專利名稱：一種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢測方法，用于檢測ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運 體Al基因ABCA1、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因ADIPOQ和脂蛋白脂酶基因LPL的 變異，屬于分子生物學技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
脂類物質(zhì)具有重要的生物功能，脂肪是體內(nèi)的一種主要能量來源，但脂肪攝入過 量而運動量又過少將產(chǎn)生肥胖，并導致一些慢性病的發(fā)生；膳食脂肪總量增加，還會增大某 些癌癥的發(fā)生幾率。因此有意識地控制脂肪攝入和積極從事體力或體育活動，以消耗攝入 多余的熱量，避免過多的脂肪在體內(nèi)積存。ABCAl 為 ATP-binding cassette transporterAl，abcal (三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運 體Al)蛋白編碼基因，它以ATP為能源，促進細胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂的流出，在膽固醇逆 轉(zhuǎn)運(RCT)和HDL生成的起始步驟中起重要作用，被稱作RCT守門人。核受體PPARs、LXRs 和FXR對abcal蛋白的表達具有調(diào)控作用。ABCAl功能障礙將導致巨噬細胞內(nèi)大量的膽固 醇沉積而成為泡沫細胞，繼而浸潤血管壁，促進冠心病的發(fā)生發(fā)展。
ABCAl在機體中最重要的作用是對高密度脂蛋白的轉(zhuǎn)運。高密度脂蛋白是機體重 要的抵抗心腦血管疾病的大分子，它可以將機體多余的膽固醇從外周細胞轉(zhuǎn)運入肝臟內(nèi)， 同時也可以保護低密度脂蛋白不受氧化損傷的影響，抑制血管內(nèi)皮細胞上粘性大分子的表 達，組織單核分子進入血管壁。而ABCAl對于肝臟內(nèi)和外周細胞內(nèi)的膽固醇水平可以進行 調(diào)節(jié)，主要通過將多余的膽固醇從外周細胞泵出，與乏脂蛋白apoA-I結(jié)合形成初始狀態(tài)的 高密度脂蛋白，而初始狀態(tài)的高密度脂蛋白通過膽固醇磷酸?；蔀槟懽痛妓嶂闹?應轉(zhuǎn)化為成熟的α高密度脂蛋白。決定血清內(nèi)α高密度脂蛋白含量的幾個因素包括肝臟 內(nèi)ABCAl轉(zhuǎn)運酶和apoA-I的含量以及乏脂蛋白apoA-I的含量。ADIPOQ 為 adiponectin，ClQ and collagen domain containing(脂聯(lián)蛋白的 ClQ 和膠原結(jié)構(gòu)域)編碼基因，它編碼一種在結(jié)構(gòu)上與膠原X和VIII以及補體Clq類似的蛋白 質(zhì)。這種基因主要在脂肪組織中表達，所編碼的蛋白質(zhì)在血液中循環(huán)，并且和代謝以及激素 產(chǎn)生過程有關(guān)。它的突變或異常表達等都會引起胰島素等代謝綜合癥。LPL基因編碼脂蛋白脂酶，該酶在心臟、肌肉和脂肪組織中進行表達。LPL以同型 二聚體蛋白的形式行使功能，其分子生物學的作用包括兩部分，一部分為甘油三脂的水解 酶作用，另一部分則是受體介導的脂蛋白內(nèi)吞作用的橋梁。LPL蛋白上的位點突變在嚴重的 情況下可以導致I型高脂蛋白血癥，而較輕程度上則引起體內(nèi)脂蛋白代謝的紊亂。大樣本量中國人群研究證實，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Al基因ABCAl、脂聯(lián)蛋白的ClQ和 膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因ADIPOQ和脂蛋白脂酶基因LPL的變異在中國人群眾普遍存在。以往 的檢測方法在對ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Al基因ABCA1、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因 ADIPOQ和脂蛋白脂酶(LPL)基因進行檢測時出現(xiàn)的假陽性現(xiàn)象無法很好的排查和解釋。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種準確率高的脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢測方法。為了達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢 測方法，其特征在于，具體步驟為第一步、檢測的樣品類型與采樣方法用采樣拭刮被測者口腔中左右兩腮各20次，以采集口腔粘膜上皮細胞樣本；第二步、基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提每一個被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為 2-2. 