專利名稱：乙肝病毒表面抗原的免疫增強(qiáng)型基因疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及乙肝病毒表面抗原的免疫增強(qiáng)型基因疫 苗，還涉及該疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
乙肝病毒(HBV)是一種嗜肝的DNA病毒。乙型肝炎是由HBV引起，主要通過血液、 體液及母嬰傳播，具有慢性攜帶狀態(tài)的傳染病。目前世界上有3億多人為慢性HBV感染，我 國約占半數(shù)。此種感染容易發(fā)展為慢性肝炎和肝硬化，少數(shù)病例可轉(zhuǎn)變?yōu)樵l(fā)性肝細(xì)胞癌， 是當(dāng)前WHO公布的人類疾病死亡原因中居第9位的疾病。大量研究證明，乙肝病毒表面抗 原(HBsAg)所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗HBSAg抗體是一種保護(hù)性抗體，具有阻斷HBV感染的能力。因 此，運用HBsAg疫苗免疫機(jī)體，能有效防止HBV感染的風(fēng)險，可以顯著降低肝炎、肝硬化和原 發(fā)性肝細(xì)胞癌等肝臟疾病的發(fā)生率。B細(xì)胞激活因子(BAFF)是B細(xì)胞存活與成熟的必需因子，為腫瘤壞死因子(TNF) 家族成員。其能夠增強(qiáng)B細(xì)胞、CD4T細(xì)胞、NK細(xì)胞的活性，使機(jī)體的免疫應(yīng)答增強(qiáng)；還可作 為T細(xì)胞激活的共刺激因子，刺激T細(xì)胞分泌干擾素-Y (IFN- Y )和白介素_2 (IL-2)，上調(diào) ⑶25(IL-2受體α鏈)表達(dá)，并以IL_2依賴方式促進(jìn)T細(xì)胞增生。免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)是由抗原、皂苷Quil A、膽固醇及磷脂混合后自發(fā)形成 的一種直徑為30 40nm的球形籠狀顆粒，具有佐劑和抗原遞呈的雙重功能，可大幅度提高 抗原的免疫原性。文獻(xiàn)報道，以ISCOM為佐劑制得的DNA疫苗誘導(dǎo)的中和抗體水平和免疫 保護(hù)力明顯高于裸DNA，可能的機(jī)制是經(jīng)ISCOM包裹的DNA能免受體內(nèi)核酸酶的降解，從而 保證該DNA在機(jī)體內(nèi)持續(xù)表達(dá)。另外，ISCOM的結(jié)構(gòu)特性使其更易于定居在淋巴組織內(nèi)，從 而有利于抗原遞呈細(xì)胞的吞噬。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種HBsAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗；目的 之二在于提供所述HBsAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案UHBsAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗，該疫苗是由HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真 核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂組成的ISCOM型疫苗。進(jìn)一步，所述HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體是在含有內(nèi)部核糖體進(jìn) 入位點(IRES)的雙基因共表達(dá)真核載體的IRES上游和下游分別插入HBsAg全長cDNA和 BAFF 全長 cDNA ；進(jìn)一步，所述HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵 磷脂的質(zhì)量比為5 10 1 1。2、所述HBsAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的制備方法，包括以下步驟a、HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體的構(gòu)建將HBsAg全長cDNA插入含有
3IRES的雙基因共表達(dá)真核載體的IRES上游，再將BAFF全長cDNA插入該真核載體的IRES 下游，即得HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體；b、ISCOM的制備將HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體用磷酸鹽緩沖液 (PBS)溶解后，加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBsAg和 BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體0. 5mg、皂苷Quil A lmg、膽固醇0. Img和卵磷脂0. Img, 冰浴超聲處理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的ISC0M。進(jìn)一步，所述步驟a的具體方法為al、HBsAg全長cDNA的克隆提取HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，再以該總cDNA為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列為上下游引物，PCR 擴(kuò)增兩端分別帶有Pst I和EcoR I酶切位點的HBsAg全長cDNA，PCR條件為94°C預(yù)變性 3分鐘，然后94°C變性1分鐘、58 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個循環(huán)，最后72°C延 伸7分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆入pGEM-T Easy載體，得重組載體pT_HBsAg ；a2、BAFF全長cDNA的克隆提取人脾臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該總 cDNA為模板，以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列為上下游引物，PCR擴(kuò)增兩端分別帶 有BamH I和Sal