專利名稱：水稻OsEATB基因在改良水稻產量性狀方面的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于轉基因技術領域，具體涉及一種改良水稻產量性狀方法。
背景技術：
水稻是世界上重要的糧食作物之一，全世界有約2/3的人口以水稻為主食。為了 滿足日益增長的人口對糧食的需求，提高水稻生產力具有重要意義。產量性狀是描述水稻 生產力的重要農藝性狀，主要由有效穗數、每穗谷粒數和千粒重幾部分組成。這些產量性狀 都屬于數量性狀(QTL)，由許多效應不同的基因所控制。目前國內外利用轉基因改良農作物經濟性狀的技術主要是根據已知的功能基因 與表型性狀的關系，采用組成型表達載體或組織專一性表達載體將目的基因導入目標植 物，以期獲得作物特定經濟性狀或抗逆性性狀的改良。具有AP2結構域的轉錄因子家族成員是一類只存在于高等植物中的重要轉錄因 子。該家族不同成員的功能涉及植物花、子房、種子的發(fā)育調控；乙烯誘導的、與植株抗性相 關基因的表達調控；植物頂端分生及分枝性狀的調控等。目前有關AP2的生物學功能幾乎都只涉及植物(或作物)對逆境的響應及有關調 控路線，尚無關于AP2涉及產量性狀形成及其改良的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的在于提出水稻OsEATB基因在改良水稻產量性狀方面的應用。本發(fā)明利用水稻AP2轉錄因子OsEATB基因及其同源基因轉化水稻兩個亞種粳 稻和秈稻，用以改良水稻的產量性狀；實施例中，本發(fā)明將水稻OsEATB基因轉化處理秈稻 9311，使秈稻9311產量性狀發(fā)生明顯改善。本發(fā)明還利用水稻AP2轉錄因子OsEATB基因及其同源基因轉化包括玉米，小麥， 高粱和其它谷類作物，用于產量性狀的改良。本發(fā)明還利用AP2轉錄因子OsEATB基因及其同源基因轉化雙子葉作物，用于產量 性狀的改良，包括增加分枝數，籽粒和果實數，籽粒和果實體積與重量。本發(fā)明還包括水稻AP2轉錄因子家族成員OsEATB(Oryza sativa ERF protein Associated with Tillering and Branch)的分離、克隆與轉基因功能研究等。1) OsEATB基因與蛋白結構組成水稻AP2轉錄因子家族成員OsEATB屬于AP2轉錄因子家族中的ERF亞家族，基因 結構無內含子(intron)，含有一個AP2結構域。目前我們在國際生物信息網站登錄的水稻 AP2轉錄因子家族成員OsEATB編號為EU622934，DNA序列長825bp，見SEQ. ID N01.。該基 因的結構與其編碼的蛋白質組成如下水稻OsEATB基因結構見圖1所示。蛋白結構見圖2所示，含有一個AP2結構域。2) OsEATB基因表達載體的構建
^tM pCAMBIA1304(Center for the Application of Molecular Biology of International Agriculture, Canberra, ACT, Australia)M # M 9311 白勺 OsEATB基因插入到pCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游，得含OsEATB基因的表達載 體。其結構圖如圖3所示。3) OsEATB基因轉化實驗采用目前國內超級雜交稻的主要親本之一秈稻9311為轉基因受體，構建OsEATB 基因的過表達轉基因植株。將秈稻9311成熟種子去殼消毒后接種在脫分化植物組織培育 基上誘導愈傷組織。在愈傷組織誘導2-3周后，采用基因槍微彈轟擊法，將含OsEATB基因 的經純化的pCAMBIA1304質粒DNA導入秈稻9311愈傷組織細胞。在添加30ppm潮霉素的 MS培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)3-4周篩選抗性細胞系，然后將篩選的細胞系轉移到分化培養(yǎng)基誘導 長芽和生根。4)轉化處理試管苗移載及轉化植株后代的分子檢測將OsEATB基因轉化處理的9311試管苗移載田間，并在分蘗期取葉片提取DNA采 用PCR擴放技術進行分子檢測，于2008年夏獲得陽性TO代植株。2008年冬，在海南島加代 繁殖，獲得轉基因Tl代，共計8個株系。5) OsEATB轉秈稻9311植株轉基因的實時定量PCR(RealTime PCR)檢測目的基因OsEATB在秈稻9311轉基因植株中的表達量上調為野生型植株的十倍。 見圖4所示。6) OsEATB轉基因T2代群體產量性狀的調查與統(tǒng)計將OsEATB基因轉基因T2代于2009年春播種，四葉期將轉化的2個OsEATB轉基 因T2代株系種植在復旦大學試驗田。2個株系每個株系各種植27株，行株距為6寸x6寸， 重復三次，同時設立秈稻9311親本對照。在成熟期統(tǒng)計各株系27個單株的有效穗數，主穗 長，主穗一次枝梗及二次枝梗數，主穗總粒數和千粒重，計算平均值，統(tǒng)計結果如下 水稻OsEATB轉基因有效分蘗數、有效穗數、穗枝梗數和穗粒數變化見圖5_圖8所示。 根據上述田間調查及考種數據，與對照相比，OsEATB轉基因秈稻9311的產量性狀 優(yōu)于對照
