專利名稱：：一種基于dna分子標(biāo)簽技術(shù)和dna不完全打斷策略的pcr測序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及核酸測序
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是PCR測序
技術(shù)領(lǐng)域：
。另一方面，本發(fā)明還涉及PCR-index/barcode
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的方法特別適用于第二代測序技術(shù)，尤其是第二代測序技術(shù)中的Pair-end測序技術(shù)，還可以用于HLA基因分型。
背景技術(shù)：
：PCR測序(PCRsequencing)方法是通過PCR的方法得到目的基因DNA片段，再通過對所得到的目的基因DNA片段進(jìn)行DNA序列檢測，從而得到目的基因DNA序列信息的一種技術(shù)，其具有直觀、準(zhǔn)確的特點，長久以來廣泛應(yīng)用于基因突變檢測以及基因分型等領(lǐng)域。PCR-index/barcode技術(shù)，通過在PCR引物的5，末端添加引物標(biāo)簽(primerindex)序列，可在PCR過程中對每個樣本引入獨特的引物標(biāo)簽，使樣本在利用第二代DNA測序技術(shù)(以IlluminaGA,Roche454,ABISolid等測序儀為代表的可大規(guī)模，高通量，單分子測序的測序儀)檢測過程中，除PCR環(huán)節(jié)必須逐個樣本處理外，其它實驗環(huán)節(jié)可把多個樣本混在一起同時處理，最終每個樣本的檢測結(jié)果可以通過其獨特的引物標(biāo)簽序列找回；該方法具有成本低，通量大和可同時檢測大量樣本的多個不同基因位點的特點。第二代DNA測序技術(shù)與第一代(Sanger法)DNA測序技術(shù)相比，其可連續(xù)測序的長度較短。以IlluminaGA(Illumina公司的GenomeAnalyzer測序儀，簡稱IlluminaGA)為例，當(dāng)前IlluminaGA的最大測序長度為200bp，當(dāng)PCR產(chǎn)物的長度大于200bp，利用IlluminaGA測序，直接采取PCR測序的方法，不能把整個PCR產(chǎn)物測通，得不到被檢測PCR產(chǎn)物的全部DNA序列信息的。短的測序讀長限制了第二代測序技術(shù)的應(yīng)用，除了通過逐步改進(jìn)測序技術(shù)來獲得更長的實際測序讀長外，開發(fā)可克服第二代DNA測序儀現(xiàn)有測序讀長在PCR測序應(yīng)用領(lǐng)域不足的新技術(shù)也成為當(dāng)務(wù)之急。
發(fā)明內(nèi)容當(dāng)前利用第二代測序技術(shù)，對大量樣本中的特定基因相關(guān)序列同時進(jìn)行測序分析時，一般會采用PCR測序的策略，直接利用引物標(biāo)簽+二代測序技術(shù)的組合。當(dāng)所用測序儀的測長可以覆蓋整個PCR產(chǎn)物的長度時，上述技術(shù)就足夠滿足要求了。但當(dāng)所用測序儀的測長不夠覆蓋整個PCR產(chǎn)物的長度時，要么更換具有更長測長的第二代測序儀(如用Roche454GS-FLX)替代IlluminaGA，如果測長還不滿足要求的話，只能犧牲成本和通量，改用第一代測序儀?，F(xiàn)實情況是，IlluminaGA具有超高測序通量，但其測長才200bp；Roche454GS-FLX的測長雖然可以達(dá)到500bp，但其測序成本較高，通量較?。坏谝淮鷾y序儀的測長雖然可以達(dá)到IOOObp以上，但其通量和成本沒法和第二代測序儀相比。有沒有能夠兼顧成本和通量，能提高測序儀可以測通的PCR產(chǎn)物長度的技術(shù)呢？本專利中的引物標(biāo)簽+DNA不完全打斷策略+二代測序技術(shù)的組合能在充分利用第二代測序儀高通量、低成本特點的同時，使測序儀能夠測通的PCR產(chǎn)物長度達(dá)到測序儀本身測長以上，大大擴(kuò)大了其適用范圍。其中，本發(fā)明的所采用的二代測序技術(shù)包括第二代測序技術(shù)中的Pair-end測序技術(shù)，以及針對PCR模板有DNA參考序列(DNAReferenceSequence)的PCR測序技術(shù)。本發(fā)明提供了用于PCR測序的方法，通過所述方法減少了自身測序讀長較短造成的限制，擴(kuò)大了第二代DNA測序技術(shù)在PCR測序應(yīng)用領(lǐng)域的應(yīng)用。引物標(biāo)簽的設(shè)計根據(jù)所應(yīng)用的實驗平臺不同而不同，考慮IlluminaGA測序平臺本身的特點，本發(fā)明在設(shè)計引物標(biāo)簽時主要考慮了以下幾點1引物標(biāo)簽序列中避免3個以上(包括3個)單堿基重復(fù)序列，2:所有引物標(biāo)簽的同一位點中堿基A和堿基C的總含量占所有堿基含量的30%-70%之間，3引物標(biāo)簽序列本身的GC含量在40-60%之間，4引物標(biāo)簽之間序列差異度大于4個堿基，5引物標(biāo)簽序列中避免出現(xiàn)與IlluminaGA測序引物相似度高的序列，6減少引物標(biāo)簽序列添加到PCR引物上后，對PCR引物造成的嚴(yán)重發(fā)卡(hairpin)，二聚體(dimer)情況的出現(xiàn)。本發(fā)明通過PCR反應(yīng)在PCR產(chǎn)物兩端各引入一個引物標(biāo)簽(引物標(biāo)簽序列可以相同也可以不同)，使PCR產(chǎn)物任何一端的引物標(biāo)簽都可以特異的標(biāo)記PCR產(chǎn)物的樣本信息。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)過經(jīng)不完全打斷。所謂不完全打斷，指打斷終產(chǎn)物中包含完整的未被打斷的PCR產(chǎn)物和局部打斷的PCR產(chǎn)物。所述打斷方法包括但不限于化學(xué)打斷方法(例如酶切)和物理打斷方法，所述物理打斷方法包括超聲波打斷方法或機(jī)械打斷方法等。打斷的DNA經(jīng)2%瓊脂糖電泳，割膠純化回收從測序儀最大讀取長度到測序儀可適用的最長DNA長度范圍之間的所有DNA條帶(IlluminaGA測序儀可適用的最長DNA為700bp，此長度為原始DNA長度，沒有包括文庫接頭序列長度)。純化回收方法包括但不限于電泳割膠回收，也可以是磁珠回收等?；厥盏腄NA片段再按照第二代測序儀測序文庫構(gòu)建的流程構(gòu)建測序文庫，然后進(jìn)行測序，優(yōu)選為采用PCR-FREE測序文庫構(gòu)建的流程構(gòu)建測序文庫，測序方法優(yōu)選采用Pair-End方法測序。