I酶切位點的B細(xì)胞激活因子全長cDNA，PCR條件為94°C預(yù)變性5分鐘； 然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分 鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆入pGEM-T Easy載體，得重組載體pT_BAFF ；a3、重組真核載體的構(gòu)建自步驟al所得重組載體pT-HBsAg中用Pst I和EcoR I 雙酶切出HBsAg全長cDNA，經(jīng)純化后與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的真核載體pStar連 接，得重組載體pStar-HBsAg ；再自步驟a2所得重組載體pT_BAFF中用BamH I和Sal I雙 酶切出BAFF全長cDNA，經(jīng)純化后與同樣用BamH I和Sal I雙酶切的重組載體pStar-HBsAg 連接，即得HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體pStar-HBsAg-IRES_BAFF。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的HBsAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗能夠顯著增強(qiáng) HBsAg的免疫原性，促進(jìn)抗HBSAg抗體的生成，且制備方法簡單、成本低廉，在抗HBV感染領(lǐng) 域具有良好的應(yīng)用前景。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn) 一步的詳細(xì)描述，其中圖1為PCR擴(kuò)增HBsAg全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；圖2為PCR擴(kuò)增BAFF全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；圖3為透射電鏡檢測HBsAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的結(jié)構(gòu)；圖4為免疫組織化學(xué)檢測HBsAg的表達(dá)；圖5為ELISA法測定血清抗體效價。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
一、HBsAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的制備及鑒定1、HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體的構(gòu)建(1) HBsAg 全長 cDNA 的克隆根據(jù)GenBank登錄號為NP_647605的HBsAg基因序列，設(shè)計并合成如下引物以PCR 擴(kuò)增兩端帶有酶切位點的 HBsAg全長 cDNA :F1 5‘-aatcttgcagatgcaactttttcacctctgc-3‘ (SEQ ID No. 3),下劃線部分為 Pst I 酶切位點R1 :5，tacgaattcctaacattgagattcccgagat tg-3’(SEQ ID No. 4)，下劃線部分為EcoR I酶切位點；分離HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟細(xì)胞，用 RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2 X IO7個/mL，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，用總 RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA ；將所得細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA，再以該總cDNA為模 板、Fl和Rl為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性1 分鐘、58 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊 脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與PGEM-TEasy載體連接，連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，委 托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序驗證，將插入了 HBcAg全長cDNA序列(SEQ ID No. 1)的陽性克隆質(zhì)粒命名為pT-HBcAg ；PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳 道為PCR產(chǎn)物，可見PCR產(chǎn)物在約650bp處呈單一特異性條帶，與目的片段大小相符。(2) BAFF 全長 cDNA 的克隆根據(jù)GenBank登錄號為NM_006573的BAFF基因序列，設(shè)計并合成如下引物以PCR 擴(kuò)增兩端帶有酶切位點的BAFF全長cDNA 上游引物F2 :5’ -RatcRRatccatRRatRactccaca gaaagg-3，(SEQ ID No. 5)，下劃線部分為 BamH I 酶切位點；下游引物 R2 :5’ -acgctcgcgac tcacagcagtttcaatgcac-3‘ (SEQ ID No. 6)，下劃線部分為 Sal I 酶切位點；按 Trizol 試劑 盒說明書提取人脾臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該總cDNA為模板，采用上下游引 物F2和R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火 50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳 鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與PGEM-T Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，委托上海生工生 物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序驗證，將插入了 BAFF全長cDNA序列(SEQ ID No. 2)的陽性 克隆質(zhì)粒命名為重組載體pT-BAFF。