專利名稱：一種單堿基Indel突變的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及遺傳分子標(biāo)記的篩查和檢測，特別涉及一種單堿基 Indel (單個核苷酸插入/缺失)突變的檢測方法。
背景技術(shù)：
生命的遺傳信息存貯于DNA序列之中，高等生物每一個細胞的全部DNA構(gòu)成了該 生物的基因組?；蚪MDNA序列的變異是物種遺傳多樣性的基礎(chǔ)，是生物多樣性的最初變 異來源。單核苷酸的變異(SNP)是DNA序列的最常見最基本的變異，成為第三代分子標(biāo)記。 在人類多基因遺傳疾病的研究時，SNP分析具有巨大的應(yīng)用潛力。如利用SNP標(biāo)記已發(fā)現(xiàn) 與人類一些重要疾病(糖尿病、精神分裂癥、癌癥、鐮狀細胞貧血和血友病等)相連鎖的標(biāo) 記座基因；在農(nóng)作物育種時，重要農(nóng)藝性狀基因緊密連鎖SNP標(biāo)記的獲得提高了育種的選 擇性與預(yù)見性。如利用SNP標(biāo)記尋找與抗旱性、抗病性等重要農(nóng)藝性狀相連鎖的基因；在 家畜育種時，利用分子標(biāo)記輔助選擇。如根據(jù)SNP對應(yīng)激綜合癥基因，肥胖基因診斷和檢 測，矮小基因、綿羊多胎基因和雙肌基因的SNP應(yīng)用等加快了家畜育種進展。然而SNP的數(shù)量由Indel的密度決定，Indel本身也是一種核苷酸插入/缺失突 變，且Indel能夠引起附近堿基發(fā)生熱點突變。自然選擇在很大程度上是通過對Indel的 選擇而實現(xiàn)的，尤其對單堿基Indel的選擇。所以作為多數(shù)自發(fā)突變的發(fā)生根源的Indel， 在解開腫瘤發(fā)生機制、作物和家畜遺傳育種等方面具有重大潛在應(yīng)用價值，新近備受關(guān)注。但是目前可以檢測單個核苷酸Indel的方法存在一定的局限性。如DNA序列測 定法是其中最為準(zhǔn)確的檢測Indel的方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序 儀等大型儀器和非常熟練的技術(shù)人員，所以，DNA序列測定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實際的理 想Indel檢測方法；PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陰性 問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段。限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP) —種簡單的 Indel檢測方法，但應(yīng)用非常局限，不是通用的方法；SNP基因芯片、微球陣列技術(shù)、質(zhì)譜儀 和TaqMan熒光探針等檢測技術(shù)平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種檢測單堿基Indel突變位點的方法，針對核 苷酸缺失或插入等位基因位點特異性設(shè)計引物，產(chǎn)生堿基連續(xù)錯配而阻止特異性引物與未 對應(yīng)的基因模板鏈結(jié)合，是一種簡便、準(zhǔn)確性高的檢測方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種檢測單堿基Indel突變位點的方法，包括以下步驟1)根據(jù)基因中已知存在的Indel位點設(shè)計引物對Pw和Pm ；以野生型鏈為模板設(shè)計Pw引物對，正向引物Pw-F的3'端起始位堿基與對應(yīng)于 Indel位點下游第3或4位的堿基相同，Pw-F的其余序列與3'端起始位堿基上游15 25bp的序列相同；反向引物Pw-R與Indel位點的下游100 IOOObp范圍內(nèi)的15 25bp的序列互補；以突變型鏈為模板設(shè)計Pm引物對，反向引物Pm-R的3 ‘端起始位堿基與Indel位 點上游第3或4位的堿基互補，Pm-R的其余序列與3'端起始位堿基下游的15 25bp的 序列互補；正向引物Pm-F與Indel位點的上游100 IOOObp范圍內(nèi)的15 25bp的序列 相同；或者，以野生型鏈為模板設(shè)計Pw引物對，反向引物Pw-R的3'端起始位堿基與 對應(yīng)于Indel位點上游第3或4位的堿基互補，Pw-R的其余序列與3'端起始位堿基下游 15 25bp的序列互補；正向引物Pw-F與對應(yīng)于Indel位點的上游100 IOOObp范圍內(nèi) 的15 25bp序列相同；以突變型鏈為模板設(shè)計Pm引物對，正向引物Pm-F的3'端起始位堿基與Indel 等位基因位點下游第3或4位的堿基相同，Pm-F的其余序列與3'端起始位的堿基上游的 15 25bp的序列相同；反向引物與Indel位點的下游100 IOOObp范圍內(nèi)的15 25bp 序列互補；引物對Pw和Pm所能夠擴增的基因片段長度相差I(lǐng)OObp以上；2)提取待測樣本的基因組DNA，并以全基因組DNA為模板，以人工合成的引物對 Pw, Pm為引物，分別進行PCR擴增；3)將分別PCR擴增獲得的產(chǎn)物等體積混合，然后對混合物進行瓊脂糖凝膠電泳， 根據(jù)電泳結(jié)果判定待測樣本的目的基因是否發(fā)生了 Indel變異當(dāng)電泳結(jié)果顯示為只有Pw擴增的一個條帶時，表明待測樣本的目的基因型為沒 有發(fā)生Indel變異的野生純合子；當(dāng)電泳結(jié)果顯示為只有Pm擴增的一個條帶時，表明待測樣本的目的基因型為發(fā) 生Indel變異的野生純合子；當(dāng)電泳結(jié)果顯示為一個Pw擴增的條帶和一個Pm擴增的條帶時，表明待測樣本的 目的基因型的為雜合子。所述的檢測單堿基Indel突變位點的方法，對山羊weaver基因5' UTR發(fā)生的如 SEQ ID No. 1所示的第118位的單堿基“A”的插入/缺失(Indel)多態(tài)性的檢測，所述的 Pw引物對為正向弓丨物 Pw-F :ctacgttatc tccgggcaaa gcc 23;反向弓丨物 Pw-R :tgggcacgaa tgcaaatac19;所述的Pm引物對為正向弓丨物 Pm-F :aaagcaactc gggtcaagg19;反向弓丨物 Pm-R :catccgtctc gtggcttgc19;Pw引物對擴增的基因片段長度為367bp，Pm引物對擴增的基因片段長度為132bp。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定山羊的weaver基因5' UTR的Indel多態(tài)性為當(dāng)電泳結(jié)果顯示為只有367bp條帶時，表明待測山羊的weaver基因5' UTR為野 生純合；當(dāng)電泳結(jié)果顯示為只有132bp條帶時，表明待測山羊的weaver基因5' UTR為突 變純合；當(dāng)電泳結(jié)果顯示為367bp和132bp條帶時，表明待測山羊的weaver基因5' UTR為雜合。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本分明具有以下有益的技術(shù)效果針對已知的核苷酸缺失或插入等位基因位點設(shè)計特異性引物，本發(fā)明通過把 Indel突變位點設(shè)計到特異性引物3'端的第3或4位，這樣會因產(chǎn)生堿基的連續(xù)錯配而有 效地阻止特異性引物與非對應(yīng)的基因模板鏈結(jié)合，從而提高了引物的特異性，防止的假陽 性的出現(xiàn)。當(dāng)利用Pm引物對特異擴增樣本中Indel突變等位基因時，引物對Pm對于Indel 野生等位基因的擴增就會因堿基連續(xù)錯配而使延伸有效受阻。同樣當(dāng)利用Pw引物對擴增 樣本中Indel野生等位基因時，引物對Pw對于Indel突變等位基因的擴增也會因堿基連續(xù) 錯配而使延伸有效受阻。