專利名稱：乙肝病毒核心抗原的免疫增強(qiáng)型基因疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種乙肝病毒核心抗原的免疫增強(qiáng)型基 因疫苗，還涉及該疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
乙肝病毒(HBV)是一種嗜肝的DNA病毒。乙型肝炎是由HBV引起，主要通過(guò)血液、 體液及母嬰傳播，具有慢性攜帶狀態(tài)的傳染病。目前世界上有3億多人為慢性HBV感染，我 國(guó)約占半數(shù)。此種感染容易發(fā)展為慢性肝炎和肝硬化，少數(shù)病例可轉(zhuǎn)變?yōu)樵l(fā)性肝細(xì)胞癌， 是當(dāng)前WHO公布的人類疾病死亡原因中居第9位的疾病。為此，尋求理想的抗HBV藥物一 直是亟待解決的研究課題。目前，慢性HBV感染主要采用抗病毒藥物進(jìn)行治療，應(yīng)用的抗病 毒藥物主要有干擾素和核苷類藥物如拉米夫定等，其中，干擾素的適應(yīng)癥有限，療效較差， 不良反應(yīng)發(fā)生率較高，且價(jià)格昂貴；拉米夫定作為逆轉(zhuǎn)錄酶的強(qiáng)抑制劑，在控制慢性HBV感 染方面具有確切的近期療效，且有良好的耐受性，但其不能清除肝細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的來(lái)源， 長(zhǎng)期用藥又存在耐藥問(wèn)題。因此，積極尋求更為有效的抗病毒藥物仍為當(dāng)務(wù)之急。CD8+T細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要組成部分，在針對(duì)病毒、細(xì)菌和真菌等病原性微 生物以及惡性腫瘤等的免疫監(jiān)視、免疫防御以及免疫治療過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。HBV感染 的慢性化主要是由于機(jī)體對(duì)HBV的免疫應(yīng)答特別是細(xì)胞免疫應(yīng)答不能清除病原，從而導(dǎo)致 感染的持續(xù)存在。在急性HBV感染時(shí)，機(jī)體存在大量的針對(duì)HBV多個(gè)抗原表位的多特異性、 多克隆的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，而在慢性HBV感染時(shí)，這些CTL應(yīng)答非常微弱甚至檢 測(cè)不到。因此，采取恰當(dāng)?shù)拿庖叻绞?，打破機(jī)體對(duì)HBV的免疫耐受，重建活躍的免疫應(yīng)答，有 望清除病毒，終止慢性HBV感染。乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)是HBV的一種結(jié)構(gòu)蛋白，是機(jī)體CTL識(shí)別和攻擊 HBV感染細(xì)胞的主要靶抗原。因此，增強(qiáng)HBcAg特異性的CTL應(yīng)答，有望終止慢性HBV感染。 但是，HBV的慢性患者存在免疫應(yīng)答低，特異性細(xì)胞免疫激活不足，外周免疫耐受等問(wèn)題，在 設(shè)計(jì)治療性疫苗時(shí)需增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)HBV的識(shí)別能力以激發(fā)有力的特異性細(xì)胞免疫。0X40配體(0X40L)屬腫瘤壞死因子(TNF)家族成員，為II型跨膜糖蛋白。0X40/ 0X40L作為一對(duì)重要的免疫共刺激分子，為T、B細(xì)胞的激活提供了重要的第二信號(hào)。它們 的相互作用能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的活化、增殖、遷移并延長(zhǎng)其壽命，還能促進(jìn)生發(fā)中心的形成 和樹突狀細(xì)胞的分化成熟。免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)是由抗原、皂苷Quil A、膽固醇及磷脂混合后自發(fā)形成 的一種直徑為30 40nm的球形籠狀顆粒，具有佐劑和抗原遞呈的雙重功能，可大幅度提高 抗原的免疫原性。文獻(xiàn)報(bào)道，以ISCOM為佐劑制得的DNA疫苗誘導(dǎo)的中和抗體水平和免疫 保護(hù)力明顯高于裸DNA，可能的機(jī)制是經(jīng)ISCOM包裹的DNA能免受體內(nèi)核酸酶的降解，從而 保證該DNA在機(jī)體內(nèi)持續(xù)表達(dá)。另外，ISCOM的結(jié)構(gòu)特性使其更易于定居在淋巴組織內(nèi)，從 而有利于抗原遞呈細(xì)胞的吞噬。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種HBcAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗；目的 之二在于提供所述HBcAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案1、HBcAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗，該疫苗是由HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組 真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂組成的ISCOM型疫苗。進(jìn)一步，所述HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體是在含有內(nèi)部核糖體進(jìn) 入位點(diǎn)(IRES)的雙基因共表達(dá)真核載體的IRES上游和下游分別插入HBcAg全長(zhǎng)cDNA和 0X40L 全長(zhǎng) cDNA ；進(jìn)一步，所述HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及 卵磷脂的質(zhì)量比為5 10 1 1。