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳 道為PCR產(chǎn)物，可見PCR產(chǎn)物在約850bp處呈單一特異性條帶，與目的片段大小相符。(3) HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體的構(gòu)建根據(jù)HBsAg和BAFF全長cDNA兩端所設(shè)計的酶切位點，先將HBsAg全長cDNA插入 含有IRES的雙基因共表達(dá)真核載體pStar的IRES上游，再將BAFF全長cDNA插入pStar載 體的IRES下游。具體方法為先將重組載體pT-HBsAg用Pst I和EcoR I雙酶切，雙酶切產(chǎn) 物經(jīng)凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經(jīng)Pst I和EcoR I雙酶切的真核載體pStar 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克 隆，提取質(zhì)粒，Pst I和EcoR I雙酶切鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為重組載體pStar-HBsAg; 再將重組載體pT-BAFF用BamH I和Sal I雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切的重組載體pStar-HBsAg連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，BamH I 和Sal I雙酶切鑒定，陽性克隆質(zhì)粒即為HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體，將其 命名為 pStar-HBsAg-IRES-BAFF。2、ISCOM 的制備將HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體pStar-HBsAg-IRES-BAFF用PBS溶 解后，加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBsAg和BAFF雙基因 共表達(dá)重組真核載體0.5mg、皂苷Quil A lmg、膽固醇0. Img和卵磷脂0. lmg，冰浴超聲處理 使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的ISC0M，也即HBsAg的免疫 增強(qiáng)型基因疫苗。3、透射電鏡分析將新鮮制備的ISCOM滴于200目銅網(wǎng)上，吸附3分鐘，吸水紙吸干，晾干30秒，以 濃度為(w/v)的水溶性醋酸鈾負(fù)染30秒，吸水紙吸干，晾干30秒，80kV透射電鏡觀察。 結(jié)果如圖3所示，所得ISCOM呈大小均一的近圓形顆粒，絕大多數(shù)顆粒長徑小于25nm。二、HBsAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的體內(nèi)免疫及檢測將雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為實驗組、對照組和空白對照組，每組10只；實驗組以 本發(fā)明的HBsAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗為免疫原，對照組以HBsAg基因疫苗(HBsAg單基因 重組表達(dá)載體的ISC0M)為免疫原，空白對照組以PBS為免疫原；三組小鼠按100 μ L的劑量 行雙側(cè)股四頭肌免疫，每隔2周免疫1次，連續(xù)免疫3次；末次免疫后第14天取股四頭肌組 織，采用免疫組化檢測HBsAg的表達(dá)；同時尾靜脈采血，采用間接ELISA法測定血清抗體效 價，Ρ/Ν彡2判為陽性。(1)免疫組化檢測HBsAg的表達(dá)取小鼠股四頭肌組織(0. 5cmX0. 5cmX0. 5cm)置中性福爾馬林溶液中，4°C固定 12小時，脫水后石蠟包埋、切片(5mm)，將蠟切片脫蠟至水，用體積分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫溶 液室溫孵育5 10分鐘，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，再用體積分?jǐn)?shù)為5 10%的正常山 羊血清的PBS稀釋液封閉，室溫孵育10分鐘，傾去封閉液，滴加適當(dāng)比例稀釋的抗HBSAg抗 體工作液，37°C孵育1 2小時，PBS沖洗，再滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37°C孵 育10 30分鐘，PBS沖洗，再滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37°C孵育10 30分鐘，PBS沖洗，DAB顯色，自來水充分沖洗，復(fù)染，封片，置顯微鏡下觀察，拍片。結(jié)果如圖4所示，A為實驗組，B為對照組，C為空白對照組，可見HBsAg的免疫增 強(qiáng)型基因疫苗能在肌肉組織中高效表達(dá)HBsAg，而空白對照組中無抗原表達(dá)。(2) ELISA法測定血清抗體效價在96孔板中，每孔加入用濃度為0. 05mol/L、pH為9. 0的碳酸鹽緩沖液稀釋至濃 度為1 μ g/mL的HBsAg溶液0. lmL，4°C包被過夜，次日棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌后， 再加入適當(dāng)比例稀釋的血清樣品0. lmL，37°C孵育1小時，用洗滌緩沖液洗滌后，再加入新 鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0. lmL，37°C孵育0. 5 1小時，用洗滌緩沖液洗滌后，加入TMB底物溶液 0. lmL，37°C反應(yīng)10 30分鐘，加入濃度為2mol/L的硫酸溶液0. 05mL終止反應(yīng)。結(jié)果如圖5所示，實驗組的血清抗體平均效價為16 1，而對照組的血清抗體平均 效價為4 1，說明本發(fā)明的HBsAg免疫增強(qiáng)型基因疫苗能夠顯著增強(qiáng)HBsAg的免疫原性，促進(jìn)抗HBsAg抗體的產(chǎn)生。 最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