5小時，經(jīng)電泳檢測后，肉眼可見清晰白色條帶即進入下一步檢測；第三步、熒光定量PCR反應 將每一個被測者樣本分別放入4個反應孔，同時檢測4個位點，即ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運 體Al基因rs2230806、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因rs2241766和脂蛋白脂酶基 因rs320和rs285，并增設2個不含DNA模板的NTC空白對照孔；在每一個反應孔中加入熒光定量PCR反應體系，所述PCR反應體系的總體積為 10 μ 1，由2 μ 1濃度為20ng/ μ 1的被測者口腔上皮細胞的基因組DNA模板溶液、1μ 1 IOX 熒光定量PCR反應緩沖液、0. 1 μ 1濃度分別為25mM的合成DNA的四種脫氧核苷酸底物d NTP混合液、0. 5 μ 1濃度為25mM的氯化鎂溶液、0. 02 μ 1濃度為5units/ μ 1的Taq DNA聚 合酶溶液、5. 43 μ 1去離子水、0. 225 μ 1濃度為20 μ M的正向引物溶液、0. 225 μ 1濃度為 20 μ M的反向引物溶液、0. 25 μ 1濃度為10 μ M的VIC熒光探針溶液和0. 25 μ 1濃度為10 μ M 的FAM熒光探針溶液組成，其中，4個位點的正向引物、反向引物、帶VIC熒光探針以及帶 FAM熒光探針序列如下(1)、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體 Al 基因 SEQ ID NOl :rs2230806 帶VIC 熒光 A 型探針ACCAAAGGAGAAACTG ；帶FAM 熒光 G 型探針ACCAAGGGAGAAACTG ；正向引物CATTGGACTGTTGCAATGGA；
反向引物ACAAAGTCATGCTGTCCAAGG ；(2)、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因SEQ ID NOl :rs2241766 帶VIC 熒光 G 型探針CGGGCATGACCAGG ；帶FAM 熒光 T 型探針CGGTCATGACCAGG ；正向引物GTATTACAGATTTCAGGGCAGAAAGA；反向引物TGTGATGAAAGAGGCCAGAA；(3)、脂蛋白脂酶基因 SEQ ID NOl :rs320 帶VIC 熒光 G 型探針AAGCGTTTATACT ；帶FAM 熒光 T 型探針AAGCTTTTATACT ；正向引物ATAAGCCCTGAATCGCTCAC；
反向引物TTCCATCCCCAAGATCTTTTT ；(4)、脂蛋白脂酶基因 SEQ ID NOl :rs285 帶VIC 熒光 C 型探針TTAGCAGCTGTGG ；帶FAM 熒光 T 型探針TTAGTAGCTGTGG ；
正向引物AAGAGAGGACTGTGGGACCAT；反向引物TGCTGCTTTAGACTCTTGTCCA；將反應孔和空白對照孔在PCR擴增儀上進行反應，先進行預熱50°C、2分鐘， 95°C、10分鐘，然后再進行60個循環(huán)的95°C、30秒，60°C、1分鐘，反應結(jié)束，取出后再放入 熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，得到ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Al基因rs2230806、脂聯(lián)蛋白的 ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因rs2241766和脂蛋白脂酶基因rs320和rs285四張圖；第四步、SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號的4個圖和NTC空白對照進行比 較，每個位點存在三種不同的信號，純VIC熒光信號、VIC和FAM雜合熒光信號以及純FAM熒 光信號，分別代表該位點三種不同的基因型；(1)、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體 Al 基因 rs2230806
在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為AA基因 型、坐標軸右上區(qū)域點為AG基因型、坐標軸右下區(qū)域點為GG基因型；(2)、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因rs2241766 在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為TT基因 型、坐標軸右上區(qū)域點為GT基因型、坐標軸右下區(qū)域點為GG基因型；(3)、脂蛋白脂酶基因rs320 在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為TT基因 型、坐標軸右上區(qū)域點為GT基因型、坐標軸右下區(qū)域點為GG基因型；(4)、脂蛋白脂酶基因rs285 在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為CC基因 型、坐標軸右上區(qū)域點為CT基因型、坐標軸右下區(qū)域點為TT基因型。