PCR-Free測序文庫構(gòu)建的流程按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法構(gòu)建。在得到測序總數(shù)據(jù)中，通過引物標(biāo)簽序列可以找到所有所測樣本的序列信息，利用BWA把各個測序序列定位到PCR產(chǎn)物的相應(yīng)DNA參考序列(ReferenceSequence)上，再通過測序序列之間的重疊和連鎖關(guān)系拼接出PCR產(chǎn)物的完整序列(圖1)。此處連鎖是指由Pair-End測序特點決定的pair-end連鎖關(guān)系。“接頭(adapter)”或“文庫接頭(libraryadapter)”標(biāo)簽技術(shù)是指通過對多個測序文庫添加不同文庫接頭(不同文庫接頭的組成序列不同，序列不同的部分稱為接頭標(biāo)簽(adapterindex))，構(gòu)建標(biāo)簽測序文庫，從而可實現(xiàn)多個不同標(biāo)簽測序文庫混合測序，且最終各個標(biāo)簽測序文庫的測序結(jié)果可相互區(qū)分的一種文庫標(biāo)簽技術(shù)?；贒NA分子標(biāo)簽技術(shù)和DNA不完全打斷策略的PCR測序方法的使用可在不增加引物標(biāo)簽數(shù)目的情況下，大大提高可唯一標(biāo)記的樣本數(shù)目。結(jié)合文庫接頭標(biāo)簽技術(shù)的PCR-FREE的文庫構(gòu)建方法，是指將文庫接頭直接連接至測序文庫中的DNA片段兩端，文庫接頭的導(dǎo)入過程因為沒有PCR的參與，因此稱作PCR-Free文庫構(gòu)建。其中接入方法可以采用DNA連接酶進(jìn)行連接。其整個文庫構(gòu)建過程中無PCR的參與，避免了在高序列相似度的PCR產(chǎn)物混合(pooling)文庫的構(gòu)建過程中，由PCR引入錯誤而導(dǎo)致最后結(jié)果的不準(zhǔn)確性。在本發(fā)明中，通過對正反PCR引物添加引物標(biāo)記，結(jié)合DNA不完全打斷策略，使第二代測序技術(shù)應(yīng)用于PCR測序領(lǐng)域時，實際可測得的PCR產(chǎn)物長度超過測序儀的最大測序長度。在本發(fā)明的一個方面中，提供了一組引物標(biāo)簽(primerindex)，其包括表1所示95對引物標(biāo)簽中的至少10對，或至少20對，或至少30對，或至少40對，或至少50對，至少60對，或至少70對，或至少80對，或至少90對，或95對(或者所述一組引物標(biāo)簽由表1所示95對引物標(biāo)簽中的10-95對(例如10-95對，20-95對，30-95對，40-95對，50-95對，60-95對，70-95對，80-95對，90-95對，或95對)組成)，并且所述一組引物標(biāo)簽優(yōu)選地至少包括表1所示95對引物標(biāo)簽中的PI-I至PI-10，或PI-Il至PI-20,或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60,或PI-61至PI-70,或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者它們?nèi)魏蝺蓚€或者多個的組合。根據(jù)本發(fā)明另一方面，還提供了所述的引物標(biāo)簽用于PCR測序方法的用途，其中特別是，每一對引物標(biāo)簽與用于擴(kuò)增待測目的序列的PCR引物對組合成一對標(biāo)簽引物，正反PCR引物的5’端分別具有(或者任選通過連接序列連接)正向引物標(biāo)簽和反向引物標(biāo)簽。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述PCR引物是用于擴(kuò)增HLA的特定基因的PCR引物，優(yōu)選是用于擴(kuò)增HLA-A/B2，3,4號外顯子和HLA-DRB12號外顯子的PCR引物，優(yōu)選的所述PCR引物如表2所示。本發(fā)明另一方面中，提供了上文所述一組引物標(biāo)簽與用于擴(kuò)增待測目的序列的PCR引物對組合成的一組標(biāo)簽引物，其中每一對引物標(biāo)簽與PCR引物對組合成一對標(biāo)簽引物，正反PCR引物的5’端分別具有(或者任選通過連接序列連接)正向引物標(biāo)簽和反向引物標(biāo)簽。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，上文所述標(biāo)簽引物中的PCR引物是用于擴(kuò)增HLA的特定基因的PCR引物，優(yōu)選是用于擴(kuò)增HLA-A/B2，3,4號外顯子和HLA-DRB12號外顯子的PCR引物，優(yōu)選的所述PCR引物如表2所示。在本發(fā)明的另一個具體實施方式中，所述的標(biāo)簽引物用于PCR測序方法。本發(fā)明另一方面中，提供了一種測定樣品中目的核酸的核苷酸序列的方法，其包括1)提供η個樣品，η為大于等于1的整數(shù)，所述樣品優(yōu)選地來自哺乳動物，更優(yōu)選是人，特別是人的血樣；可選地，將待分析的η個樣品分成m個小組，m為整數(shù)且η>m>1；2)擴(kuò)增對于每一個樣品，使用一對標(biāo)簽引物，在存在來自該樣品的模板時，在適于擴(kuò)增目的核酸的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，每一對標(biāo)簽引物由包含引物標(biāo)簽的正向標(biāo)簽引物和反向標(biāo)簽引物(均可以是簡并引物)構(gòu)成，其中正向標(biāo)簽引物和反向標(biāo)簽引物所包含的引物標(biāo)簽可以相同或者不同；不同樣品所用標(biāo)簽引物對中的引物標(biāo)簽彼此不同；3)打斷將所得的PCR產(chǎn)物文庫進(jìn)行不完全打斷；4)測序?qū)⒒厥盏腄NA混合物利用二代測序技術(shù)，優(yōu)選的是Pair-End技術(shù)(例如IlluminaGA,IlluminaHiseq2000)進(jìn)行測序，獲得打斷后的DNA的序列；5)拼接基于每個樣品獨特的引物標(biāo)簽將獲得的測序結(jié)果與樣品一一對應(yīng)，利用比對程序(例如Blast，BffA程序)把各個測序序列定位到PCR產(chǎn)物的相應(yīng)DNA參考序列上，通過序列重疊和連鎖關(guān)系，從打斷后的DNA的序列拼接出完整的目的核酸。