有效穗增加16. 95% ；平均主穗穗粒數增加29. 34%。水稻OsEATB轉基因植株與野生型秈稻9311穗形模式比較見圖9和圖10。水稻OsEATB轉基因增加產量的主要原因是增加分蘗力、有效穗數、穗枝梗數和穗 粒數。7) OsEATB轉基因植株生育期提前對上述T2代轉基因植株進行葉齡和抽穗時間的跟蹤記錄，結果表明=OsEATB轉基 因植株的抽穗時間比野生型植株提前約20天。OsEATB轉基因植株與野生型秈稻9311植株 同為2009-05-25播種，轉基因植株2009-08-20十張旗葉時抽穗，野生型植株2009-09-10 十三張旗葉時抽穗。8) OsEATB轉基因植株具有抗倒伏株形OsEATB轉基因植株株型與野生型秈稻9311植株相比，穗長未縮短、第1節(jié)間縮短 2.6%、第二節(jié)間縮短18.5%、第三節(jié)間縮短26.9%、第四節(jié)間縮短56.3%，根節(jié)未縮短，符 合抗倒伏株形的特點。


圖1為水稻OsEATB基因結構。圖2為水稻OsEATB基因蛋白結構。圖3為水稻OsEATB基因的表達載體結構圖。圖4為OsEATB基因在秈稻9311轉基因植株中表達量與野生型植株的比照。圖5為水稻OsEATB轉基因有效分蘗數變化。圖6為水稻OsEATB轉基因穗長變化。
圖7為水稻OsEATB轉基因穗枝梗數變化。圖8為水稻OsEATB轉基因穗谷粒數變化圖9為野生型秈稻9311穗形模式。圖10為水稻OsEATB轉基因植株穗形模式。圖11為OsEATB轉基因種子形態(tài)特征。種子形態(tài)更細長，符合優(yōu)良秈稻品種的特 征。圖12為水稻OsEATB轉基因種子發(fā)芽勢(1)，快于對照9311。圖13為為水稻OsEATB轉基因種子發(fā)芽勢(2)，快于對照9311。圖14為OsEATB轉基因成熟單株。左圖9311對照，右圖=OsEATB轉基因9311單株。圖15為OsEATB轉基因植株性狀。其中，有效穗增加16. 95% ；平均每穗穗粒數增 加29. 34% ；每株總粒數增加51. 26% ；千粒重減少18. 03%。圖16為OsEATB轉基因植株形態(tài)變化。其中，植株矮化，穗長及第1節(jié)間長度無明 顯變化，第4節(jié)間明顯縮短，符合抗倒伏株形的特點。左側，9311對照；右側，OsEATB轉基因 植株。圖17為OsEATB轉基因植株穗形。其中，穗一次枝梗數和二次枝梗數明顯增多，穗 總粒數增多。左側，9311對照；右側，OsEATB轉基因植株。
具體實施例方式1、選擇OsEATB全長ORF區(qū)段(其全長cDNA序列見SEQ ID NO. 1，編碼序列見 SEQ IDN0. 2)，采用PCR方法從秈稻9311中將其擴增，并合成插入接頭克隆到植物表達載體 PCAMBIA1304,獲得 OsEATB 表達載體 pCAMBIA1304/lrkl。2、誘導水稻愈傷組織培養(yǎng)基(1)誘導及繼代培養(yǎng)基MS+2mg/L 2，4_D。(2)高滲培養(yǎng)基MS+2mg/L 2，4-D+46. 67g/L 山梨醇 +46. 67g/L 甘露醇。(3)第一輪篩選培養(yǎng)基MS+2mg/L 2，4_D+30mg/L 潮霉素。(4)第二輪篩選培養(yǎng)基MS+2mg/L 2，4_D+50mg/L 潮霉素。(5)分化培養(yǎng)基:MS+3mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+50mg/L 潮霉素。(6)生根壯苗培養(yǎng)基l/2MS+0. lmg/L NAA。(注1.以上培養(yǎng)基均含30g/L蔗糖+2.5g/L agar, pH 5. 8。2.愈傷誘導、繼代、 篩選培養(yǎng)條件為26-28°C暗培養(yǎng)，分化、生根壯苗為26-28°C及16小時光周期)3、愈傷組織誘導與處理(1)取授粉后12-15天的未成熟種子，在無菌條件下，先用70%乙醇浸洗lOmin，轉 入0. 升汞浸泡20min，無菌水清洗3次。