專利名稱：用于結(jié)核病潛伏感染診斷的極低病原載量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于結(jié)核潛伏感染診斷的極低病原載量超敏感和特異的檢測方 法，更具體地說是針對結(jié)核潛伏感染提供巢式熒光PCR檢測方法和診斷試劑，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(M. Tuberculosis, MTB)感染引起 的一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病。結(jié)核可以在人體內(nèi)潛伏感染長達(dá)數(shù)年乃至終生， 全球人口的三分之一(約20億)被認(rèn)為感染了潛伏態(tài)的TB，中國人群中約44. 6%有潛伏 TB感染(潛伏感染)，而且其中大于10%的人在他們的一生中會發(fā)展成活動性疾病。世界 衛(wèi)生組織(WHO) 2009年全球結(jié)核控制報告，估計2007年全球共有927萬起結(jié)核發(fā)病病例， 高于2006年(924萬例)、2000年(830萬例)和1990年(660萬例)的水平。我國的結(jié)核 病人數(shù)居世界第二位，僅次于印度，病死數(shù)每年高達(dá)13萬，超過其它傳染病數(shù)的總和，成為 我國急需關(guān)注的公共衛(wèi)生問題和社會問題。大多數(shù)活動性結(jié)核病是潛伏感染的結(jié)核桿菌重新被激活所致，因此結(jié)核潛伏感染 者成為結(jié)核患者的重要來源。及早診斷和治療結(jié)核潛伏感染者是控制結(jié)核傳播的最有效手 段之一。然而在普通人群中進行結(jié)核潛伏感染篩查并不符合成本效益，若能在最有可能發(fā) 展為活動性結(jié)核病的高危人群中早期發(fā)現(xiàn)潛伏性感染，并及時采取隔離、預(yù)防和治療措施， 則能顯著降低發(fā)病率、死亡率和傳染率。由于我國的結(jié)核病疫情相當(dāng)嚴(yán)重，結(jié)核病的早期、 快速診斷對于早期化療和控制傳播都有極為重要的意義。因此，傳染病潛伏期感染的診斷 對于提早發(fā)現(xiàn)病人，有選擇的隔離治療所產(chǎn)生的經(jīng)濟、社會效益是非常巨大的。然而，現(xiàn)在世界上尚沒有有效的TB潛伏性感染的診斷方法。目前臨床上結(jié)核病的 常規(guī)診斷方法主要有細(xì)菌學(xué)檢查、影像學(xué)診斷和免疫學(xué)診斷。這些方法開發(fā)已近一個世紀(jì)， 存在著很多缺點，其中，最重要是檢出率低特異性也低。難以及時做出明確診斷，在臨床上 存在大量漏診和誤診。近年來，原有的診斷方法得到了改進和提高，也引入了新的技術(shù)包括 分子診斷技術(shù)如Real-time PCR等，有利于提高結(jié)核病診斷的準(zhǔn)確性。但這些新的方法存在 不同程度的缺陷，沒有在臨床上證實可行性，也沒得到有關(guān)部門批準(zhǔn)可作為常規(guī)診斷方法。 這就是為什么世界衛(wèi)生組織(WHO)把開發(fā)有效適用結(jié)核病診斷方法列為達(dá)到2015控制結(jié) 核病首要任務(wù)之一。TB潛伏感染人群巨大，但檢出率極低。目前臨床上常規(guī)用的TB潛伏感染診斷方 法，結(jié)核菌素試驗和干擾素釋放反應(yīng)試驗，都存在著非特異性的問題，而且檢出率極低。最 主要的問題是潛伏感染人群中結(jié)核菌量可能很低，一般方法無法檢測到。因此，TB潛伏感 染診斷需要極其敏感和特異的方法。本發(fā)明的目的就是為了解決這個結(jié)核病控制上重大問 題。我們方法的核心技術(shù)是來源于我們新開發(fā)的超敏感、艾滋病極低病毒載量檢測技 術(shù)，通過進一步的試驗研究，在結(jié)核潛伏感染診斷中的應(yīng)用。我們已證明核心技術(shù)的敏感性高于目前世界上所有分子診斷技術(shù)，且特異性高。這種新方法首次整合了以下特點以實現(xiàn) 高通量潛伏感染篩查<i>靈敏度高；<ii>兼容性好；<iii>高通量；<iv>確證性，病原體基 因型分析。