專利名稱：一種注射接種鑒定番茄對番茄黃化曲葉病毒抗性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種番茄黃化曲葉病毒抗性鑒定方法，屬植物保護(hù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
番茄黃化曲葉病是番茄上一種毀滅性的病毒病，該病自1964年首次報(bào)道以來，在 歐洲、非洲、亞洲、加勒比海及大洋州等地區(qū)都有發(fā)生危害的報(bào)道，特別是近年來，隨著全球 氣候變暖和耕作制度的改變以及國際間貿(mào)易的增加，番茄黃化曲葉病在全球范圍傳播，給 番茄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。1991-1992年該病在美國佛羅里達(dá)州番茄上暴發(fā)，造成的損失達(dá) 1. 4億美元。在我國，由番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)導(dǎo)致的 番茄黃化曲葉病最早于2006年在上海和浙江出現(xiàn)危害報(bào)道，番茄受其侵染后早期會(huì)表現(xiàn) 葉緣黃化、上卷，葉片變小、植株矮縮；后期整株上部呈現(xiàn)簇縮狀，花萎蔫，座果率大大降低， 嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量，發(fā)病重的棚室多造成絕產(chǎn)絕收，經(jīng)濟(jì)損失巨大。2007年該病傳 入江蘇、安徽、山東危害，隨后在河北、北京、天津、內(nèi)蒙古等省市也相繼出現(xiàn)危害，擴(kuò)展蔓延 速度十分驚人，同時(shí)造成的危害也異常慘重。2008年末到2009年初僅河北邯鄲市因番茄黃 化曲葉病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失就近1億元。目前該病已經(jīng)逐漸成為當(dāng)前我國番茄生產(chǎn)上一 個(gè)重要的制約因素。在大多數(shù)植物病毒病的防治中，抗性品種是最為經(jīng)濟(jì)有效的防治措施，而在抗性 資源的發(fā)掘及利用中，抗性鑒定方法是必不可少的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于番茄黃化曲葉病毒 是一種煙粉虱傳播的病毒，因此長期以來該病毒的抗性鑒定多采用煙粉虱接種鑒定法，但 是該方法操作過程中需要煙粉虱來完成傳毒，因此存在一些難于克服的問題1、煙粉虱的 接種蟲量難于控制，由于煙粉虱的生活周期非常短，世代重疊現(xiàn)象非常嚴(yán)重，導(dǎo)致其群體增 殖能力非常強(qiáng)，而煙粉虱的個(gè)體又非常小，因此無論是在田間還是在室內(nèi)，單株上接種的煙 粉虱數(shù)量很難控制；2、帶毒煙粉虱的接種數(shù)量難于控制，由于煙粉虱本身的接種蟲量難于 控制，也導(dǎo)致了其中帶毒煙粉虱的接種蟲量難于計(jì)量；3、煙粉虱的傳毒效率難于控制，由于 煙粉虱是一種傳毒昆蟲，只有在其取食的過程中才能實(shí)現(xiàn)傳毒，而其取食受諸多因素影響， 如溫度、濕度、光照、寄主等等，這些因素會(huì)影響其取食次數(shù)及取食量，對傳毒效率產(chǎn)生影 響，進(jìn)而對鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性也產(chǎn)生影響；4、由于煙粉虱傳播的病毒非常多，因此使用煙粉 虱接種番茄黃化曲葉病毒的時(shí)候，煙粉虱可能同時(shí)攜帶其它病毒，影響接種鑒定結(jié)果。為了解決煙粉虱接種鑒定方法上存在的問題，我們創(chuàng)制了一種基于侵染性克隆注 射接種鑒定的方法，該方法操作簡便，重復(fù)性好，可控性好，效率高，結(jié)果準(zhǔn)確，為抗番茄黃 化曲葉病毒的番茄材料的研究及利用提供了一種新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，為番茄黃化曲葉病毒的抗性鑒定提供了一種快 速、簡便、有效的方法。
1、抗性鑒定的材料含PTYjOl的農(nóng)桿菌保存于江蘇省農(nóng)科院植保所病害室(江蘇省南京市孝陵衛(wèi)鐘 靈街50號(hào)，210014)，接種用的注射器采用標(biāo)準(zhǔn)的一次性注射器(1ml)，YEP培養(yǎng)基及抗生素 的配制參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》。2、抗性鑒定方法a)將含有PTYjOl的農(nóng)桿菌接種含50mg/ml的卡那霉素(Kanamycin)利50mg/ml 的利福平(Rifamycin)的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C 150rpm培養(yǎng)至0D6(1(1達(dá)到0. 6-0. 8。b)常規(guī)條件下育苗，2片真葉時(shí)移至一次性營養(yǎng)缽中，3-4片葉時(shí)進(jìn)行接種處理。c)用1ml注射器取菌液于3-4葉期番茄莖桿韌皮部注射3_4點(diǎn)，注射處理的番茄 于溫室(溫度為23-30°C)內(nèi)放置1-2天，而后移置田間或者溫室，觀察發(fā)病情況。d) 15-30天統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率，評價(jià)番茄材料對番茄黃化曲葉病毒的抗 性發(fā)病率高的材料表現(xiàn)感病，發(fā)病率低的材料表現(xiàn)抗性。其中所述的接種用溫室溫度23-30°C，也可以是25_28°C。本發(fā)明的有益效果是只需簡單的莖桿注射接種就實(shí)現(xiàn)了番茄黃化曲葉病毒的抗 性鑒定。避免了常規(guī)煙粉虱接種鑒定方法的上的缺陷，無需飼養(yǎng)煙粉虱，無需繁瑣的操作， 同時(shí)該方法還具有鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、效率高等優(yōu)勢。