(2)在無菌條件下剝離幼胚，接種于愈傷誘導培養(yǎng)基上，26_28°C暗培養(yǎng)約20天后 切芽，繼代一次。(3)在繼代培養(yǎng)基中挑選生長旺盛、淡黃色的愈傷30-50塊(每塊3mm左右)，置 于高滲培養(yǎng)基上中央，排成直徑約2. 5cm的圓圈內，培養(yǎng)約4-5h后用于轉化。4、基因槍轉化(1)基因槍從寧波新芝科技有限公司購置的高壓氣體基因槍，型號GJ-1000。(2)微粒子彈制備(3)稱取60mg鎢粉(直徑約Ium)，加入到1. 5ml滅菌離心管中，再加入Iml無水 乙醇，振蕩lmin，于IOOOOrpm離心10s，棄上清，重復洗一次后，將金粉懸浮于Iml無菌水中 現(xiàn)用或_20°C保存。(4)吸取50ul鎢粉懸浮液于1. 5ml離心管，依次加入5ug DNA、50ul 2. 5M CaCl2, 20ul 0. IM亞精胺，振蕩5分鐘，IOOOOrpm離心20s，棄上清，以140ul無水乙醇漂洗兩次，加 入60ul無水乙醇，懸浮待用。5、轟擊受體材料(1)將基因槍放于超凈工作臺上，用70%酒精擦凈真空室，并將可裂膜、載粒膜、 金屬擋網(均由寧波新芝科技有限公司供貨)于70%酒精中消毒30分鐘，然后用無菌濾紙 吸干或吹凈殘余酒精.(2)打開電源開關，真空泵及氦氣瓶閥。(3)將可裂膜裝入固定、旋緊。(4)取IOul包被DNA的鎢粉無水乙醇懸浮液，均勻涂布于載粒膜中心，放在超凈臺 上吹干。(5)將載有微彈的載粒膜及擋網裝入微彈發(fā)射裝置，使有顆粒的一面朝下。(6)將培養(yǎng)皿放在托盤上，使愈傷集中于培養(yǎng)皿中央。
(7)打開氣瓶，調節(jié)壓力llOOPsi。(8)抽真空，當真空度達到需要值時，將VAC鍵轉到Hold位置。(9)轟擊，每皿轟擊2次(第一次轟擊后將培養(yǎng)皿旋轉90度后進行第二次轟擊)， 按放氣鍵使真空表讀數回零，取出樣品，轟擊后于高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)12_16h。6、轉化愈傷組織篩選(1)將打槍后高滲培養(yǎng)基上的愈傷轉入不含篩選劑的誘導培養(yǎng)基上恢復生長5-7天。(2)將愈傷轉到含30mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，均勻擺放，暗培養(yǎng)14-17天進行 第一次抗性篩選。(3)將抗性愈傷轉入含50mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)8-12天進行第二次 抗性篩選。7、轉化植株篩選與檢測(1)將篩選后存活的愈傷于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)30天。(2)待分化出小植株后，將小植株轉入生根壯苗培養(yǎng)基，長大后移入溫室。(3)分別采用PCR擴增和基因組Southern雜交法檢測侯選的轉化植株，共獲得8 株含有轉化的OsEATB片段的陽性植株。
權利要求
水稻OsEATB基因及其同源基因在改良水稻產量性狀方面的應用，其特征在于利用水稻AP2轉錄因子OsEATB基因及其同源基因轉化水稻兩個亞種粳稻和秈稻，以改良水稻的產量性狀。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于采用秈稻9311為轉基因受體，構建OsEATB 基因的過表達轉基因植株。
3.一種OsEATB基因表達載體，其特征在于采用pCAMBIA1304為表達載體，將秈稻9311 的OsEATB基因插入到pCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游而獲得。
全文摘要
本發(fā)明屬于轉基因技術領域，具體為水稻OsEATB基因在改良水稻產量性狀方面的應用。本發(fā)明利用水稻AP2轉錄因子OsEATB基因及其同源基因轉化水稻兩個亞種粳稻和秈稻，用以改良水稻的產量性狀；此外，還利用水稻AP2轉錄因子OsEATB基因及其同源基因轉化包括玉米，小麥，高粱和其它谷類作物，用于改良谷類作物產量性狀的改良。進一步還利用OsEATB基因及其同源基因轉化雙子葉作物，用于改良雙子葉作物產量性狀的，包括增加分枝數，籽粒和果實數，籽粒和果實體積與重量。
文檔編號C12N15/29GK101886083SQ201010208969
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月24日 優(yōu)先權日2010年6月24日
發(fā)明者孫凡, 楊金水, 祁巍巍 申請人:復旦大學