本發(fā)明另一方面，提供了一種測定樣品中目的核酸的核苷酸序列的方法，其包括1)提供η個樣品，η為大于等于1的整數(shù)，所述樣品優(yōu)選地來自人，特別是人的血樣；可選地，將待分析的η個樣品分成m個小組，m為整數(shù)且η>m彡1；2)擴(kuò)增對于每一個樣品，使用一對標(biāo)簽引物，在存在來自該樣品的模板時，在適于擴(kuò)增目的核酸的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，每一對標(biāo)簽引物由包含引物標(biāo)簽的正向標(biāo)簽引物和反向標(biāo)簽引物(均可以是簡并引物)構(gòu)成，其中正向標(biāo)簽引物和反向標(biāo)簽引物所包含的引物標(biāo)簽可以相同或者不同；不同樣品所用標(biāo)簽引物對中的引物標(biāo)簽彼此不同；3)混合將各樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起，獲得PCR產(chǎn)物文庫；4)打斷將所得的PCR產(chǎn)物文庫進(jìn)行不完全打斷；5)建庫將打斷后的PCR產(chǎn)物文庫構(gòu)建PCR-Free測序文庫，回收位于所用測序儀最大讀長長度到所用測序儀適用的最長DNA長度范圍之間的所有DNA條帶，可以對文庫添加不同的文庫接頭(adapter)以區(qū)分不同的PCR-Free測序文庫；6)測序?qū)⒒厥盏腄NA混合物利用二代測序技術(shù)，優(yōu)選的是Pair-End技術(shù)(例如IlluminaGA,IlluminaHiseq2000)進(jìn)行測序，獲得打斷后的DNA的序列；7)拼接基于各個文庫不同的文庫接頭序列和每個樣品獨特的引物標(biāo)簽將獲得的測序結(jié)果與樣品一一對應(yīng)，利用比對程序(例如Blast，BWA程序)把各個測序序列定位到PCR產(chǎn)物的相應(yīng)DNA參考序列上，通過序列重疊和連鎖關(guān)系，從打斷后的DNA的序列拼接出完整的目的核酸。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，在上文所述的測序方法中，每一對引物標(biāo)簽與PCR引物對組合成一對標(biāo)簽引物，正反PCR引物的5’端分別具有(或者任選通過連接序列連接)正向引物標(biāo)簽和反向引物標(biāo)簽。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，在上文所述的測序方法中，所述PCR引物是用于擴(kuò)增HLA的特定基因的PCR引物，優(yōu)選是用于擴(kuò)增HLA-A/B的2，3，4號外顯子以及HLA-DRB12號外顯子的PCR引物，優(yōu)選的所述PCR引物如表2所示。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，在上文所述的測序方法中，所述引物標(biāo)簽針對PCR引物進(jìn)行設(shè)計，優(yōu)選針對用于擴(kuò)增HLA的特定基因的PCR引物進(jìn)行設(shè)計，更優(yōu)選針對用于擴(kuò)增HLA-A/B的2，3，4號外顯子以及HLA-DRB12號外顯子的PCR引物，特別是如表2所示的PCR引物進(jìn)行設(shè)計，所述引物標(biāo)簽特別是包括表1所示95對引物標(biāo)簽中的至少10對，或至少20對，或至少30對，或至少40對，或至少50對，至少60對，或至少70對，或至少80對，或至少90對，或95對(或者所述一組引物標(biāo)簽由表1所示95對引物標(biāo)簽中的10-95對(例如10-95對，20-95對，30-95對，40-95對，50-95對，60-95對，70-95對，80-95對，90-95對，或95對)組成)，并且所述一組引物標(biāo)簽優(yōu)選地至少包括表1所示95對引物標(biāo)簽中的PI-I至PI-10，或PI-Il至PI-20,或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60,或PI-61至PI-70,或PI—71至PI—80，或PI—81至PI—90，或PI—91至PI-95，或者它們?nèi)魏蝺蓚€或者多個的組合。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，在上文所述的測序方法中，所述DNA打斷包括化學(xué)打斷方法和物理打斷方法，其中所述化學(xué)方法包括酶切方法，所述物理打斷方法包括超聲波打斷方法或機(jī)械打斷方法。所述DNA打斷后，分離450-750bp長度的片段。本發(fā)明另一方面中，提供了一種HLA分型方法，包括使用上文所述的測序方法對來自患者的樣品(特別是血樣)進(jìn)行測序，以及將測序結(jié)果與HLA數(shù)據(jù)庫(如IMGTHLA專業(yè)數(shù)據(jù)庫)中的標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)比對，序列比對結(jié)果100%匹配的即為對應(yīng)樣本的HLA基因型別。圖1為引物標(biāo)簽標(biāo)記，DNA打斷和DNA測序后，序列拼接圖示。第N號樣本的PCR產(chǎn)物兩端引入了正反引物標(biāo)簽序列Index-N-F/R(l)，PCR產(chǎn)物經(jīng)物理方法打斷后的產(chǎn)物中包括一端帶有引物標(biāo)簽序列的產(chǎn)物，兩端都不帶引物標(biāo)簽序列的產(chǎn)物，完全未被打斷的產(chǎn)物，割膠純化回收位于測序儀最大讀長長度到測序儀適用的最長DNA長度范圍之間的所有DNA條帶用于測序(2)，利用Index-N-F/R在測序結(jié)果中找回屬于第N號樣本的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果，利用PCR產(chǎn)物已知的參考序列信息定位各個測序序列相對參考的位置，并根據(jù)測序序列之間的重疊和連鎖關(guān)系組裝成完整的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果(3，4)。圖2為1號樣本HLA-A/B/DRB1相應(yīng)外顯子PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，從電泳圖上看，PCR產(chǎn)物為一系列片段大小300bp-500bp的單一條帶，其中泳道M是分子量標(biāo)記物(DL2000,Takara公司)，泳道1-7為1號樣本的HLA-A/B/DRB1各外顯子(A2、A3、A4、B2、B3、B4、DRB1-2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，陰性對照(N)無擴(kuò)增條帶。其它樣品的結(jié)果與此類似。圖3為HLA-Mix打斷后DNA電泳情況(割膠前后)，割膠區(qū)域為450_750bp區(qū)域。其中泳道M是分子量標(biāo)記物(NEB-50bpDNALadder)，泳道1是割膠前HLA-Mix的電泳情況，泳道2是割膠后HLA-Mix的膠圖。