本發(fā)明所需檢測的DNA可以利用口腔粘膜上皮細胞進行抽提獲得。采用口腔粘膜 上皮細胞采樣方法和器材進行樣本采集。樣本的DNA抽提利用硅膠吸附法進行口腔上皮細 胞的DNA抽提并進行DNA濃度和純度的測定。本發(fā)明4個位點的基因分型分別采用PCR技 術(shù)及TaqMan^MGB技術(shù)進行分型。經(jīng)重復實驗驗證，基因分型的準確率達到了 99%以上，重 復性達到了 100%。本發(fā)明增加了一對內(nèi)參因物的設計避免了假陽性現(xiàn)象，同時適用于大樣 本量的基因分型檢測。本發(fā)明的優(yōu)點是檢測準確率高，可重復性強。


圖1為ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Al基因SEQ ID NOl :rs2230806基因分型圖；圖2為脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因SEQ ID NOl :rs2241766基因分型圖。圖3為脂蛋白脂酶基因SEQ ID NOl :rs320基因分型圖；圖4為脂蛋白脂酶基因SEQ ID NOl :rs285基因分型圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例一種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢測方法第一步、檢測的樣品類型與采樣方法用采樣拭刮被測者口腔中左右兩腮各20次，以采集口腔粘膜上皮細胞樣本；第二步、基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提每一個被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小 時，經(jīng)電泳檢測后，肉眼可見清晰白色條帶即進入下一步檢測；第三步、熒光定量PCR反應將每一個被測者樣本分別放入4個反應孔，同時檢測4個位點，即ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運 體Al基因( ABCAl) rs2230806、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因(ADIPOQ) rs2241766 和脂蛋白脂酶基因(LPL)rs320和rs285，并增設2個不含DNA模版的NTC空白對照孔；在每一個反應孔中加入熒光定量PCR反應體系，其總體積為10μ 1，即2μ 1濃度為 20ng/ μ 1的被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA溶液、1 μ 1 IOX熒光定量PCR反應緩沖 液(ABI Master Mix)、0. 1 μ 1濃度分別為25mM的合成DNA的四種脫氧核苷酸底物d NTP 混合液、0. 5 μ 1濃度為25mM的氯化鎂溶液、0. 02 μ 1濃度為5units/ μ 1的Taq DNA聚合酶 (ΤIANGEN Taq DNA Polymerase)、5. 43 μ 1 去離子水、0. 225 μ 1 濃度為 20 μ M 的正向引物、 0. 225 μ 1濃度為20 μ M的反向引物、0. 25 μ 1濃度為10 μ M的VIC熒光探針和0. 25 μ 1濃 度為 ομ M的FAM熒光探針，其中，4個位點的正向引物、反向引物、帶VIC熒光探針以及帶 FAM熒光探針如下ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體 Al 基因(ABCAl)SEQ ID NOl :rs2230806 帶VIC 熒光 A 型探針ACCAAaGGAGAAACTG帶FAM 熒光 G 型探針ACCAAgGGAGAAACTG正向引物CATTGGACTGTTGCAATGGA反向引物ACAAAGTCATGCTGTCCAAGG脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因(ADIPOQ)SEQ ID NOl :rs2241766 帶VIC 熒光 G 型探針CGGgCATGACCAGG
帶 FAM 熒光 T 型探針CGGtCATGACCAGG正向引物GTATTACAGATTTCAGGGCAGAAAGA反向引物TGTGATGAAAGAGGCCAGAA脂蛋白脂酶基因(LPL)SEQ ID NOl :rs320 帶VIC 熒光 G 型探針AAGCgTTTATACT帶FAM 熒光 T 型探針AAGCtTTTATACT正向引物ATAAGCCCTGAATCGCTCAC反向引物TTCCATCCCCAAGATCTTTTT脂蛋白脂酶基因(LPL)SEQ ID NOl :rs285 帶VIC 熒光 C 型探針TTAGcAGCTGTGG