乙肝病毒表面抗原的免疫增強(qiáng)型基因疫苗，其特征在于該疫苗是由乙肝病毒表面抗原即HBsAg和B細(xì)胞激活因子即BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂組成的免疫刺激復(fù)合物型疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述乙肝病毒表面抗原的免疫增強(qiáng)型基因疫苗，其特征在于所述 HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體是在含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點即IRES的雙基因 共表達(dá)真核載體的IRES上游和下游分別插入HBsAg全長cDNA和BAFF全長cDNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述乙肝病毒表面抗原的免疫增強(qiáng)型基因疫苗，其特征在于 所述HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂的質(zhì)量比為 5 10 1 1。
4.權(quán)利要求1所述乙肝病毒表面抗原的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的制備方法，其特征在 于包括以下步驟a、HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體的構(gòu)建將HBsAg全長cDNA插入含有IRES 的雙基因共表達(dá)真核載體的IRES上游，再將BAFF全長cDNA插入該真核載體的IRES下游， 即得HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體；b、免疫刺激復(fù)合物的制備將HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體用磷酸鹽緩沖 液即PBS溶解后，加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBsAg和 BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體0. 5mg、皂苷Quil A lmg、膽固醇0. lmg和卵磷脂0. lmg， 冰浴超聲處理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的免疫刺激 復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述乙肝病毒表面抗原的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的制備方法，其特征 在于所述步驟a的具體方法為al、HBsAg全長cDNA的克隆提取乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，再以該總cDNA為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4所示序列為上下游引物，PCR擴(kuò) 增兩端分別帶有Pst I和EcoR I酶切位點的HBsAg全長cDNA，PCR條件為94°C預(yù)變性3 分鐘，然后94°C變性1分鐘、58 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個循環(huán)，最后72°C延 伸7分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆入pGEM-T Easy載體，得重組載體pT_HBsAg ；a2、BAFF全長cDNA的克隆提取人脾臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該總cDNA 為模板，以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列為上下游引物，PCR擴(kuò)增兩端分別帶有 BamH I和Sal I酶切位點的BAFF全長cDNA，PCR條件為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變 性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物 經(jīng)純化后克隆入pGEM-T Easy載體，得重組載體pT_BAFF ；a3、重組真核載體的構(gòu)建自步驟al所得重組載體pT-HBsAg中用Pst I和EcoR I雙 酶切出HBsAg全長cDNA，經(jīng)純化后與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的真核載體pStar連 接，得重組載體pStar-HBsAg ；再自步驟a2所得重組載體pT_BAFF中用BamH I和Sal I雙 酶切出BAFF全長cDNA，經(jīng)純化后與同樣用BamH I和Sal I雙酶切的重組載體pStar-HBsAg 連接，即得HBsAg和BAFF雙基因共表達(dá)重組真核載體pStar-HBsAg-IRES_BAFF。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的免疫增強(qiáng)型基因疫苗，該疫苗是由HBsAg和B細(xì)胞激活因子(BAFF)雙基因共表達(dá)重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂組成的免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)型疫苗，能夠顯著增強(qiáng)HBsAg的免疫原性，促進(jìn)抗HBsAg抗體的生成，在抗乙肝病毒感染領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景；本發(fā)明還涉及該疫苗的制備方法，操作簡便，成本低。
文檔編號C12N15/79GK101884792SQ20101021319
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者吳玉章, 楊曌 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)