圖4:1號樣本的一致性(consensus)序列構(gòu)建程序截圖，示例說明了根據(jù)引物標(biāo)簽和DNA片段之間的重疊關(guān)系拼接出PCR產(chǎn)物的完整序列。具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明的實施例中，通過采取引物標(biāo)簽+DNA不完全打斷策略+IllumiaGA測序儀Pair-End100測序技術(shù)的組合對95個樣本的HLA-A/B2，3，4號外顯子以及HLA-DRB12號外顯子的基因分型(PCR產(chǎn)物長度大小處于290bp-500bp之間)，證明該策略可以在充分發(fā)揮第二代測序儀高通量、低成本特點的同時，可以實現(xiàn)對超過測序儀本身測長以上的基因片段的分型。原理將待分析的樣本，通過PCR反應(yīng)在HLA-A/B2，3,4號外顯子以及HLA-DRB12號外顯子的PCR產(chǎn)物兩端引入引物標(biāo)簽，使其特異的標(biāo)記PCR產(chǎn)物的樣本信息。將各組內(nèi)樣品的HLA-A/B/DRB1三個位點的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起，獲得PCR產(chǎn)物文庫；所得PCR產(chǎn)物文庫經(jīng)過超聲不完全打斷后，構(gòu)建PCR-Free測序文庫，測序文庫經(jīng)2%低熔點瓊脂糖電泳，割膠純化回收位于450bp-750bp長度范圍之間的所有DNA條帶(PCR-Free測序文庫的構(gòu)建過程中在DNA片段的兩端都添加上了文庫接頭，使DNA片段在電泳圖上體現(xiàn)的長度比實際長度大了250bp左右，因此，此處回收450bp-700bp的片段，實際上相當(dāng)于回收原長度為200bp-500bp的DNA片段)。回收的DNA經(jīng)IlluminaGAPE-100測序。通過引物標(biāo)簽序列可以找到所有所測樣本的序列信息，再通過已知DNA片段的參考序列信息和DNA片段序列之間的重疊和連鎖關(guān)系組裝出整個PCR產(chǎn)物的序列，再通過與HLA-A/B/DRB1相應(yīng)外顯子的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果可組裝出原PCR產(chǎn)物的全序列，實現(xiàn)HLA-A/B/DRB1的基因分型。實施例1樣本提取使用KingFisher自動提取儀(美國Thermo公司)從95份已知HLA-SBT分型結(jié)果的血樣(中國造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫(以下稱“中華骨髓庫”))中提取DNA。主要步驟如下取出6個Kingfisher自動提取儀配套的深孔板及1個淺孔板，根據(jù)說明書分別加入一定量配套的試劑并做好標(biāo)記，將所有已加好試劑的孔板按要求置于相應(yīng)的位置，選定程序“Bioeasy_200ulBloodDNA_KF.msz”程序，按下“star”執(zhí)行該程序進(jìn)行核酸提取。程序結(jié)束后收集plateElution中的IOOul左右的洗脫產(chǎn)物即為提取的DNA。實施例2PCR擴(kuò)增通過合成在5’末端具有不同引物標(biāo)簽的PCR引物制作不同的PCR標(biāo)簽引物，這樣不同的PCR標(biāo)簽引物可以用于不同的樣本，所述PCR引物是針對HLA-A/B的2，3，4號外顯子以及HLA-DRB12號外顯子的PCR引物。其后通過PCR反應(yīng)在PCR產(chǎn)物兩端引入引物標(biāo)簽，從而特異地標(biāo)記了來自不同樣本的PCR產(chǎn)物。以95套PCR標(biāo)簽引物來分別擴(kuò)增95份DNA樣本，每套PCR標(biāo)簽引物由一對雙向引物標(biāo)簽(表1)和用于擴(kuò)增HLA-A/B的2，3，4號外顯子以及HLA-DRB12號外顯子的PCR引物(表2)組成，其中每個正向PCR引物的5’末端上連接一對引物標(biāo)簽的正向引物標(biāo)簽，而反向PCR引物的5’末端上連接一對引物標(biāo)簽的反向引物標(biāo)簽。引物標(biāo)簽在引物合成時直接添加在PCR引物的5’末端。把實施例1的樣本提取步驟中所得的95份DNA，依次編號1_95，PCR反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，共7板，編號分別為HLA-P-A2、HLA-P-A3、HLA-P-A4、HLA-P-B2、HLA-P-B3、HLA-P-B4以及HLA-P-DRBl-2(A2/3/4，B2/B3/B4,DRB1-2表示擴(kuò)增的位點)，板內(nèi)設(shè)置一個不添加模板的陰性對照，陰性對照所用引物與模板1的對應(yīng)引物相同。實驗的同時，記錄下每對引物標(biāo)簽對應(yīng)的樣本編號信息。表1，引物標(biāo)簽的相關(guān)信息表2，未添加引物標(biāo)簽前用于擴(kuò)增HLA-A/B/DRB1相應(yīng)外顯子的PCR引物D2-F1,D2-F2,D2-F3，D2-F4，D2-F5，D2-F6，D2-F7為擴(kuò)增HLA-DRB12號外顯子的正向引物，D2-R為擴(kuò)增HLA-DRB12號外顯子的反向引物。HLA-A/B/DRB1的PCR程序如下96"C2min95°C30s—60°C30s—72°C20s(32cycles)15°C⑴HLA-A/B的PCR反應(yīng)體系如下所有試劑均購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司(Promega)HLA-DRBl的PCR反應(yīng)體系如下其中PInf-A/B/D2-F1/2/3/4/5/6/7表示引物5’末端帶有第η號正向引物標(biāo)簽序列(表1)的HLA-A/B/DRB1的F引物，PInf-A/B/D2-R2/3/4表示引物5’末端帶有第η號反向引物標(biāo)簽序列的HLA-A/B/DRB1的R引物(此處η<95)，其它依次類推。且每個樣本對應(yīng)特定的一套PCR引物(PInf-A/B/D2-F1/2/3/4/5/6/7，PInf_A/B/D2_R2鋪)。PCR反應(yīng)在Bio-Rad公司的PTC-200PCR儀上運行。PCR完成后，取2ulPCR產(chǎn)物經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖2顯示了1號樣本HLA-A/B/DRB1相應(yīng)外顯子PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，DNA分子標(biāo)記為DL2000(Takara公司)，膠圖上有一系列片段大小為300bp_500bp單一條帶，表明1號樣本的HLA-A/B/DRB1各外顯子(A2、A3、A4、B2、B3、B4、DRB1-2)PCR擴(kuò)增成功，陰性對照(N)無擴(kuò)增條帶。