即引物對Pm只特異擴增Indel突變等位基因，而引物對Pw引物 對只特異擴增Indel野生等位基因，而連續(xù)錯配保證了實驗的特異性，提高了實驗的準(zhǔn)確 度和科學(xué)性。此外，本發(fā)明Pw和Pm兩對引物分管擴增防止了它們與模板存在復(fù)雜的競爭使得 假陽性或假陰性的概率增加。而且兩對引物擴增的片段大小相差在IOObp取以上，這樣可 以易于區(qū)分電泳之后的條帶大小。這種方法可以準(zhǔn)確、快速地檢測出樣本中的Indel變異，而Indel能夠引起附近堿 基發(fā)生熱點突變，SNP的數(shù)量由Indel的密度決定。研究表明DNA序列中的Indel突變往 往會引起較大的遺傳效應(yīng)，會造成表型性狀大的改變。所以本發(fā)明在重要的復(fù)雜疾病、分子 育種和遺傳多樣性評價等方面的研究有著重大的應(yīng)用價值。


圖1為本發(fā)明檢測單堿基Indel突變位點的方法流程示意圖；圖2為本發(fā)明針對單堿基Indel突變位點設(shè)計引物而形成的堿基連續(xù)錯配示意 圖；圖3為本發(fā)明利用本發(fā)明來檢測山羊weaver基因5' UTR發(fā)生Indel變異的電泳 結(jié)果圖；圖4位山羊weaver基因5' UTR發(fā)生Indel位點的野生型和突變型的基因序列測 序圖。
具體實施例方式本發(fā)明建立一種基于增強AS-PCR的檢測Indel突變位點的方法，根據(jù)Indel位點 不同的等位基因設(shè)計特異性引物，分別擴增不同的等位基因片段。這種方法能夠簡便、準(zhǔn)確 的檢測到待測樣本目的基因的Indel突變發(fā)生情況。下面結(jié)合附圖和對山羊weaver基因 5' UTR發(fā)生的Indel具體檢測方法來對本發(fā)明做進一步詳細描述，所述是對本發(fā)明的解釋 而不是限定。參見圖1，Indel突變位點的檢測方法，包括以下步驟1)根據(jù)基因中已知存在的Indel位點設(shè)計引物對Pw和Pm ；以野生型鏈為模板設(shè)計Pw引物對，正向引物Pw-F的3'端起始位堿基與對應(yīng)于 Indel位點下游第3或4位的堿基相同，Pw-F的其余序列與3'端起始位堿基上游15 25bp的序列相同；反向引物Pw-R與Indel位點的下游100 IOOObp范圍內(nèi)的15 25bp 的序列互補；以突變型鏈為模板設(shè)計Pm引物對，反向引物Pm-R的3 ‘端起始位堿基與Indel位 點上游第3或4位的堿基互補，Pm-R的其余序列與3'端起始位堿基下游的15 25bp的 序列互補；正向引物Pm-F與Indel位點的上游100 IOOObp范圍內(nèi)的15 25bp的序列 相同；還可以按照以下方法，根據(jù)Indel位點的設(shè)計Pw和Pm特異性引物并能達到相同 的效果以野生型鏈為模板設(shè)計Pw引物對，反向引物Pw-R的3’端起始位堿基與對應(yīng)于 Indel位點上游第3或4位的堿基互補，Pw-R的其余序列與3'端起始位堿基下游15 25bp的序列互補；正向引物Pw-F與對應(yīng)于Indel位點的上游100 IOOObp范圍內(nèi)的15 25bp序列相同；以突變型鏈為模板設(shè)計Pm引物對，正向引物Pm-F的3'端起始位堿基與Indel 等位基因位點下游第3或4位的堿基相同，Pm-F的其余序列與3'端起始位的堿基上游的 15 25bp的序列相同；反向引物與Indel位點的下游100 IOOObp范圍內(nèi)的15 25bp 序列互補；引物對Pw和Pm所能夠擴增的基因片段長度相差I(lǐng)OObp以上；參見圖2，具體以引物Pm-F與Indel位點為N的插入為例來說明連續(xù)錯配的形成Pm-F的設(shè)計為Indel突變位點在正向引物Pm-F的3'端的第4位上，以此引物擴 增含突變型等位基因片段，電泳時有相應(yīng)條帶。對于引物與野生型鏈(沒有N的插入)則 形成4個連續(xù)錯配，延伸受阻。電泳時無相應(yīng)條帶。