專利名稱：一種羰酰還原酶在生產(s)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種羰酰還原酶的應用，尤其涉及一種羰酰還 原酶(Carbonyl Reductase CR)在以4_氯乙酰乙酸乙酯為底物不對稱還原反應生產 (S) -4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應用。
背景技術：
(S)-4-氯-3 羥基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate, (S)-CHBE) 是一種重要的手性中間體，可用于很多活性藥物的合成，如他汀類藥物——羥甲基戊二酰 CoA(HMG-CoA)還原酶抑制劑和4-羥基吡啶烷酮(4-hydroxypyrrolidone)等[1]。以4-氯乙酰乙酸乙酯(Ethyl 4-chloroacetoacetate，C0BE)作為還原反應的潛 手性底物，易于合成且價格低廉，以其為底物進行不對稱還原反應獲取(S)-CHBE是非常經 濟有效的制備途徑。迄今為止關于COBE不對稱還原制備手性CHBE已進行了很多的研究報道，概括起 來主要有化學法和生物法?；瘜W催化不對稱還原法，所用催化劑包括價格昂貴的銠、釕等金屬，采用化學法合 成手性CHBE的缺點是產物的光學純度不夠高，且催化還原反應需要很高的氫氣壓，耗能 高，污染大。微生物法分為酶催化和全細胞催化法，Shimizu等用來自 Sporobolomycessalmonicolor AKU 4429的NADPH依賴的醛基還原酶分別在單一水相體系 [2]和水/有機溶劑兩相體系[3]催化還原COBE制備手性CHBE，由于應用酶催化還原反應 所用的酶要從微生物細胞中分離純化得到，過程操作繁瑣且酶容易失活，與全細胞催化相 比，應用較少。全細胞法則分為采用野生酵母和基因工程菌催化COBE為(S)-CHBE兩種， Yasohara等[4]從400株酵母菌中篩選得到了一株Candida magnoliae，在水/乙酸正丁酯 體系中，在添加葡萄糖、NADP和葡萄糖脫氫酶以及反應過程中需要控制PH值的條件下產物 (S)-CHBE在有機相的積累濃度可達90g/L，產物的光學純度對映體過量值(enantiomeric excess e.e.)達到96%。由于采用野生酵母中往往含有多種能夠催化COBE為不同構型 CHBE的還原酶，因此采用野生酵母進行催化所獲得的產物的光學活性往往很低，篩選到高 立體選擇性的優(yōu)良微生物菌株非常困難，所以近來的研究著重集中于運用重組大腸桿菌不 對稱合成具有高立體選擇性的(S)-CHBE。Yasohara等[5]從木蘭假絲酵母菌Candida magnoliae中分離得到了一個輔酶 NADPH依賴型的羰基還原酶，將該酶與葡萄糖脫氫酶基因克隆到大腸桿菌中共表達，在定 時添加適量的輔酶NADP和葡萄糖以及分批添加底物的條件下，催化COBE的不對稱還原 (S)-CHBE，其得率和光學純度分別為85% e. e.和100% e. e. [6]?，F(xiàn)有的羰酰還原酶大多為輔酶NADPH依賴型，包括來源于P. stipitis的 PsCRI [7]，來源于 Candida magnoliae 的 S 1[6]等。到目前，僅有來源于 Kluyveromyces
3aestuarii的KaCR為輔酶NADH依賴型，其活力很低，僅3. 06U/mg[8]。綜上所述，現(xiàn)有催化COBE為(S) -CHBE的技術存在底物得率低、產物光學活性低、 成本高等問題。本專利中涉及到的還原酶是羰酰還原酶的一種，其包含285個氨基酸，其在 Genbank 中的收錄號為 XP_001387285. 1，ACCESSION ΧΡ_001387285 (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/XP_001387285. 1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。編碼該蛋白的 基因含有 858bp，其在 Genbank 中的收錄號為 XM_001387248. 1 (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/126256851)，其基因序列如SEQ IDNO 1所示。至今未發(fā)現(xiàn)該羰酰還原酶用于 COBE不對稱還原制備(S)-CHBE的報道。參考文獻[IjKaranewsky DS, Badia MC, Ciosek CP Jr, Robl JF, Sofia MJ, Simpkins LM, DeLange B,Harrity Tff,Biller SA,Gorden EM(1990)Phosphorus-containing inhibitors of HMG-CoAreductase. 1.4-[2-arylethyl]-hydroxyphosphinyl]-3-hydroxybutanoic acids :a new class ofcell-selective inhibitors of cholesterol biosynthesis. J Med Chem 33 :2925_2956。[2]Shimizu S, Kataoka M, Morishita A, Katoh M, Morikawa T, Miyoshi T, Yamada H(1990a)Microbial asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutaoate to optically active ethyl4-4-chloro-3-hydroxybutanoate. Biotechnol Iett 12: 593-596 ο[3]Shimizu S, Kataoka M, Karoh M, Morikawa T, Miyoshi T, Yamada H(1990b) Stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3_oxobutaoate by a microbial aldehyde reductasein an organic solvent-water diphasic system. Appl Environ Microbiol 56 :2374_2377。[4]Yasohara Y, Kizaki N, Hasegawa J, Takahashi S, Wada M, Kataoka M, Shimizu S(1999)Synthesis of optically activeethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate by microbial reduction. ApplMicrobiol Biotechnol 51:847—851。