其它樣品的結(jié)果與此類似實施例3PCR產(chǎn)物混合和純化從96孔板HLA-P-A2剩余的PCR產(chǎn)物中(陰性對照除外)各取20ul混合在一個3ml的EP管中，標(biāo)記為HLA-A2-Mix，對其它6個96孔板進(jìn)行同樣的操作，分別標(biāo)記為HLA-A3-Mix、HLA-A4-Mix,HLA_B2_Mix、HLA_B3_Mix、HLA-B4-Mix和HLA_D2_Mix，震蕩混勻，從HLA-A2-Mix、HLA_A3_Mix、HLA_A4_Mix、HLA_B2_Mix、HLA_B3_Mix、HLA_B4_Mix和HLA-D2-Mix中各取200ul混合在一個3ml的EP管中，標(biāo)記為HLA-Miχ，從HLA-Mix中取500ulDNA混合物經(jīng)QiagenDNAPurificationkit試劑盒(QIAGEN公司)過柱純化(具體純化步驟詳見說明書)，純化所得的200ulDNA,經(jīng)Nanodrop8000(ThermoFisherScientific公司)測定HLA-MixDNA濃度為48ng/ul。實施例4PCR產(chǎn)物的打斷，以及IlluminaGAPCR-Free測序文庫的構(gòu)建1.DNA打斷從純化后的HLA-Miχ中取總量5ug的DNA用帶AFA纖維扣蓋的Covaris微管在CovarisS2DNA打斷儀(Covaris公司)上打斷。打斷條件如下頻率掃描(frequencysweeping)2.打斷后純化將HLA-Mix的所有打斷產(chǎn)物用QIAquickPCRPurificationKit回收純化，分別溶于37.5ul的EB(QIAGENElutionBuffer)中；3.末端修復(fù)反應(yīng)對打斷后純化的HLA-Mix進(jìn)行DNA末端修復(fù)反應(yīng)，體系如下(試劑均購自Enzymatics公司)反應(yīng)條件為恒溫混勻器(Thermomixer，Eppendorf公司)20°C溫浴30min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)QIAquickPCRPurificationKit回收純化，溶于34μ1的^(QIAGENElutionBuffer)中。4.3，末端加A反應(yīng)上一步回收DNA的3’末端加A反應(yīng)，體系如下(試劑均購自Enzymatics公司)反應(yīng)條件為恒溫混勻器(Thermomixer，Eppendorf公司)37°C溫浴30min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)MiniElutePCRPurificationKit(QIAGEN公司)回收純化，溶于13μ1的EB溶液(QIAGENElutionBuffer)中。5.連接IlluminaGAPCR-Free文庫接頭(adapter)術(shù)語“PCR-Free文庫接頭(adapter)”是指經(jīng)設(shè)計的一段堿基，其主要作用是輔助固定DNA分子在測序芯片上以及提供通用測序引物的結(jié)合位點，PCR-Free文庫接頭可以通過DNA連接酶將其直接連接至測序文庫中的DNA片段兩端，文庫接頭的導(dǎo)入過程因為沒有PCR的參與，因此稱作PCR-Free文庫接頭。加A后的產(chǎn)物連接IlluminaGAPCR-Free文庫接頭，體系如下(試劑均購自Illumina公司)反應(yīng)條件為恒溫混勻器(Thermomixer，Eppendorf公司)20°C溫浴15min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)AmpureBeads(BeckmanCoulterGenomics)純化后溶于50ul去離子水，經(jīng)熒光定量PCR(QPCR)檢測到DNA濃度結(jié)果如下6.割膠回收取30μLHLA-Mix用2%低熔點瓊脂糖膠進(jìn)行回收。電泳條件為100V,IOOmin0DNAmarker為NEB公司的50bpDNAmarker。割膠回收450_750bp長度范圍的DNA片段(附圖3)。膠回收產(chǎn)物經(jīng)QIAquickPCRPurificationKit(QIAGEN公司)回收純化，純化后體積為32ul，經(jīng)熒光定量PCR(QPCR)檢測到DNA濃度結(jié)果為10.16nM。實施例5IlluminaGA測序根據(jù)QPCR檢測結(jié)果，取IOpmolDNA用IlluminaGAΡΕ-100程序測序，具體操作流程詳見IlluminaGA操作說明書(IlluminaGAIIχ)。實施例6結(jié)果分析IlluminaGA產(chǎn)出的測序結(jié)果是一系列DNA序列，通過查找測序結(jié)果中的正反引物標(biāo)簽序列和引物序列，建立各個引物標(biāo)簽對應(yīng)樣本HLA-A/B/DRB1各外顯子PCR產(chǎn)物測序結(jié)果的數(shù)據(jù)庫。通過BWA(Burrows-WheelerAligner)把各外顯子的測序結(jié)果定位在相應(yīng)外顯子的參考序列上(參考序列來源http://WWW.ebi.ac.uk/imgt/hla/)同時，構(gòu)建各個數(shù)據(jù)庫的一致性(consensus)序列，再對數(shù)據(jù)庫中DNA序列進(jìn)行篩選和測序錯誤校正。校正后的DNA序列通過序列重疊(overlap)和連鎖(Pair-End連鎖)關(guān)系可組裝成HLA-A/B/DRBl各外顯子相應(yīng)的序列。所得DNA序列利用與MGTHLA專業(yè)數(shù)據(jù)庫中HLA-A/B/DRB1相應(yīng)各外顯子的序列數(shù)據(jù)庫比對，序列比對結(jié)果100%匹配的即為對應(yīng)樣本的HLA-A/B/DRB1基因型別?？蓞⒖紙D4示例說明的1號樣品的HLA-A位點的2號外顯子一致性序列構(gòu)建程序的截圖。