為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明方法采用巢式熒光PCR檢測法，整合了巢式PCR和實時熒 光定量PCR的優(yōu)點，第一輪PCR擴增時加入一對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的特異性引物，第二輪 PCR擴增以第一輪PCR產(chǎn)物為模版，應(yīng)用TaqMan熒光探針原理，加入一對結(jié)核分枝桿菌復(fù) 合群的特異性引物和一條特異性熒光雙標(biāo)記探針，探針為寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報 告熒光基團(FAM)和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基 團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5' -3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬 滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，通過檢測熒光信號的強弱計算PCR 產(chǎn)物的數(shù)量，檢測陽性提示標(biāo)本含有結(jié)核分枝桿菌DNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一組能用于檢測結(jié)核病潛伏感染診斷的極低病 原載量的核苷酸序列。本發(fā)明要解決的另外一個技術(shù)問題是提供一種針對潛伏感染結(jié)核病各種病原體 的檢測試劑盒，具體而言，提供了極早期結(jié)核分枝桿菌熒光PCR檢測試劑。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一組能用于檢測結(jié)核病潛伏感染診斷的極低病原載量的核苷酸序列，通過國內(nèi)外 已發(fā)表的論文總結(jié)分析出待測病原體的特異性核苷酸序列，采用Primer5. 0軟件設(shè)計得 到序列表SEQ ID NO. 1至序列表SEQ ID NO. 5的核苷酸序列，其中SEQ ID NO. 1和NO. 2為第一輪PCR檢測結(jié)核分枝桿菌的引物對SEQ ID NO. 3和N0. 4為第二輪PCR檢測結(jié)核分枝桿菌的引物對SEQ ID N0. 5是第二輪PCR檢測結(jié)核分枝桿菌的探針序列還可能包括如下衍生序列和擴增序列SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID N0. 2 所組成的引物對，SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID N0. 2 的互 補序列，以及引物SEQ ID NO. 1向5，端延伸10個堿基的核酸序列，引物SEQ ID N0. 2向3， 端延伸10個堿基的核酸序列，引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2擴增的核酸序列。SEQ ID N0. 3 和 SEQ ID N0. 4 所組成的引物對，SEQ ID N0. 3 和 SEQ IDN0. 4 的互 補序列，以及引物SEQ ID N0. 3向5，端延伸10個堿基的核酸序列，引物SEQ ID N0. 4向3， 端延伸10個堿基的核酸序列，引物SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4擴增的核酸序列。探針序列SEQ ID N0. 5，SEQ ID NO. 5的互補序列，以及探針的5，端和3，端各延 伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列及其互補序列。用于結(jié)核病潛伏感染診斷的極低病原載量檢測的巢式熒光PCR診斷試劑盒包括1)第一輪 PCR 反應(yīng)液1XPCR 緩沖液；0. 2ymol/L 引物 1 ；0. 2ymol/L 引物 2 ； 250ymol/LdNTP ；4mmol/L MgCl2 ；1. 5U Taq 酶。2)第二輪PCR反應(yīng)液IXPCR緩沖預(yù)混液；0. 4μ mol/L引物3 ；0. 4μ mol/L引物 4 ；0. 2 μ mol/L 探針·3)陰性對照雙蒸水4)陽性對照攜帶有擴增產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA
PCR反應(yīng)液中的引物1-4分別對應(yīng)為SEQ IDN0. 1-4 ；探針為SEQ ID NO. 5。所述5，端標(biāo)記EM熒光燃料。探針3 ’端標(biāo)記TAMARA淬滅標(biāo)記。 通過對引物和探針濃度，Mg2+濃度、Taq酶濃度以及PCR變性和退火溫度優(yōu)化，建 立了最適的PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件。巢式熒光PCR檢測試劑盒最適PCR反應(yīng)體系見 下表表1 第一輪PCR檢測試劑盒最適PCR反應(yīng)體系 第一輪PCR檢測試劑盒最適PCR反應(yīng)條件為第一步％°C 3分鐘；第二步M°C 30秒，巡。C 30秒，I^C M秒；迆個循環(huán)，第三 步ITC叢分鐘。表2 第二輪PCR檢測試劑盒最適PCR反應(yīng)體系 第二輪熒光PCR檢測試劑盒最適PCR反應(yīng)條件為第一步％°C辺分鐘；第二步％°C邊秒，迎。C迎秒；迎個循環(huán)，迎。C時設(shè)置采集熒光。本發(fā)明結(jié)果判斷采用擴增曲線和Ct值為判斷標(biāo)準(zhǔn)(1)陰性對照為陰性，Ct值顯示為None，陽性對照的Ct倌應(yīng)小于或等于28。(2) Ct信顯示為None的樣本為陰性樣本，Ct信彡35的樣本為陽件。(3) Ct值大于迪的樣本建議重做。重做結(jié)果顯示為None為陰性，否則為陽性。
本發(fā)明方法的具體步驟 (1)設(shè)計合成引物和探針；(2)采集樣品，提取核酸。本發(fā)明所需樣品可來源于痰液、血液和腦脊液等，采用蛋 白酶K消化，高溫裂解、氯仿抽提等步驟從上述樣品中提取核酸；(3)加樣。按第一輪PCR反應(yīng)體系，在各反應(yīng)管中分別加入反應(yīng)液和核酸；(4)擴增。按第一輪PCR擴增條件設(shè)定反應(yīng)參數(shù)，放入反應(yīng)管；(5)加樣。按第二輪PCR反應(yīng)體系，在各反應(yīng)管中分別加入反應(yīng)液和第一輪PCR擴 增產(chǎn)物；(6)檢測。按第二輪PCR擴增循環(huán)條件設(shè)定反應(yīng)參數(shù)，放入反應(yīng)管，開機檢測；(7)根據(jù)擴增曲線和Ct值分析和判斷結(jié)果。全過程可在一天內(nèi)完成。本發(fā)明采用超敏感、極低病毒載量巢式熒光PCR檢測技術(shù)診斷潛伏期結(jié)核病，可 以快速進行診斷。本發(fā)明使用于結(jié)核病快速排查、檢測、監(jiān)控和防治。本發(fā)明的優(yōu)點是1)本檢測法與之前所應(yīng)用的檢測方法相比(包括高度敏感的巢式PCR和傳統(tǒng)real time PCR)，具有更高的靈敏度；2)本檢測方法具有高通量性，能大幅度減少時間和費用；3)本檢測方法可以檢測出世界范圍內(nèi)各種不同的結(jié)核病原體；4)本方法檢測的陽性PCR產(chǎn)物可以通過測序來確定結(jié)核病原體的基因型；5)本方法通過特別的程序設(shè)計，可有效避免污染。下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明，并非對本發(fā)明的限定，依 據(jù)本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實施方式并不限于此，因此凡是依照本公開內(nèi)容所作 出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。


圖1 為采用結(jié)核病潛伏感染診斷的極低病原載量的巢式熒光PCR診斷試劑盒對 人痰液樣品的檢測圖。圖2 為采用結(jié)核病潛伏感染診斷的極低病原載量的巢式熒光PCR診斷試劑盒對 人血液樣品的檢測圖。圖3 為采用結(jié)核病潛伏感染診斷的極低病原載量的巢式熒光PCR診斷試劑盒對 人腦脊液樣品的檢測圖。圖4 為巢式熒光PCR診斷試劑盒敏感性試驗檢測圖1.陽性質(zhì)粒樣品；2.結(jié)核分 枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株；3.結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；4.陰性對照。
具體實施例方式實施例1 結(jié)核病潛伏感染診斷的極低病原載量的巢式熒光PCR診斷試劑盒引物 和探針制備第一輪巢式PCR，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌特異性的686bp序列，選擇其中的一條序列 (Genebank No. NC_000962)，采用Primer 3. 0軟件，根據(jù)引物的退火溫度在55_60°C的原 貝丨J，選擇了引物SEQ ID NO. 1和NO. 2，Blast同源性分析顯示，選擇的引物為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異性序列，與其他序列無同源性。引物擴增產(chǎn)物為239bp。