2、所述HBcAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的制備方法，包括以下步驟a,HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體的構(gòu)建將HBcAg全長(zhǎng)cDNA插入含 有IRES的雙基因共表達(dá)真核載體的IRES上游，再將0X40L全長(zhǎng)cDNA插入該真核載體的 IRES下游，即得HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體；b、ISCOM的制備將HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體用磷酸鹽緩沖 液(PBS)溶解后，加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBcAg和 0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體0. 5mg、皂苷Quil Almg、膽固醇0. Img和卵磷脂0. Img, 冰浴超聲處理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的ISC0M。進(jìn)一步，所述步驟a的具體方法為al、HBcAg全長(zhǎng)cDNA的克隆提取HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到總 cDNA，再以該總cDNA為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列為上下游引物，PCR 擴(kuò)增兩端分別帶有Pst I和EcoR I酶切位點(diǎn)的HBcAg全長(zhǎng)cDNA，PCR條件為94°C預(yù)變性 5分鐘；然后94°C變性50秒，58 °C退火50秒，72 °C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延 伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆入PGEM-T Easy載體，得重組載體pT_HBcAg ；a2、0X40L全長(zhǎng)cDNA的克隆提取人脾臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該 總cDNA為模板，以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列為上下游引物，PCR擴(kuò)增兩端分 別帶有BamH I和Sal I酶切位點(diǎn)的B細(xì)胞激活因子全長(zhǎng)cDNA，PCR條件為94°C預(yù)變性5 分鐘 ’然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸 10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆入PGEM-T Easy載體，得重組載體pT_0X40L ；a3、重組真核載體的構(gòu)建自步驟al所得重組載體pT-HBcAg中用Pst I和 EcoR I雙酶切出HBcAg全長(zhǎng)cDNA，經(jīng)純化后與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的真核 載體pStar連接，得重組載體pStar-HBcAg ；再自步驟a2所得重組載體pT_0X40L中 用BamH I和Sal I雙酶切出0X40L全長(zhǎng)cDNA，經(jīng)純化后與同樣用BamH I和Sal I雙 酶切的重組載體pStar-HBcAg連接，即得HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體 pStar-HBcAg-IRES-0X40Lo本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的HBcAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗能夠促進(jìn)HBcAg 特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，高效誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的抗病毒復(fù)制能力，且制備方法簡(jiǎn)單、成本低 廉，在抗病毒免疫治療領(lǐng)域有著良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn) 一步的詳細(xì)描述，其中 圖1為PCR擴(kuò)增HBcAg全長(zhǎng)cDNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；圖2為PCR擴(kuò)增0X40L全長(zhǎng)cDNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；圖3為透射電鏡檢測(cè)HBcAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的結(jié)構(gòu)；圖4為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)法檢測(cè)HBcAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗激發(fā)T細(xì)胞 分泌干擾素_ Y (IFN- γ )的能力；圖5為HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT活性檢測(cè)結(jié)果；圖6為HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBV DNA抑制率檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、HBcAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的制備1、HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體的構(gòu)建(1) HBcAg 全長(zhǎng) cDNA 的克隆根據(jù)GenBank登錄號(hào)為NC_003977. 