2)提取待測樣本的基因組DNA，并以全基因組DNA為模板，以人工合成的引物對 Pw、Pm為引物，分別進行PCR擴增；3)將分別PCR擴增獲得的產(chǎn)物等體積混合，然后對混合物進行瓊脂糖凝膠電泳， 根據(jù)電泳條帶的有無來判定待測樣本的目的基因Indel變異與否當(dāng)電泳結(jié)果顯示為只有Pw擴增的一個條帶時，表明待測樣本的目的基因型為沒 有發(fā)生Indel變異的野生純合子；當(dāng)電泳結(jié)果顯示為只有Pm擴增的一個條帶時，表明待測樣本的目的基因型為發(fā) 生Indel變異的野生純合子；當(dāng)電泳結(jié)果顯示為一個Pw擴增的條帶和一個Pm擴增的條帶時，表明待測樣本的 目的基因型的為雜合子。實施例1山羊weaver基因5' UTR的Indel多態(tài)性的檢測1)山羊weaver基因5' UTR存在如SEQ ID No. 1所示的第118位發(fā)生一個堿基 “A，，Indel 多態(tài)性；設(shè)計引物對Pw為以野生型鏈為模板設(shè)計正向引物3'端第1位堿基與對應(yīng)于Indel等位基因位點 下游第3位堿基相同，S卩序列表SEQ ID No. 1第121位的“C”堿基，然后以此位堿基上游的 一段相同DNA序列為正向引物，引物的長短取決于引物的退火溫度和GC含量，以間隔348bp 長度設(shè)計反向引物，引物對Pw具體為正向弓丨物 Pw-F :ctacgttatc tccgggcaaa gcc 23;
反向弓丨物 Pw-R :tgggcacgaa tgcaaatac19;該引物對擴增片段長度為367bp。設(shè)計引物對和Pm為以突變型鏈為模板設(shè)計反向引物3'端第1位堿基與Indel等位基因位點上游第 4位堿基互補，即與序列表SEQ ID No. 1第114位的“G”堿基互補。引物的長短取決于引的 退火溫度和GC含量，然后以間隔IlSbp長度設(shè)計反向引物，引物對Pw具體為正向弓丨物 Pm-F :aaagcaactc gggtcaagg 19;反向弓丨物 Pm-R :catccgtctc gtggcttgc 19;該引物對擴增片段長度為132bp。2)人工合成的引物對Pw、Pm，提取待測樣本的全基因組，以引物對Pw、Pm為引物同 一待測DNA樣本為模板分別進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為12. 5 μ L，具體見表1。PCR反應(yīng)程序，具體見表2。表IPCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
一種檢測單堿基Indel突變位點的方法，其特征在于，包括以下步驟1)根據(jù)基因中已知存在的Indel位點設(shè)計引物對Pw和Pm以野生型鏈為模板設(shè)計Pw引物對，正向引物Pw F的3′端起始位堿基與對應(yīng)于Indel位點下游第3或4位的堿基相同，Pw F的其余序列與3′端起始位堿基上游15～25bp的序列相同；反向引物Pw R與對應(yīng)于Indel位點的下游100～1000bp范圍內(nèi)的15～25bp的序列互補；以突變型鏈為模板設(shè)計Pm引物對，反向引物Pm R的3′端起始位堿基與Indel位點上游第3或4位的堿基互補，Pm R的其余序列與3′端起始位堿基下游的15～25bp的序列互補；正向引物Pm F與Indel位點的上游100～1000bp范圍內(nèi)的15～25bp的序列相同；或者，以野生型鏈為模板設(shè)計Pw引物對，反向引物Pw R的3′端起始位堿基與對應(yīng)于Indel位點上游第3或4位的堿基互補，Pw R的其余序列與3′端起始位堿基下游15～25bp的序列互補；正向引物Pw F與對應(yīng)于Indel位點的上游100～1000bp范圍內(nèi)的15～25bp序列相同；以突變型鏈為模板設(shè)計Pm引物對，正向引物Pm F的3′端起始位堿基與Indel等位基因位點下游第3或4位的堿基相同，Pm