所有95個樣本，得到的分型結(jié)果與原已知分型結(jié)果完全相符，其中1-32號樣本的具體結(jié)果如下樣本編號原HLA-A/B/DRB1型別0111]1A~k02:03A女11:01B~k38:02B-k48:01DRBl-k1454DRBl-k15010112]2A女01:01A女30:01B女08:01B-k13:02DRBl-k0301DRBl-k07010113]3A女01:01A女02:01B女15:11B-k47:01DRBl-k1302DRBl-k15010114]4A女24:08A女26:01B女40:01B-k51:01DRBl-k0404DRBl-k09010115]5A女01:01A女24:02B女54:01B-k55:02DRBl-k0405DRBl-k09010116]6A女01:01A女03:02B女15:11B-k37:01DRBl-k1001DRBl-k14540117]7A女11:01A女30:01B女13:02B-k15:18DRBl-k0404DRBl-k07010118]8A女01:01A女02:01B女35:03B-k81:01DRBl-k1101DRBl-k15010119]9A女02:06A女31:01B女27:07B-k40:02DRBl-k0301DRBl-k13020120]10A女01:01A女66:01B女37:01B-k49:01DRBl-k1001DRBl-k13020121]11A女01:01A女03:01B女35:01B-k52:01DRBl-k0101DRBl-k15020122]12A女11:01A女11:01B女15:01B-k15:05DRBl-k0406DRBl-k15010123]13A女01:01A女11:02B女07:02B-k15:02DRBl-k0901DRBl-k15010124]14A女01:01A女02:01B女52:01B-k67:01DRBl-k1502DRBl-k16020125]15A女01:01A女02:05B女15:17B-k50:01DRBl-k0701DRBl-k15010126]16A女01:01A女11:01B女37:01B-k40:02DRBl-k1001DRBl-k12020127]17A女24:07A-k32:01B女35:05B-k40:01DRBl-k0301DRBl-k04050128]18A女11:01A-k24:02B女13:01B-k35:01DRBl-k1602DRBl-k16020129]19A女11:01A女11:01B女4016:02B-k55:12DRBl-k0405DRBl-k150120A-k0211A2402Bk4001Bk4006DRBlk1101DRBlk150121A-k0101Ak0206Bk5101Bk5701DRBlk0701DRBlk120122A-k0101Ak2901Bk0705Bk1501DRBlk0405DRBlk070123A-k0101Ak0207Bk3701Bk4601DRBlk0403DRBlk100124A-k2485Ak3001Bk1302Bk5502DRBlk0701DRBlk150125A-k1101Ak3101Bk0706Bk5101DRBlk1202DRBlk140526A-k0101Ak1101Bk4601Bk5701DRBlk0701DRBlk080327A-k0101Ak0201Bk1518Bk3701DRBlk0401DRBlk150128A-k0101Ak2402Bk3701Bk4601DRBlk0901DRBlk100129A-k2601Ak6601Bk4040Bk4102DRBlk1201DRBlk150130A-k0201Ak2902Bk1302Bk4501DRBlk0301DRBlk120231A-k0101Ak1103Bk1501Bk5701DRBlk0701DRBlk150132A-k1101Ak2601Bk3503Bk3801DRBlk1103DRBlk1404樣本編號測得的ffiJV-A/B/DRBl型別1A-k0203Ak1101B-k3802B-k4801DRBlk1454DRBlk15012A-k0101Ak3001Bk0801Bk1302DRBlk0301DRBlk07013A-k0101Ak0201Bk1511Bk4701DRBlk1302DRBlk15014A-k2408Ak2601Bk4001Bk5101DRBlk0404DRBlk09015A-k0101Ak2402Bk5401Bk5502DRBlk0405DRBlk09016A-k0101Ak0302Bk1511Bk3701DRBlk1001DRBlk14547A-k1101Ak3001Bk1302Bk1518DRBlk0404DRBlk07018A-k0101Ak0201Bk3503Bk8101DRBlk1101DRBlk15019A-k0206Ak3101Bk2707Bk4002DRBlk0301DRBlk130210A-k0101Ak6601Bk3701Bk4901DRBlk1001DRBlk130211A-k0101Ak0301Bk3501Bk5201DRBlk0101DRBlk150212A-k1101Ak1101Bk1501Bk1505DRBlk0406DRBlk150113A-k0101Ak1102Bk0702Bk1502DRBlk0901DRBlk150114A-k0101Ak0201Bk5201Bk6701DRBlk1502DRBlk160215A-k0101Ak0205Bk1517Bk5001DRBlk0701DRBlk150116A-k0101Ak1101Bk3701Bk4002DRBlk1001DRBlk120217A-k2407Ak3201Bk3505Bk4001DRBlk0301DRBlk040518A-k1101Ak2402Bk1301Bk3501DRBlk1602DRBlk160219A-k1101Ak1101Bk4002Bk5512DRBlk0405DRBlk150120A-k0211Ak2402Bk4001Bk4006DRBlk1101DRBlk150121A-k0101Ak0206Bk5101Bk5701DRBlk0701DRBlk120122A-k0101Ak2901Bk0705Bk1501DRBlk0405DRBlk070123A-k0101Ak0207Bk3701Bk4601DRBlk0403DRBlk100124A-k2485Ak3001Bk1302Bk5502DRBlk0701DRBlk150125A-k1101Ak3101Bk0706Bk5101DRBlk1202DRBlk140526A-k01::01A-k11::01B-k46:01B-k57::01DRBl-k07:01DRBl女08:0327A-k01::01A-k02::01B-k15:18B-k37::01DRBl-k04:01DRBl*15:0128A-k01::01A-k24::02B-k37:01B-k46::01DRBl-k09:01DRBl*10:0129A-k26::01A-k66::01B-k40:40B-k41::02DRBl-k12:01DRBl*15:0130A-k02::01A-k29::02B-k13:02B-k45::01DRBl-k03:01DRBl*12:0231A-k01::01A-k11::03B-k15:01B-k57::01DRBl-k07:01DRBl*15:0132A-k11::01A-k26::01B-k35:03B-k38::01DRBl-k11:03DRBl*14:04注::HLA--DRBl型別中的DRBl-k1201不排除]DRBl女1206/121C1/1217的可能性，DRBl^1454不排除DRBl^1401的可能性，因為上述等位基因在HLA-DRB12號外顯子的序列完全相同。盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公幵的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。參考文獻(xiàn)[1].http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats,html[2].TiercyJΜ.MolecularbasisofHLApolymorphismamplicationsinclinicaltransplantation.[J].TransplImmunol,2002,9:173-180.[3].C.Antoine,S.Miiller,A.Cant,etal.Long-termsurvivalandtransplantationofhaemopoieticstemcellsforimmunodeficiencies:reportoftheEuropeanexperience.1968-99.[J].TheLancet，2003，9357:553_560·[4].H.A.Erlich，G.Opelz，J.Hansen，etal.HLADNATypingandTransplantation.[J].Immunity,2001,14:347-356.[5].LilloR,BalasA,VicarioJL,etal.TwonewHLAclassallele,DPBl女02014，bysequence-basedtyping.[J].TissueAntigens，2002，59:47_48·[6].A.Dormoy,N.Froelich.Leisenbach,etal.Mono-allelicamplificationofexons2-4usingallelegroup-specificprimersforsequence-basedtyping(SBT)oftheHLA-A,-Band~Cgenes!Preparationandvalidationofready-to-usepre-SBTmini-kits.[J].TissueAntigens，2003，62:201_216·[7].ElaineR.Mardis.Theimpactofnext-generationsequencingtechnologyongenetics.[J].TrendsinGenetics.2008，24:133_14L[8].ChristianHoffmann1，NanaMinkahl，JeremyLeipzig.DNAbarcodingandpyrosequencingtoidentifyrareHIVdrugresistancemutations.[J].NucleicAcidsResearch，2007，1-8.[9].ShannonJ.Odelberg，RobertB.Weiss,AkiraHata.Template-switchingduringDNAsynthesisbyThermusaquaticusDNApolymeraseI.[J].NucleicAcidsResearch.1995，23:2049_2057.[10].SayerD,WhidborneR,BrestovacB.HLA-DRBlDNAsequencingbasedtyping:anapproachsuitableforhighthroughputtypingincludingunrelatedbonemarrowregistrydonors.[J].TissueAntigens.2001,57(1)46-54.[11],IwankaKozarewa,ZeminNing,MichaelAQuail.Amplification-freeIlluminasequencing-librarypreparationfacilitatesimprovedmappingandassemblyof(G+C)-biasedgenomes.[J].NatureMethods.2009,6:291_295。權(quán)利要求一種測定樣品中目的核酸的核苷酸序列的方法，其包括1)提供n個樣品，n為大于等于1的整數(shù)，所述樣品優(yōu)選地來自哺乳動物，更優(yōu)選是人，特別是人的血樣；可選地，將待分析的n個樣品分成m個小組，m為整數(shù)且n≥m≥1；2)擴(kuò)增對于每一個樣品，使用一對或多對標(biāo)簽引物，在存在來自該樣品的模板時，在適于擴(kuò)增目的核酸的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，每一對標(biāo)簽引物由包含引物標(biāo)簽的正向標(biāo)簽引物和反向標(biāo)簽引物(均可以是簡并引物)構(gòu)成，其中正向標(biāo)簽引物和反向標(biāo)簽引物所包含的引物標(biāo)簽可以相同或者不同；不同樣品所用標(biāo)簽引物對中的引物標(biāo)簽彼此不同；3)混合當(dāng)n＞1時，將各樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起；4)打斷將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行不完全打斷，并進(jìn)行純化回收；5)測序?qū)⒒厥盏腄NA混合物利用二代測序技術(shù)，優(yōu)選的是PairEnd技術(shù)(例如IlluminaGA、IlluminaHiseq2000)進(jìn)行測序，獲得打斷后的DNA的序列；和6)拼接基于每個樣品獨特的引物標(biāo)簽將獲得的測序結(jié)果與樣品一一對應(yīng)，利用比對程序(例如Blast，BWA程序)把各個測序序列定位到PCR產(chǎn)物的相應(yīng)DNA參考序列上，通過序列重疊和連鎖關(guān)系，從打斷后的DNA的序列拼接出完整的目的核酸。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中每一對引物標(biāo)簽與PCR引物對組合成一對標(biāo)簽引物，正反PCR引物的5’端分別具有(或者任選通過連接序列連接)正向引物標(biāo)簽和反向引物標(biāo)簽。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述PCR引物是用于擴(kuò)增HLA-A/B的2，3，4號外顯子以及HLA-DRB12號外顯子的PCR引物，優(yōu)選的所述PCR引物如表2所示。