1的HBcAg基因序列，設(shè)計(jì)并合成如下引物以 PCR擴(kuò)增兩端帶有酶切位點(diǎn)的HBcAg全長(zhǎng)cDNA 上游引物Fl 5‘-aatctgcagggcatggacatcg acccttat-3，(SEQ ID No. 3)，下劃線部分為 Pst I 酶切位點(diǎn)；下游引物 Rl :5，tacgaattcag ttccccaccttatgagtc-3’ (SEQ ID No. 4)，下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn)；分離HBV轉(zhuǎn)基因 小鼠的肝臟細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2 X IO7個(gè)/mL，收集細(xì)胞， PBS洗滌3次，用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA ；將所得細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA， 再以該總cDNA為模板、Fl和Rl為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94°C預(yù)變性3分 鐘，然后94°C變性1分鐘、58°C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸 7分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與pGEM-T Easy 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng) 性克隆，提取質(zhì)粒，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證，將插入了 HBcAg全 長(zhǎng)cDNA序列(SEQ ID No. 1)的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pT_HBcAg ；PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳 道為PCR產(chǎn)物，可見(jiàn)PCR產(chǎn)物在約550bp處呈單一特異性條帶，與目的片段大小相符。(2) 0X40L 全長(zhǎng) cDNA 的克隆根據(jù)GenBank登錄號(hào)為NM_003326的0X40L基因序列，設(shè)計(jì)并合成如下引物以PCR 擴(kuò)增兩端帶有酶切位點(diǎn)的0X40L全長(zhǎng)cDNA 上游引物F2 5，-Ratc-RRatccatRRaaaRRRtcca accc-3，(SEQ ID No. 5)，下劃線部分為 BamH I 酶切位點(diǎn)；下游引物 R2 :5’ acgcgtcgactcaa aggacacagaattcacca-3，(SEQ ID No. 6)，下劃線部分為 Sal I 酶切位點(diǎn)；按 Trizol 試劑盒 說(shuō)明書提取人脾臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該總cDNA為模板，采用上下游引物
5F2和R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR總體系為50 μ L，PCR條件為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變 性50秒，58 °C退火50秒，72 °C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn) 物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與PGEM-T Easy載體連接，連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，提取 質(zhì)粒，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證，將插入了 0X40L全長(zhǎng)cDNA序列 (SEQ ID No. 2)的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為PT-0X40L。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳 道為PCR產(chǎn)物，可見(jiàn)PCR產(chǎn)物在約550bp處呈單一特異性條帶，與目的片段大小相符。(3) HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體的構(gòu)建根據(jù)HBcAg和0X40L全長(zhǎng)cDNA兩端所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，先將HBcAg全長(zhǎng)cDNA插入 含有IRES的雙基因共表達(dá)真核載體pStar的IRES上游，再將0X40L全長(zhǎng)cDNA插入pStar載 體的IRES下游。具體方法為先將重組載體pT-HBcAg用PstI和EcoR I雙酶切，雙酶切產(chǎn) 物經(jīng)凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經(jīng)Pst I和EcoR I雙酶切的真核載體pStar 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克 隆，提取質(zhì)粒，Pst I和EcoR I雙酶切鑒定，將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為重組載體pStar-HBcAg; 再將重組載體PT-0X40L用BamH I和Sal I雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒切膠回 收純化后，與同樣經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切的重組載體pStar-HBcAg連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，BamH I 和Sal I雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒即為HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體，將其 命名為 pStar-HBcAg-IRES-0X40L。