第二輪巢式熒光定量 PCR，根據(jù)第一輪PCR擴增產(chǎn)物序列，采用Primer Express 3. O軟件，根據(jù)引物退火溫度為 60°C，探針退火溫度高于引物退火溫度10°C左右的原則，選擇了引物SEQ ID NO. 3和NO. 4， 和探針SEQ ID NO. 5。擴增產(chǎn)物長度為77bp。探針’端標(biāo)記FAM或者FAM熒光燃料，3’端標(biāo)記TAMARA淬滅熒光染料。引物，各 輪PCR擴增產(chǎn)物及探針序列見序列表。實施例2 結(jié)核病潛伏感染診斷的極低病原載量的巢式熒光PCR診斷試劑盒靈敏 度鑒定1. DNA提取用DNA提取試劑盒(Qiagen)從攜帶有擴增產(chǎn)物的MTB質(zhì)粒中提 取 DNA，樣品的0D260/280值不小于1. 6，并進行電泳檢測后，根據(jù)測得的濃度將DNA濃度稀釋 至IOOng/ μ L-20°C保存。進行靈敏度分析時將DNA5倍梯度稀釋0. 1-25拷貝/ μ L，再以稀 釋的DNA為模版進行PCR擴增。2.靈敏度分析351份梯度稀釋的樣品所含的DNA拷貝數(shù)范圍為0. 2-50拷貝，其 中，普通的熒光定量PCR的陽性檢出例數(shù)為36，陽性檢出率為8. 9%，巢式熒光PCR的陽性 檢出例數(shù)為142，陽性檢出率為40. 5%，與普通熒光定量PCR相比顯著增高(P < 0. 0001)實施例3 結(jié)核病潛伏感染診斷的極低病原載量的熒光PCR診斷試劑盒1)第一輪 PCR 反應(yīng)液1XPCR 緩沖液；0. 2ymol/L 引物 1 ；0. 2ymol/L 引物 2 ； 250ymol/L dNTP ；4mmol/L MgCl2 ；1. 5U Taq 酶。2)第二輪PCR反應(yīng)液1 XPCR緩沖預(yù)混液；0. 4 μ mol/L引物3 ;0. 4 μ mol/L引物 4 ；0. 2 μ mol/L 探針·3)陰性對照雙蒸水4)陽性對照攜帶有擴增產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA陽性對照的制備方法提取自MTB H37Rv質(zhì)粒的DNA作為陽性對照實施例4 結(jié)核病潛伏感染診斷的極低病原載量的巢式熒光PCR診斷試劑盒檢測 臨床樣品一、樣品采集1.抗凝全血抽取人外周血液于檸檬酸鈉或EDTA抗凝管中。2.痰液深咳喉嚨深部的痰液，將痰液直接咳入收集瓶。3.腦脊液收集腦脊液2_5ml送檢。二、樣品的運輸和保存待測樣本在2_8°C保存不應(yīng)超過24小時；_20°C不應(yīng)超過三個月；_80°C長期保存。樣品運輸采用冰壺加冰或泡沫箱加冰密封進行。三、樣品處理1.抗凝全血的處理方法(1)取500 μ 1全血，加紅細(xì)胞裂解液至10ml，混勻，靜置 5 10分鐘，1500轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清；(2)同樣方法處理1次，棄上清，將沉淀用紅細(xì) 胞裂解液100 200 μ 1再次清洗一次，1500轉(zhuǎn)離心10分鐘棄上清；(3)加入50 μ ITriton 提取液，100°C煮沸30min，12000轉(zhuǎn)離心lOmin，直接用于PCR或儲存于_20°C備用。2.痰液標(biāo)本處理(1)留取痰液3 4ml，倒入15ml刻度離心管(血痰加等量紅 細(xì)胞裂解液混勻靜置3 5min) ； (2)加入等量1 %胰酶Hanks液，置37°C水浴消化，直至痰液被完全消化為止，混勻，吸500 μ 1到15ml離心管中；(3)加入4% NaOH處理3 5min， 離心留沉淀；(4)加入50 μ ITriton提取液，100°C煮沸30min, 12000轉(zhuǎn)離心lOmin，直接用 于PCR或儲存于_20°C備用。3.腦脊液處理(1)配置裂解液，20mM Tris-HCl (pH 8. 0), 300mM NaCl,0. 8 % SDS,and 0. 5mg蛋白酶K ； (2)按1 1的比例將裂解液加入腦脊液中，65°C孵育過夜，直接 用于PCR或儲存于_20°C備用。四、擴增檢測 1.第一輪PCR擴增試劑準(zhǔn)備(在反應(yīng)混合物配置區(qū)進行)，取出緩沖液，引物， dNTP，MgCl2和Taq酶，按表1用量配置反應(yīng)液，充分混勻后在每個PCR反應(yīng)管中分裝28 μ 1， 轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。2.加樣(樣品處理區(qū))在已分裝有PCR反應(yīng)混合液的PCR管中分別加入已提取 好的核酸，蓋上管蓋，放入PCR檢測儀。3.