專利名稱：一種短小芽孢桿菌及其在毒殺松材線蟲中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種短小芽孢桿菌及其在毒殺松材線 蟲中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，疫情擴(kuò)散蔓延的形勢仍然十分嚴(yán)峻。松材線蟲病不僅影響林業(yè)生產(chǎn)，而且給 園林綠化、旅游事業(yè)及人民群眾生活等方面帶來不可估量的損失，防治該病害成為當(dāng)前國 內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，對松材線蟲病的防治多采用化學(xué)防治，但化學(xué)藥劑因存在毒性大、對環(huán)境污 染等問題在應(yīng)用中逐漸受到限制。例如曾廣泛應(yīng)用的化學(xué)殺線劑豐索磷、滅線磷等因?yàn)橹?畸、致癌以及引起精子減少等原因而被禁用，胺線磷、丁環(huán)硫磷等已停止開發(fā)。現(xiàn)有的大多 數(shù)化學(xué)藥劑品種也存在著成本高、防效不理想、產(chǎn)生藥害和抗藥性等問題，使松材線蟲的防 治工作面臨很大的困境。為此，許多國家的科學(xué)家都在努力尋找防治植物線蟲的新途徑。開 發(fā)高效低毒殺線劑和生物殺線劑已經(jīng)迫在眉睫。目前，利用資源豐富的有益微生物防治植 物線蟲成為了發(fā)展生物殺線劑的重要途徑。芽孢桿菌在自然界分布非常廣泛，生理特性豐富多樣，是土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢 種群之一。它們可以產(chǎn)生豐富的具有潛在植物病害防治和醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值的抗菌物質(zhì)，是植 物病害生防微生物的重要組成部分(Tamenhiro，2002 ；蒙顯英，2004)。芽孢桿菌內(nèi)生芽孢， 繁殖能力強(qiáng)，有利于工業(yè)生產(chǎn)，是自然界中廣泛存在的非致病細(xì)菌，對人無害，不污染環(huán)境。 目前，已經(jīng)報(bào)道的對植物線蟲有防治作用的芽孢桿菌有4個(gè)種，殺線蟲芽孢桿菌(Bacillus nematocida)、側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporas)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus f irmus)禾口蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis) (Huang 等，2005 ;Smirnova 等， 1997 ；We等，2003)。Mari等(1996)研究發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌(B. pumilus)對某些真菌具有 拮抗作用，是一種有開發(fā)前途的生防菌。目前國外主要將短小芽孢桿菌應(yīng)用于防治蔬菜的 根部病害，Akhtar等(2008)報(bào)道短小芽孢桿菌用于防治鷹嘴豆根腐病有很好的效果；近年 來，我國也有用短小芽孢桿菌防治番茄灰霉病、黃瓜菌核病菌等植物病害的報(bào)道(李桂霞 等，2009;于婷等，2009)。目前，國內(nèi)外未見短小芽孢桿菌在防治植物線蟲方面的報(bào)道。本 發(fā)明通過研究測定短小芽孢桿菌無菌發(fā)酵濾液的殺線活性、高效產(chǎn)殺線物質(zhì)發(fā)酵條件的篩 選，以期制備出高效的殺線劑，這對植物線蟲病害的生物防治具有重要的理論指導(dǎo)意義和 實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效毒殺松材線蟲的短小芽孢桿菌。本發(fā)明還要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供上述短小芽孢桿菌的用途。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下高效防治植物線蟲的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) JK-SD001，是一種從楊樹
3干部分離篩選獲得的對松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)具有毒殺作用的細(xì)菌菌 株，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏號M 209095。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)JK-SD001在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上菌落 較大，淡黃色，直徑一般5 6mm，圓形，邊緣整齊，中間有褶皺，光滑濕潤，菌體直桿狀，大小 為IX (1. 5 2. 3) μ m，周生鞭毛，芽孢橢圓形，中生。