4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述引物標(biāo)簽針對PCR引物進(jìn)行設(shè)計，優(yōu)選針對用于擴(kuò)增HLA的特定基因的PCR引物進(jìn)行設(shè)計，更優(yōu)選是用于擴(kuò)增HLA-A/B的2，3，4號外顯子以及HLA-DRB12號外顯子的PCR引物，特別是如表2所示的PCR引物進(jìn)行設(shè)計，所述引物標(biāo)簽特別是包括表1所示95對引物標(biāo)簽中的至少10對，或至少20對，或至少30對，或至少40對，或至少50對，至少60對，或至少70對，或至少80對，或至少90對，或95對(或者所述一組引物標(biāo)簽由表1所示95對引物標(biāo)簽中的10-95對(例如10-95對，20-95對，30-95對，40-95對，50-95對，60-95對，70-95對，80-95對，90-95對，或95對)組成)，并且所述一組引物標(biāo)簽優(yōu)選地至少包括表1所示95對引物標(biāo)簽中的PI-I至PI-10，或PI-Il至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70,或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者它們?nèi)魏蝺蓚€或者多個的組合。5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述DNA打斷包括化學(xué)打斷方法和物理打斷方法，其中所述化學(xué)方法包括酶切方法，所述物理打斷方法包括超聲波打斷方法或機(jī)械打斷方法。6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述DNA打斷后，純化回收從測序儀最大讀取長度到測序儀可適用的最長DNA長度范圍之間的所有DNA條帶，其中所述純化回收方法包括但不限于電泳割膠回收，也可以是磁珠回收。7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法還可以包括權(quán)利要求1所述的步驟1)_4)，以及如下步驟5)建庫將打斷后的PCR產(chǎn)物文庫構(gòu)建PCR-Free測序文庫，可以對文庫添加不同的文庫接頭(adapter)以區(qū)分不同的PCR-Free測序文庫，純化回收位于所用測序儀最大讀長長度到所用測序儀適用的最長DNA長度范圍之間的所有DNA條帶，優(yōu)選地是450-750bp長度范圍的DNA片段；6)測序?qū)⒒厥盏腄NA混合物利用二代測序技術(shù)，優(yōu)選的是Pair-End技術(shù)(例如IlluminaGA,IlluminaHiseq2000)進(jìn)行測序，獲得打斷后的DNA的序列；7)拼接基于各個文庫不同的文庫接頭序列和每個樣品獨特的引物標(biāo)簽將獲得的測序結(jié)果與樣品一一對應(yīng)，利用比對程序(例如Blast，BWA程序)把各個測序序列定位到PCR產(chǎn)物的相應(yīng)DNA參考序列上，通過序列重疊和連鎖關(guān)系，從打斷后的DNA的序列拼接出完整的目的核酸。8.權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法用于HLA分型的用途，其特征在于包括使用權(quán)利要求1-7中任一項的方法對來自患者的樣品(特別是血樣)進(jìn)行測序，以及將測序結(jié)果與HLA數(shù)據(jù)庫(如IMGTHLA專業(yè)數(shù)據(jù)庫)中HLA-DRB12號外顯子的序列數(shù)據(jù)比對，序列比對結(jié)果100%匹配的即為對應(yīng)樣本的HLA-DRBl基因型別。9.一組引物標(biāo)簽，其包括表1所示95對引物標(biāo)簽中的至少10對，或至少20對，或至少30對，或至少40對，或至少50對，至少60對，或至少70對，或至少80對，或至少90對，或95對(或者所述一組引物標(biāo)簽由表1所示95對引物標(biāo)簽中的10-95對(例如10-95對，20-95對，30-95對，40-95對，50-95對，60-95對，70-95對，80-95對，90-95對，或95對)組成)，并且所述一組引物標(biāo)簽優(yōu)選地至少包括表1所示95對引物標(biāo)簽中的PI-I至PI-10，或PI-Il至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70,或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者它們?nèi)魏蝺蓚€或者多個的組合。10.權(quán)利要求9所述的一組引物標(biāo)簽用于PCR測序方法的用途，其中特別是，每一對引物標(biāo)簽與用于擴(kuò)增待測目的序列的PCR引物對組合成一對標(biāo)簽引物，正反PCR引物的5’端分別具有(或者任選通過連接序列連接)正向引物標(biāo)簽和反向引物標(biāo)簽。11.權(quán)利要求10所述的用途，其中PCR引物是用于擴(kuò)增HLA的特定基因的PCR引物，優(yōu)選是用于擴(kuò)增HLA-A/B的2，3，4號外顯子以及HLA-DRB12號外顯子的PCR引物，優(yōu)選的所述PCR引物如表2所示。12.權(quán)利要求9的一組引物標(biāo)簽與用于擴(kuò)增待測目的序列的PCR引物對組合成的一組標(biāo)簽引物，其中每一對引物標(biāo)簽與PCR引物對組合成一對標(biāo)簽引物，正反PCR引物的5’端各具有(或者任選通過連接序列連接)一個引物標(biāo)簽。13.權(quán)利要求12所述的標(biāo)簽引物，其中所述PCR引物是用于擴(kuò)增HLA的特定基因的PCR引物，優(yōu)選是用于擴(kuò)增HLA-A/B的2，3，4號外顯子以及HLA-DRB12號外顯子的PCR引物，優(yōu)選的所述PCR引物如表2所示。14.權(quán)利要求12所述的標(biāo)簽引物用于PCR測序方法的用途。全文摘要本發(fā)明提供了一種PCR測序方法，通過本發(fā)明中的引物標(biāo)簽+DNA不完全打斷策略+二代測序技術(shù)(Pair-End測序技術(shù))的組合在充分利用第二代測序儀高通量、低成本特點的同時，使測序儀能夠測通的PCR產(chǎn)物長度超過測序儀本身測長以上，大大擴(kuò)大了其適用范圍。同時，本發(fā)明還提供了用于上述PCR測序方法的引物標(biāo)簽，以及該方法用于基因分型，特別是HLA分析的用途。文檔編號C12N15/11GK101921840SQ20101021371公開日2010年12月22日申請日期2010年6月30日優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日發(fā)明者劉濤,張現(xiàn)東,李劍,趙美茹申請人:深圳華大基因科技有限公司