、易感品系轉(zhuǎn)基因插入拷貝數(shù)的差異。結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)基因插入拷貝數(shù)(copy No.)標(biāo)示于圖下，其中以非轉(zhuǎn)基因木瓜(NT)作對照組，所測植物中有四株系F2-l-4、F2-l-7、F3-2-2及Nll-I具有單一拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因插入，其他株系則為兩個拷貝數(shù)以上的轉(zhuǎn)基因插入。實施例7.抗木瓜環(huán)斑病毒能力分析將高抗性轉(zhuǎn)基因木瓜植株接種臺灣I3RSV不同株系(5-19及I)或其他不同地區(qū)的rasv，包括墨西哥(MX)、泰國(TH)及夏威夷(HA)分離株，經(jīng)HC-Pro及CP序列比對，篩選出具廣譜抗這些病毒的木瓜品系。參見表二以及圖5A至5D所示，這些病毒I、MX、TH、HA的HC-Pro基因與 5-19HC-Pro基因有86. 1至96. 8%的序列相同性，這些病毒CP基因與5-19CP基因則有89. 4 至95. 9%的序列相同性。所測植物為具有單一轉(zhuǎn)基因插入拷貝數(shù)的F2-l-4、F2-7-l、mi-l 及F3-2-2，并以NT及18-2-4作為對照組。在接種病毒14J8及42天后觀察其病征發(fā)展，結(jié)果如表三所示，NT接種不同株病毒于14天全部發(fā)病，18-2-4對I具高度抗性，對其他病毒株系如MX、TH及HA具延遲抗性， 但對5-19為易感性；F2-l-4、mi-l對 (及5_19具良好抗性，對其他病毒株系TH及HA具延遲性抗性，但對MX較為易感；而F3-2-2對所有病毒皆具非常良好的抗性，顯示以HC-Pro 作為靶基因可以達到對抗超強病毒株且能同時廣譜對抗其他木瓜環(huán)斑病毒的能力，包括只有86. 相同性的病毒。表二比較 PRSV 5-19 與其他地區(qū) PRSV 病毒株的 HC-Pro (up corner)及 CP (down corner)基因的核甘酸及氨基酸序列相同性及相似性
權(quán)利要求
1.一種用于提供植物對病毒的抗性的重組載體，其包含控制序列以及與該控制序列可操縱連接的木瓜環(huán)斑病毒(PRSV)輔助組分蛋白酶基因(HC-Pro基因)的編碼序列片段。
2.如權(quán)利要求1所述的重組載體，其包含具有所述控制序列的二元載體以及構(gòu)建于該二元載體中的所述編碼序列片段。
3.如權(quán)利要求1所述的重組載體，其中所述編碼序列片段具有與SEQIDN0:5所示序列具有85%以上的同源性的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的重組載體，其中所述編碼序列片段具有與SEQIDN0:6所示序列具有85%以上的同源性的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求1所述的重組載體，其中所述編碼序列片段具有與SEQIDN0:7所示序列具有85%以上的同源性的核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求1至5任一項所述的重組載體，其中所述木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶基因的編碼序列片段位于所述控制序列下游，且所述木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶基因的編碼序列片段的5’端具有至少一個終止密碼子。
7.如權(quán)利要求3所述的重組載體，其為pBI-519HCF，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏號為 CCTCC M 2010112。
8.如權(quán)利要求3所述的重組載體，其為pBI-519HCN或pBI_519HCC。
9.一種重組微生物，其是由將如權(quán)利要求1至8中任一項所述的重組載體轉(zhuǎn)化微生物中所制得的。
10.如權(quán)利要求9所述的重組微生物，其中所述微生物為去毒(disarmed)的根瘤農(nóng)桿菌。
11.一種用于使植物對病毒具有抗性的方法，其包含下列步驟將如權(quán)利要求1至8中任一項所述的重組載體轉(zhuǎn)移至植物內(nèi)，以使該植物非翻譯性表達該重組載體的木瓜環(huán)斑病毒的輔助組分蛋白酶基因的編碼序列片段的轉(zhuǎn)錄物，但不表達輔助組分蛋白酶，從而使該植物產(chǎn)生對于病毒的抗性。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述植物選自于下列植物所構(gòu)成的組葫蘆科 (Cucurbitaceae)以及番木瓜科(Caricaceae)植物。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述將如權(quán)利要求1至8中任一項所述的重組載體轉(zhuǎn)移至植物內(nèi)的步驟包括將該重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，以取得重組農(nóng)桿菌；以及以該重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染所述植物， 以取得帶有該編碼序列片段的植物。
14.一種木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶的全長基因或其基因片段用于制造對病毒具有抗性的植物的用途，其中該木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶的全長基因具有如SEQ ID NO 8 所示序列。
15.如權(quán)利要求14所述的用途，其包括將含有該木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶的全長基因或其基因片段的非翻譯性構(gòu)建體導(dǎo)入至植物。
16.一種重組植物細(xì)胞，其基因組中插入有選自于下列組中的核酸分子具有與SEQ ID NO 5所示序列具有85%以上同源性的核酸序列、與SEQ IDNO 6所示序列具有85%以上同源性的核酸序列以及與SEQ ID NO :7所示序列具有85%以上同源性的核酸序列的核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明是包含控制序列以及與該控制序列可操縱連接的木瓜環(huán)斑病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)輔助組分蛋白酶基因(HC-Pro基因)的編碼序列片段的重組載體。本發(fā)明也提供重組微生物。本發(fā)明也提供一種使植物對病毒具有抗性的方法。本發(fā)明也提木瓜環(huán)斑病毒輔助組分蛋白酶的全長基因或其基因片段用于制造對病毒具有抗性的植物的用途。本發(fā)明以木瓜環(huán)斑病毒HC-Pro基因為靶來攻擊病毒的策略，可瓦解木瓜環(huán)斑病毒對抗植物宿主防御反應(yīng)的能力，避免因轉(zhuǎn)基因被基因沉默后而消失抗性的問題，并提供轉(zhuǎn)基因植物對于不同木瓜環(huán)斑病毒株系病毒的廣譜抗性，使所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物具有跨地理區(qū)域性的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/57GK102277376SQ201010203078
公開日2011年12月14日 申請日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者葉錫東, 王惠菁, 王馨蘭, 龔怡蓉 申請人:葉錫東, 王惠菁, 王馨蘭, 龔怡蓉