革蘭氏染色表現(xiàn)為陽性；淀粉水解 陰性；好氧；氧化酶反應(yīng)為陰性；過氧化氫酶反應(yīng)陽性。測得16SrDNA大部分序列1443bp， 具體如SEQ ID No:l所示。16SrDNA基因序列已提交GenBank，登記號GQ169781。將所 測16SrDNA序列通過BLAST比對，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。與 JK-SD001菌株相似性最高的是Bacillus pumilus,同源性達(dá)到99%。構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)， JK-SD001與Bacillus pumilus同屬一個(gè)遺傳分枝，親緣關(guān)系十分接近。Biolog公司根據(jù)細(xì)菌代謝的氧化_還原過程，于1989年推出了用于細(xì)菌鑒定的 Biolog自動(dòng)鑒定系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用細(xì)菌對95種碳源的代謝情況來鑒定菌種，即每種細(xì)菌形 成各自特有的代謝指紋圖譜，選用四唑紫作為細(xì)菌能否利用供試碳源的指示劑。與傳統(tǒng)方 法相比，Biolog系統(tǒng)具有自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化程度高、結(jié)果快速準(zhǔn)確和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。Biolog 細(xì)菌鑒定系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌快速鑒定。通過Biolog系統(tǒng)對JK-SDOOl進(jìn)行鑒定，該菌 株在鑒定板培養(yǎng)16 24h時(shí)的讀數(shù)相似值(SIM值)為0. 579，大于0. 50，符合Biolog系 統(tǒng)關(guān)于理想結(jié)果的要求，而且鑒定結(jié)果的相似性(PROB)都為99%，因此該菌株利用Biolog 系統(tǒng)，準(zhǔn)確鑒定到了種，為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。上述短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) JK-SDOOl發(fā)酵產(chǎn)物對松材線蟲 (Bursaphelenchus xylophilus)具有毒殺作用，因此能夠高效防治由松材線蟲引起的松材 線蟲病。上述短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) JK-SDOOl產(chǎn)生殺線物質(zhì)最多的最佳發(fā)酵 條件如下(1)培養(yǎng)基每IOOOmL蒸餾水，含牛肉膏3 5g，蛋白胨10 15g，pH 7.2 7. 4。(2)工藝條件為pH7. 2 7. 4，接種量為2% (ν/ν)、溫度為35 38°C、轉(zhuǎn)速為 100 200r/min，無光照下震蕩培養(yǎng)90 100小時(shí)。通過上述發(fā)酵工藝得到的發(fā)酵液經(jīng)微孔過濾得到的無菌濾液即為一種高毒的微 生物殺線劑。該殺線劑直接接觸松材線蟲即可發(fā)揮其殺線作用。有益效果(1)短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)JK-SDOOl 對松材線蟲 (Bursaphelenchusxylophilus)毒殺效果顯著，而且無污染，對環(huán)境友好，對植物線蟲的防
治具有重要意義。(2)短小芽孢桿菌JK-SDOOl培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好 的開發(fā)應(yīng)用前景。


短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) JK-SD001，已保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物 保藏中心(簡稱CCTCC)；地址武漢武漢大學(xué)；郵編430072 ；登記入冊的編號CCTCCN0 =M209095 ；保藏日期2009年5月4日。圖1為短小芽孢桿菌JK-SD001無菌發(fā)酵濾液對松材線蟲的毒殺作用蟲體形態(tài)圖。 其中，A G 松材線蟲經(jīng)拮抗細(xì)菌JK-SD001無菌發(fā)酵液處理后的形態(tài)(A B 蟲體體腔內(nèi) 組織溢縮凝結(jié)；C D 蟲體在溢縮處斷裂；E F 蟲體出現(xiàn)膨大部位向外凸起；G 蟲體體 壁破裂，整個(gè)蟲體消解)圖2為人工皮接法。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明。實(shí)施例所描述的 僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1 試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為每IOOOmL蒸餾水，含牛肉膏3g，蛋白胨10g，瓊脂 15g，pH7. 