帶 FAM 熒光 T 型探針TTAGtAGCTGTGG正向引物AAGAGAGGACTGTGGGACCAT反向引物TGCTGCTTTAGACTCTTGTCCA
將反應孔和空白對照孔在PCR擴增儀上進行反應，先進行預熱50°C、2分鐘， 95°C、10分鐘，然后再進行60個循環(huán)的95°C、30秒，60°C、1分鐘，反應結(jié)束，取出后再放入 熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，得到ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Al基因(ABCAl) rs2230806、脂 聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因(ADIPOQ)rs2241766和脂蛋白脂酶基因(LPL)rs320 和rs285四張圖；第四步、SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號的4個圖和一個NTC空白對照進行 比較，每個位點存在三種不同的信號，純VIC熒光信號、VIC和FAM雜合熒光信號以及純FAM 熒光信號，分別代表該位點三種不同的基因型；(1)、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體 Al 基因(ABCAl) rs2230806如圖1所示，為ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Al基因SEQ ID NOl :rs2230806基因分型圖，坐 標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為AA基因型、坐標軸右上區(qū)域點為AG基因 型、坐標軸右下區(qū)域點為GG基因型；圖中每個點代表一個受檢樣本，根據(jù)點所處的區(qū)域和 位置和顏色可以進行基因型判斷。
(2)、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因(ADIPOQ)rs2241766如圖2所示，為脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因SEQ ID NOl :rs2241766基 因分型圖，坐標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為TT基因型、坐標軸右上區(qū) 域點為GT基因型、坐標軸右下區(qū)域點為GG基因型；圖中每個點代表一個受檢樣本，根據(jù)點 所處的區(qū)域和位置和顏色可以進行基因型判斷。(3)、脂蛋白脂酶基因(LPL)rs320 如圖3所示，為脂蛋白脂酶基因SEQ ID NOl :rs320基因分型圖，坐標軸左下區(qū)域 點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為TT基因型、坐標軸右上區(qū)域點為GT基因型、坐標軸右 下區(qū)域點為GG基因型；圖中每個點代表一個受檢樣本，根據(jù)點所處的區(qū)域和位置和顏色可 以進行基因型判斷。(4)、脂蛋白脂酶基因(LPL)rs285 如圖4所示，為脂蛋白脂酶基因SEQ ID NOl :rs285基因分型圖，坐標軸左下區(qū)域 點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為CC基因型、坐標軸右上區(qū)域點為CT基因型、坐標軸右 下區(qū)域點為TT基因型。圖中每個點代表一個受檢樣本，根據(jù)點所處的區(qū)域和位置和顏色可 以進行基因型判斷。
權(quán)利要求
一種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢測方法，其特征在于，具體步驟為第一步、檢測的樣品類型與采樣方法用采樣拭刮被測者口腔中左右兩腮各20次，以采集口腔粘膜上皮細胞樣本；第二步、基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提每一個被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2-2.5小時，經(jīng)電泳檢測后，肉眼可見清晰白色條帶即進入下一步檢測；第三步、熒光定量PCR反應將每一個被測者樣本分別放入4個反應孔，同時檢測4個位點，即ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1基因rs2230806、脂聯(lián)蛋白的C1Q和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因rs2241766和脂蛋白脂酶基因rs320和rs285，并增設2個不含DNA模板的NTC空白對照孔；在每一個反應孔中加入熒光定量PCR反應體系，所述PCR反應體系的總體積為10μl，由2μl濃度為20ng/μl的被測者口腔上皮細胞的基因組DNA模板溶液、1μl 10X熒光定量PCR反應緩沖液、0.1μl濃度分別為25mM的用于合成DNA的四種脫氧核苷酸底物d