第一輪PCR擴增檢測反應(yīng)條件為第一步95°C 3分鐘；第二步94°C 30秒， 580C 30秒，72°C 60秒；35個循環(huán)，第三步72°C 10分鐘。4.第二輪PCR擴增試劑準(zhǔn)備(在反應(yīng)混合物配置區(qū)進行)，取出熒光PCR緩沖液， 引物和dNTP，按表2用量配置反應(yīng)液，充分混勻后在每個PCR反應(yīng)管中分裝18 μ 1，轉(zhuǎn)移至 樣本處理區(qū)。5.加樣(樣品處理區(qū))在已分裝有PCR反應(yīng)混合液的PCR管中分別加入第一輪 PCR擴增產(chǎn)物，蓋上管蓋，放入熒光PCR檢測儀。6.第二輪PCR擴增檢測反應(yīng)條件為第一步95°C 10分鐘；第二步95°C 15秒， 600C 60秒；40個循環(huán)，60°C時設(shè)置采集熒光。7.熒光素設(shè)定報告熒光基團為FAM，淬滅熒光基團為TAMAR，背景熒光為R0X。五、分析條件設(shè)定和結(jié)果分析綜合儀器給出的各項結(jié)果，基線以儀器給出的默認(rèn)值作為參考，閾值設(shè)定為閾值 線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點為準(zhǔn)，選擇FAM通道進行分析。1.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對照為陰性，Ct值顯示為None，陽性對照Ct值應(yīng)小于等于28， 否則此次實驗視為無效。2.結(jié)果分析及判定Ct值顯示為None的樣本為陰性樣本，Ct值小于或等于35的 樣本為陽性。Ct值大于35的樣本為無效實驗。
權(quán)利要求
一組檢測潛伏感染診斷的極低病原載量結(jié)核病的核苷酸序列，其特征在于序列表SEQ IDNO.1至序列表SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，其中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2為第一輪PCR檢測結(jié)核分枝桿菌的引物對SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4為第二輪PCR檢測結(jié)核分枝桿菌的引物對SEQ ID NO.5是檢測結(jié)核分枝桿菌的探針序列。
2.用于結(jié)核病潛伏感染診斷的極低病原載量檢測試劑盒，其特征在于包括(1)第一輪PCR反應(yīng)液1XPCR緩沖液；0. 2 u mol/L引物1 ;0. 2 y mol/L引物2 ； 250umol/LdNTP ；4mmol/L MgCl2 ；1. 5U Taq 酶。(2)第二輪PCR反應(yīng)液1XPCR緩沖預(yù)混液；0.4 ii mol/L引物3 ;0. 4 ii mol/L引物4 ； 0. 2 u mol/L探針。陰性對照雙蒸水(3)陽性對照攜帶有擴增產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA(4)所述探針5’端標(biāo)記FAM熒光染料，探針3’端標(biāo)記TAMARA淬滅標(biāo)記。上述引物1為SEQ ID NO. 1，引物2為SEQ ID NO. 2，引物3為SEQ ID NO. 3，引物4為 SEQ ID NO. 4，探針為 SEQ ID NO. 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于結(jié)核潛伏感染診斷的極低病原載量檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。發(fā)明公開的內(nèi)容包括一組針對結(jié)核分枝桿菌基因進行PCR擴增的引物和探針序列，PCR反應(yīng)體系、檢測程序、反應(yīng)參數(shù)和判斷方法，以及血樣、腦脊液、痰等各種臨床樣品的前處理和核酸提取方法。公開的PCR擴增的引物和探針序列包括序列列表SEQ ID NO.1至NO.5。采用本發(fā)明提供的試劑盒方法，可在一天內(nèi)完成從樣品處理到PCR檢測全過程，敏感性高，檢測靈敏度可以達(dá)到單個基因拷貝或單個菌細(xì)胞，特異性，且比常規(guī)的細(xì)菌學(xué)診斷快速、簡便和實用。
文檔編號C12N15/11GK101871011SQ201010208369
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月23日
發(fā)明者朱托夫 申請人:廣州海力特生物科技有限公司