2 7. 4，將短小芽孢桿菌JK-SD001接種到該培養(yǎng)基上，25°C 38°C下培養(yǎng)24h， 獲得試管種；微生物殺線劑的制備液體培養(yǎng)基配方為每IOOOmL蒸餾水，含牛肉膏3g，蛋白胨 10g, pH7. 2 7. 4，將短小芽孢桿菌JK-SD001試管種接種到50mL液體培養(yǎng)基上，25°C和無 光照條件下以120r/min轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)24h，獲得液體種；將液體種接種到裝液比為1 2的 液體培養(yǎng)基中，接種量2% (V/V)、37°C、120r/min，無光照下震蕩發(fā)酵96小時(shí)。將發(fā)酵液過 0. 22微米孔徑濾器得到的無菌濾液。實(shí)施例2 按實(shí)施例1的方法制備出液體種，將液體種接種到裝液比為1 2的液體培養(yǎng)基 中，接種量3% (V/V)、35°C、100r/min，無光照下震蕩發(fā)酵90小時(shí)。將發(fā)酵液過0. 22微米 孔徑濾器得到的無菌濾液。實(shí)施例3 按實(shí)施例1的方法制備出液體種，將液體種接種到裝液比為1 2的液體培養(yǎng)基 中，接種量5% (V/V)、38°C、200r/min，無光照下震蕩發(fā)酵100小時(shí)。將發(fā)酵液過0. 22微米 孔徑濾器得到的無菌濾液。實(shí)施例4 短小芽孢桿菌JK-SD001無菌發(fā)酵濾液對松材線蟲的毒殺作用。供試松材線蟲的培養(yǎng)與制備供試松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)由 江蘇省有害生物預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從安徽發(fā)病黑松上分離得到并保存(編號AN19)。 培養(yǎng)前先接種灰葡萄孢(Botrytis cinerca)于PDA平板上(25°C )，待菌絲長滿平板后再 接入松材線蟲，放置25°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至灰葡萄孢菌絲消失，線蟲長滿平板。使用時(shí)采 用貝爾曼漏斗法分離線蟲，并配成約20條/ μ L的線蟲懸液。藥效測定方法將實(shí)施例1制備的ImL JK-SD001無菌發(fā)酵液分別稀釋2倍、4倍和 10倍，取ImL不同稀釋倍數(shù)的無菌發(fā)酵液注入1. 5mL小離心管中注入到1. 5mL小離心管中， 再注入100 μ L約含2000條松材線蟲的線蟲懸液。混合后置于25°C下，分別于處理后24h、 48h和72h吸取混合液在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)線蟲死亡率，計(jì)算出校正死亡率。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，以不接菌的液體培養(yǎng)基和清水處理作對照。統(tǒng)計(jì)線蟲死亡率時(shí)，搖勻小離心管后用 移液槍吸取50 μ L含有線蟲的混合液于載玻片上，由于線蟲有假死現(xiàn)象，所以不斷滴加清水于載玻片上，以保證線蟲有水潤濕并刺激假死線蟲復(fù)蘇，4h后線蟲仍僵直不動(dòng)的記錄為死亡。結(jié)果(表1)表明松材線蟲經(jīng)短小芽孢桿菌JK-SD001無菌發(fā)酵濾液原液及稀釋 2倍、4倍和10倍液處理后，死亡率為100%，蟲體消解率為100%，說明其具有高毒殺松材 線蟲的活性。表1短小芽孢桿菌JK-SD001無菌發(fā)酵濾液對松材線蟲的毒殺活性
處理濃度24h死亡率(％)24h蟲體消解率(％)原液1001002倍稀釋液1001004倍稀釋液10010010倍稀釋液100100對照CK00實(shí)施例5 短小芽孢桿菌JK-SD001的無菌發(fā)酵濾液對松材線蟲卵的影響。采用貝爾曼漏斗法收集松材線蟲，挑取一定數(shù)量的雌、雄成蟲于小培養(yǎng)皿中，加適 量清水，放置在25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待線蟲產(chǎn)出大量卵時(shí)，將培養(yǎng)皿中線蟲挑出，并用 清水反復(fù)沖洗培養(yǎng)皿，因?yàn)橄x卵可以黏附在培養(yǎng)皿底面，在沖洗線蟲時(shí)仍可保留在培養(yǎng)皿 底部。在顯微鏡下鏡檢，確保培養(yǎng)皿中無線蟲存在后，取2mL實(shí)施例1制備的無菌濾液原液 加入到小培養(yǎng)皿中，放置在25°C恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，以清水處理為對照，每個(gè)處理3個(gè) 重復(fù)。分別在處理24h、48h、72h和96h時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察卵的孵化情況，并統(tǒng)計(jì)孵化 率。表2短小芽孢桿菌JK-SD001無菌發(fā)酵液對松材線蟲卵孵化率的影響