F的其余序列與3′端起始位的堿基上游的15～25bp的序列相同；反向引物與Indel位點的下游100～1000bp范圍內(nèi)的15～25bp序列互補；引物對Pw和Pm所能夠擴增的基因片段長度相差100bp以上；2)提取待測樣本的基因組DNA，并以全基因組DNA為模板，以人工合成的引物對Pw、Pm為引物，分別進行PCR擴增；3)將分別PCR擴增獲得的產(chǎn)物等體積混合，然后對混合物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果判定待測樣本的目的基因是否發(fā)生了Indel變異當(dāng)電泳結(jié)果顯示為只有Pw擴增的一個條帶時，表明待測樣本的目的基因型為沒有發(fā)生Indel變異的野生純合子；當(dāng)電泳結(jié)果顯示為只有Pm擴增的一個條帶時，表明待測樣本的目的基因型為發(fā)生Indel變異的野生純合子；當(dāng)電泳結(jié)果顯示為一個Pw擴增的條帶和一個Pm擴增的條帶時，表明待測樣本的目的基因型的為雜合子。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測單堿基Indel突變位點的方法，其特征在于，對山羊 weaver基因5' UTR發(fā)生的如SEQ ID No. 1所示的第118位的Indel多態(tài)性的檢測，所述 的Pw引物對為正向弓I物 Pw-F :ctacgttatc tccgggcaaa gcc 23;反向弓I物 Pw-R :tgggcacgaa tgcaaatac19;所述的Pm引物對為正向弓I物 Pm-F :aaagcaactc gggtcaagg19;反向弓I物 Pm-R :catccgtctc gtggcttgc19;Pw引物對擴增的基因片段長度為367bp，Pm引物對擴增的基因片段長度為132bp。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測單堿基Indel突變位點的方法，其特征在于，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定山羊的weaver基因5' UTR的Indel多態(tài)性為當(dāng)電泳結(jié)果顯示為只有367bp條帶時，表明待測山羊的weaver基因5' UTR為野生純合；當(dāng)電泳結(jié)果顯示為只有132bp條帶時，表明待測山羊的weaver基因5' UTR為突變純合；當(dāng)電泳結(jié)果顯示為367bp和132bp條帶時，表明待測山羊的weaver基因5' UTR為雜合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單堿基Indel突變的檢測方法，根據(jù)基因中已知存在的Indel位點設(shè)計引物對Pw和Pm，然后PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測判型；提取待測樣本的全基因組，并以全基因組為模板，以Pw、Pm為引物分別進行PCR擴增；將PCR擴增獲得的產(chǎn)物等體積混合進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳相應(yīng)條帶有無來判定待測樣本的目的基因Indel變異發(fā)生與否。本方法能夠方便、準(zhǔn)確的對待測樣本目的基因的Indel突變做出檢測，有非常大的應(yīng)用價值。而Indel突變在重要的復(fù)雜疾病、分子育種和遺傳多樣性評價等方面的研究有著重大的理論價值。
文檔編號C12Q1/68GK101955996SQ20101021124
公開日2011年1月26日 申請日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者李轉(zhuǎn)見, 淮永濤, 滑溜帥, 王璟, 藍賢勇, 陳宏 , 韓瑞麗, 馬亮 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)