附圖是利用注射接種法鑒定番茄對番茄黃化曲葉病毒抗性的結(jié)果(上部為抗病 材料，下部為感病材料)
具體實(shí)施例方式實(shí)例一以番茄材料東圣1號(hào)、719、747、8849為研究對象，通過注射接種鑒定其對番茄黃 化曲葉病毒的抗性。1、實(shí)驗(yàn)處理a)將含有PTYjOl的農(nóng)桿菌接種含50mg/ml的卡那霉素(Kanamycin)和50mg/ml 的利福平(Rifamycin)的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C 150rpm培養(yǎng)至0D6(1(1達(dá)到0. 6-0. 8。b)常規(guī)條件下育苗，2片真葉時(shí)移至一次性營養(yǎng)缽中，3-4片葉時(shí)進(jìn)行接種處理。c)用1ml注射器取菌液于3-4葉期番茄莖桿韌皮部注射3_4點(diǎn)，注射處理的番茄 于溫室(溫度為23-30°C)內(nèi)放置1-2天，而后移置田間或者溫室，觀察發(fā)病情況。d) 15-30天統(tǒng)計(jì)田間發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率，評價(jià)番茄材料對番茄黃化曲葉病毒的 抗性。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理后的番茄于接種后15天左右出現(xiàn)癥狀(葉緣黃化、上卷)，與田間番茄黃化曲 葉病病株癥狀一致，20-25天統(tǒng)計(jì)發(fā)病率東圣1 號(hào)100% (21/21)；719 100% (22/22)；747 0% (0/22)；
8849 0% (0/19)；由發(fā)病率可以看出4份番茄材料中，東圣1號(hào)、719全部發(fā)病(發(fā)病率為100%)， 為感病材料；而747、8849沒有一棵發(fā)病(發(fā)病率為0% )，為抗病材料。
權(quán)利要求
一種注射接種鑒定番茄對番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，包括以下步驟(1)將含有PTYj01的農(nóng)桿菌接種含50mg/ml的卡那霉素(Kanamycin)和50mg/ml的利福平(Rifamycin)的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃150rpm培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8。(2)常規(guī)條件下育苗，2片真葉時(shí)移至一次性營養(yǎng)缽中，3-4片葉時(shí)進(jìn)行接種處理。(3)用1ml注射器取菌液于3-4葉期番茄莖桿韌皮部注射3-4點(diǎn)，注射處理的番茄于溫室(溫度為23-30℃)內(nèi)放置1-2天，而后移置田間或者溫室，觀察發(fā)病情況。(4)15-30天統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率，評價(jià)番茄材料對番茄黃化曲葉病毒的抗性發(fā)病率高的材料表現(xiàn)感病，發(fā)病率低的材料表現(xiàn)抗性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射接種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，其特征在于番 茄接種及接種后放置的溫室溫度為23-30°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射接種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，其特征在于番 茄接種后于溫室內(nèi)放置的天數(shù)為1-2天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射接種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，其特征在于接 種鑒定的病毒為番茄黃化曲葉病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種快速、簡捷、有效的番茄黃化曲葉病毒抗性鑒定方法，屬植物保護(hù)領(lǐng)域。傳統(tǒng)的番茄黃化曲葉病毒抗性鑒定多采用煙粉虱接種鑒定法，而煙粉虱接種鑒定法由于受到煙粉虱的影響(如煙粉虱接種蟲量、帶毒率、取食特性等)，很難提供穩(wěn)定一致的接種壓力，同時(shí)還會(huì)受其它粉虱傳病毒的干擾，從而導(dǎo)致其鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性差。而農(nóng)桿菌注射接種法很好的克服了這些問題，利用構(gòu)建好的侵染性克隆，通過莖桿注射接種番茄黃化曲葉病毒，鑒定番茄材料對番茄黃化曲葉病毒的抗性，該方法無需飼養(yǎng)煙粉虱、操作簡單、效率高、重復(fù)性好、可控性好，能提供相對一致的接種壓力，結(jié)果準(zhǔn)確，是一種簡便有效的接種鑒定方法。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101884281SQ20101020688
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月23日
發(fā)明者余文貴, 周彤, 周曉偉, 周益軍, 孫海霞, 季英華, 程兆榜, 趙統(tǒng)敏 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院