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處理時(shí)間(h)_松材線蟲孵化率(％)
240
γ 480
720
960
CK90_結(jié)果(表2)表明經(jīng)JK-SD001無菌發(fā)酵濾液處理24h、48h、72h和96h時(shí)的卵均 未孵化，在高倍顯微鏡下可以觀察到其中部分卵已發(fā)育到二齡幼蟲期，但未沖破卵殼，而對 照清水處理卵孵化率為90%。說明無菌發(fā)酵液在一定程度上抑制了松材線蟲卵的胚胎發(fā)育 過程。實(shí)施例6 短小芽孢桿菌JK-SD001的無菌發(fā)酵濾液在黑松盆栽苗上的防效測定。以溫室內(nèi)長勢基本一致的3. 5年生黑松盆栽苗為試驗(yàn)材料，采用人工皮接法(圖 2)，用消毒解剖刀在松樹偏下的莖干上割開樹皮，深及木質(zhì)部，掀開樹皮塞入大小合適的棉
6球，并用封口膜將其包裹好，用微量進(jìn)樣器分別吸取實(shí)施例1制備的無菌濾液原液和2倍稀 釋液各5mL并分別注入漏斗中，經(jīng)過一天吸收后在黑松莖干的偏下部做一個(gè)與上部一樣的 漏斗，用微量進(jìn)樣器注入松材線蟲懸液，加樣量為5000條/株，接入線蟲后每兩天在上部的 漏斗中補(bǔ)加5mL無菌發(fā)酵液，共補(bǔ)加三次。以接無菌水的為對照，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。在接 入線蟲后第3天開始每天調(diào)查各處理松苗的發(fā)病情況，根據(jù)其發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)發(fā)病級值，計(jì) 算出各處理當(dāng)天的感病指數(shù)、感病率。 通過連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組在接種后第4天發(fā)病，而滴加無菌發(fā)酵液原液和2倍稀 釋液的的處理組分別在接種后第11天和第15天才發(fā)病，處理組的松苗發(fā)病遲于對照，而且 癥狀發(fā)展緩慢，尤其是滴加2倍稀釋液處理組的松苗表現(xiàn)更加明顯，出現(xiàn)癥狀后約15天左 右才褐變死亡，而對照組松苗感病后4-5天就迅速褐變死亡。觀察中還發(fā)現(xiàn)，在接種后第17 天，滴加無菌發(fā)酵液原液的松苗感病率為100%時(shí)，滴加2倍稀釋液的松苗感病率為60%， 顯著低于前者?？梢娡ㄟ^滴加無菌發(fā)酵液在一定程度上可以提高松苗對松材線蟲的抗性， 無菌發(fā)酵液原液和2倍稀釋液相比，2倍稀釋液更有利于提高松苗的抗性。
權(quán)利要求
一種短小芽孢桿菌JK SD001，其分類命名為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，其保藏編號是M 209095，保藏日期是2009年5月4日。
2.權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌在毒殺松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus) 中的應(yīng)用。
3.—種微生物殺線劑，其特征在于該殺線劑按如下方法制備將短小芽孢桿菌 JK-SD001接種于培養(yǎng)基中，接種量為2 5% (ν/ν)、溫度為35 38°C、轉(zhuǎn)速為100 200r/ min，無光照下震蕩培養(yǎng)90 100小時(shí)，得到的發(fā)酵液經(jīng)微孔過濾得到無菌濾液即為微生物 殺線劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物殺線劑，其特征在于所述培養(yǎng)基中，各物質(zhì)含量如下 每IOOOmL蒸餾水，含牛肉膏3 5g，蛋白胨10 15g，pH 7. 2 7. 4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種短小芽孢桿菌JK-SD001，其分類命名為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，其保藏編號是M 209095，保藏日期2009年5月4日。本發(fā)明還公開了上述短小芽孢桿菌在毒殺松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種微生物殺線劑，即將JK-SD001接種于培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)經(jīng)0.22微米孔徑濾器過濾所得。本發(fā)明的微生物殺線劑對松材線蟲(B.xylophilus)具有較高的毒力，且培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/07GK101899408SQ20101021289
公開日2010年12月1日 申請日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者任嘉紅, 葉建仁, 吳小芹, 鄧海娟 申請人:南京林業(yè)大學(xué)