NTP混合液、0.5μl濃度為25mM的氯化鎂溶液、0.02μl濃度為5units/μl的Taq DNA聚合酶溶液、5.43μl去離子水、0.225μl濃度為20μM的正向引物溶液、0.225μl濃度為20μM的反向引物溶液、0.25μl濃度為10μM的VIC熒光探針溶液和0.25μl濃度為10μM的FAM熒光探針溶液組成，其中，4個位點的正向引物、反向引物、帶VIC熒光探針以及帶FAM熒光探針序列如下(1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1基因SEQ ID NO1rs2230806帶VIC熒光A型探針ACCAAAGGAGAAACTG；帶FAM熒光G型探針ACCAAGGGAGAAACTG；正向引物CATTGGACTGTTGCAATGGA；反向引物ACAAAGTCATGCTGTCCAAGG；(2)、脂聯(lián)蛋白的C1Q和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因SEQ ID NO1rs2241766帶VIC熒光G型探針CGGGCATGACCAGG；帶FAM熒光T型探針CGGTCATGACCAGG；正向引物GTATTACAGATTTCAGGGCAGAAAGA；反向引物TGTGATGAAAGAGGCCAGAA；(3)、脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1rs320帶VIC熒光G型探針AAGCGTTTATACT；帶FAM熒光T型探針AAGCTTTTATACT；正向引物ATAAGCCCTGAATCGCTCAC；反向引物TTCCATCCCCAAGATCTTTTT；(4)、脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1rs285帶VIC熒光C型探針TTAGCAGCTGTGG；帶FAM熒光T型探針TTAGTAGCTGTGG；正向引物AAGAGAGGACTGTGGGACCAT；反向引物TGCTGCTTTAGACTCTTGTCCA；將反應孔和空白對照孔在PCR擴增儀上進行反應，先進行預熱50℃、2分鐘，95℃、10分鐘，然后再進行60個循環(huán)的95℃、30秒，60℃、1分鐘，反應結(jié)束，取出后再放入熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，得到ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1基因rs2230806、脂聯(lián)蛋白的C1Q和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因rs2241766和脂蛋白脂酶基因rs320和rs285四張圖；第四步、SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號的4個圖和一個NTC空白對照進行比較，每個位點存在三種不同的信號，純VIC熒光信號、VIC和FAM雜合熒光信號以及純FAM熒光信號，分別代表該位點三種不同的基因型；(1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1基因rs2230806在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為AA基因型、坐標軸右上區(qū)域點為AG基因型、坐標軸右下區(qū)域點為GG基因型；(2)、脂聯(lián)蛋白的C1Q和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因rs2241766在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為TT基因型、坐標軸右上區(qū)域點為GT基因型、坐標軸右下區(qū)域點為GG基因型；(3)、脂蛋白脂酶基因rs320在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為TT基因型、坐標軸右上區(qū)域點為GT基因型、坐標軸右下區(qū)域點為GG基因型；(4)、脂蛋白脂酶基因rs285在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為CC基因型、坐標軸右上區(qū)域點為CT基因型、坐標軸右下區(qū)域點為TT基因型。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢測方法，其特征在于，具體步驟為檢測的樣品類型與采樣方法基因組DNA的抽提方法；熒光定量PCR反應；以及SNP基因型分析。本發(fā)明的優(yōu)點是檢測準確率高，可重復性強。
文檔編號C12Q1/68GK101845510SQ20101020500
公開日2010年9月29日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者傅詠南, 毛丹丹, 王校 申請人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司