2、ISCOM 的制備將HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體pStar-HBcAg-IRES_0X40L用PBS 溶解后，加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBcAg和0X40L雙 基因共表達(dá)重組真核載體0. 5mg、皂苷Quil A lmg、膽固醇0. Img和卵磷脂0. lmg，冰浴超 聲處理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的ISC0M，也即HBcAg 的免疫增強(qiáng)型基因疫苗。3、透射電鏡分析將新鮮制備的ISCOM滴于200目銅網(wǎng)上，吸附3分鐘，吸水紙吸干，晾干30秒，以 濃度為(w/v)的水溶性醋酸鈾負(fù)染30秒，吸水紙吸干，晾干30秒，80kV透射電鏡觀察。 結(jié)果如圖3所示，所得ISCOM呈大小均一的近圓形顆粒，絕大多數(shù)顆粒長(zhǎng)徑小于25nm。二、HBcAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的體內(nèi)免疫及檢測(cè)將雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組10只；實(shí)驗(yàn)組以 本發(fā)明的HBcAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗為免疫原，對(duì)照組以HBcAg基因疫苗(HBcAg單基因 重組表達(dá)載體的ISC0M)為免疫原，空白對(duì)照組以PBS為免疫原；三組小鼠按100 μ L的劑量 行腹腔免疫，每隔2周免疫1次，連續(xù)免疫3次。1、ELISP0T法檢測(cè)HBcAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗激發(fā)CTL分泌IFN- γ的能力末次免疫后1周，斷頸處死小鼠，在無(wú)菌條件下取脾臟，用100目篩網(wǎng)碾磨，收集細(xì) 胞懸液，用聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞，用含有質(zhì)量百分濃 度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為IX 106個(gè)/mL，作為效應(yīng)細(xì)胞；采用ELISP0T檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書操作在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入 體積百分濃度為70%的乙醇100μ L，室溫放置10分鐘，PBS洗滌，再加入IFN-γ捕獲抗體 (稀釋度為1 100) 100yL，溫度4°C孵育過(guò)夜，PBS洗滌，再加入質(zhì)量百分濃度為2%的脫 脂奶粉100 μ L，室溫封閉2小時(shí)，PBS洗滌，再加入效應(yīng)細(xì)胞100 μ L，溫度37°C孵育48小時(shí)， PBST (即含有質(zhì)量百分濃度為0. 的吐溫20的PBS)洗滌，再加入生物素標(biāo)記的抗IFN-γ 抗體(稀釋度為1 100) 100 μ L，溫度37°C孵育1.5小時(shí)，PBST洗滌，再加入鏈霉親和素 標(biāo)記的堿性磷酸酶(稀釋度為1 5000) 100 μ L，溫度37°C孵育1小時(shí)，PBST洗滌，拍干培 養(yǎng)板，再加入即用型BCIP/NBT底物反應(yīng)液100 μ L，室溫避光顯色2 10分鐘至斑點(diǎn)形成， 用蒸餾水終止反應(yīng)，干燥后檢測(cè)斑點(diǎn)數(shù)；各組斑點(diǎn)數(shù)以3個(gè)復(fù)孔的均值表示。結(jié)果見(jiàn)圖4，實(shí)驗(yàn)組的斑點(diǎn)數(shù)明顯高于對(duì)照組和空白對(duì)照組，表明本發(fā)明的HBcAg 的免疫增強(qiáng)型基因疫苗具有良好的免疫原性，能夠有效激發(fā)CTL分泌IFN- γ。2、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT活性檢測(cè)末次免疫后1周，斷頸處死小鼠，取眼眶靜脈血，用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清ALT活 性。結(jié)果見(jiàn)圖5，實(shí)驗(yàn)組的血清ALT活性明顯高于對(duì)照組和空白對(duì)照組，表明本發(fā)明的 HBcAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗能夠有效激發(fā)CTL產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，殺傷HBV感染肝細(xì)胞，從 而導(dǎo)致血清ALT活性明顯升高。3、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBV DNA抑制率檢測(cè)末次免疫后1周，斷頸處死小鼠，取眼眶靜脈血，用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清HBV DNA抑制率。結(jié)果見(jiàn)圖6，實(shí)驗(yàn)組的血清HBV DNA抑制率明顯高于對(duì)照組和空白對(duì)照組，表明本 發(fā)明的HBcAg的免疫增強(qiáng)型基因疫苗能夠有效抑制HBV的復(fù)制，顯著降低血清HBV DNA載量。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參 照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
乙肝病毒核心抗原的免疫增強(qiáng)型基因疫苗，其特征在于該疫苗是由乙肝病毒核心抗原即HBcAg和OX40配體即OX40L雙基因共表達(dá)重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂組成的免疫刺激復(fù)合物型疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述乙肝病毒核心抗原的免疫增強(qiáng)型基因疫苗，其特征在于所述 HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體是在含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)即IRES的雙基 因共表達(dá)真核載體的IRES上游和下游分別插入HBcAg全長(zhǎng)cDNA和T細(xì)胞激活因子全長(zhǎng) cDNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述乙肝病毒核心抗原的免疫增強(qiáng)型基因疫苗，其特征在于所 述HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂的質(zhì)量比為 5 10 1 1。
4.權(quán)利要求1所述乙肝病毒核心抗原的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的制備方法，其特征在 于包括以下步驟a、HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體的構(gòu)建將HBcAg全長(zhǎng)cDNA插入含有 IRES的雙基因共表達(dá)真核載體的IRES上游，再將0X40L全長(zhǎng)cDNA插入該真核載體的IRES 下游，即得HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體；b、免疫刺激復(fù)合物的制備將HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體用磷酸鹽緩 沖液即PBS溶解后，加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBcAg 和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體0. 5mg、皂苷Quil A lmg、膽固醇0. lmg和卵磷脂 0. lmg，冰浴超聲處理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的免 疫刺激復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述乙肝病毒核心抗原的免疫增強(qiáng)型基因疫苗的制備方法，其特征 在于所述步驟a的具體方法為al、HBcAg全長(zhǎng)cDNA的克隆提取乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到總 cDNA，再以該總cDNA為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列為上下游引物，PCR 擴(kuò)增兩端分別帶有Pst I和EcoR I酶切位點(diǎn)的HBcAg全長(zhǎng)cDNA，PCR條件為94°C預(yù)變性 5分鐘；然后94°C變性50秒，58 °C退火50秒，72 °C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延 伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆入pGEM-T Easy載體，得重組載體pT_HBcAg ；a2、0X40L全長(zhǎng)cDNA的克隆提取人脾臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該總 cDNA為模板，以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列為上下游引物，PCR擴(kuò)增兩端分別帶 有BamH I和Sal I酶切位點(diǎn)的T細(xì)胞激活因子全長(zhǎng)cDNA，PCR條件為94°C預(yù)變性5分鐘； 然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分 鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆入pGEM-T Easy載體，得重組載體pT_0X40L ；a3、重組真核載體的構(gòu)建自步驟al所得重組載體pT-HBcAg中用Pst I和EcoR I雙酶 切出HBcAg全長(zhǎng)cDNA，經(jīng)純化后與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的真核載體pStar連接， 得重組載體pStar-HBcAg ；再自步驟a2所得重組載體pT_0X40L中用BamH I和Sal I雙酶 切出0X40L全長(zhǎng)cDNA，經(jīng)純化后與同樣用BamH I和Sail雙酶切的重組載體pStar-HBcAg 連接，即得HBcAg和0X40L雙基因共表達(dá)重組真核載體pStar-HBcAg-IRES_0X40L。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的免疫增強(qiáng)型基因疫苗，該疫苗是由HBcAg和OX40配體(OX40L)雙基因共表達(dá)重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂組成的免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)型疫苗，能夠促進(jìn)HBcAg特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，高效誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的抗病毒復(fù)制能力，在抗乙肝病毒感染領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景；本發(fā)明還涉及該疫苗的制備方法，操作簡(jiǎn)便，成本低。
文檔編號(hào)C12N15/79GK101884793SQ20101021320
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者吳玉章, 楊曌 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)