[5]Wada M,Kataoka M,Kawabata H,Yasohara Y,Kizaki N,Hasegawa J,Shimizu S (1998)Purification and characterization of NADPH-dependent carbonyl reductase involved instereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3_oxobutanoate, from Candida magnoliae. BiosciBiotechnol Biochem 62:280-285。[6]Yasohara Y, Kizaki N, Hasegawa J, Wada M, Kataoka M, Shimizu S (2000) Molecularcloning and overexpression of the gene encoding an NADPH-dependent carbonyl reductase, involved in stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate, from Candidamagnoliae. Biosci Biotechnol Biochem 64
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發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種羰酰還原酶在COBE不對稱還原制備 (S) -CHBE中的應用。為解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下一種氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的羰酰還原酶在4_氯乙酰乙酸乙酯(COBE) 不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯[(S)-CHBE]中的應用。即以氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的羰酰還原酶為催化劑，以4_氯乙酰乙酸乙 酯為底物，以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(還原型輔酶I，NADH)為輔因子，不對稱還原 制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。具體反應是將表達基因序列如SEQ ID NO 1所示的重組菌，經過破碎后與 200mmol/L 2mol/L葡萄糖、1. 6 320g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯、50U 5KU的葡萄糖脫 氫酶(glucose dehydrogenase, GDH)和0. 05 0. 5mmol/L的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷 酸(氧化型輔酶I，NAD)，在pH6. O 7. 5,20 30°C、150 300rpm條件下反應15 30h， 得到(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。其中，加入NAD+與⑶H即能再生成NADH，且使反應循環(huán) 進行，降低了加入量以減少了生產成本。發(fā)明人基于現(xiàn)代生物信息學思想，結合分子生物學技術，采用基因工程的手段從 畢赤酵母Pichia Stipitis CBS 6054克隆羰酰還原酶的基因，在大腸桿菌中表達后發(fā)現(xiàn)其 在水相中能夠高效催化COBE為(S)-CHBE，e. e.值為100%。同時，通過在水/有機相中反 應、分批添加底物COBE等方式，解除了底物和產物對細胞和酶的抑制作用，顯著的提高了 轉化效果。通過對羰酰還原酶的基因進行重組表達，獲得了具有新型催化功能的酶蛋白，開 發(fā)了該條基因的新功能——催化非天然底物COBE為高立體選擇性的(S)-CHBE。有益效果本發(fā)明首次將氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的羰酰還原酶應用于 COBE不對稱還原制備(S) -CHBE中，取得很好的效果，其酶活高達15U/mg，而Yamamoto從海 洋酵母菌Kluyveromyces aestuarii中分離得到的羰基還原酶，其酶活只有3. 06U/mg[8]。 氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的羰酰還原酶對底物COBE的得率高(大于91 % )，產物 CHBE的光學活性高(e.e.為100% )，且產量高，大大降低了生產成本。本專利中涉及的輔酶NADH-依賴羰基還原酶是除了 NADPH依賴羰基還原酶之外， 在已報道還原酶中活力最高。而NADH比NADPH更為廉價，NADH價格約為300元/克，而 NADPH約為8000元/克。氧化型輔酶NAD+價格約100元/克，NADP+價格約1500元/克。 因此，使用本發(fā)明的羰酰還原酶應用于COBE不對稱還原制備(S) -CHBE中，無疑可以極大的 降低生產成本。


圖1為羰酰還原酶基因的構建圖。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā) 明。實施例1 羰酰還原酶基因的獲取畢赤酵母Pichia Stipitis CBS 6054 (購于 Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversiry Centre)，培養(yǎng)基 YPD (g · L-1)酵母提取物 10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，補蒸餾水至IL0將畢赤酵母Pichia Stipitis CBS 6054接種于5mLYPD液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)至 對數(shù)生長期，使用基因組DNA提取試劑盒(北京天為生物工程有限公司酵母基因組提取試 劑盒)提取基因組。構建表達載體所用的引物加設酶切位點，引物序列如下上游引物(CRII-sense含 Nde I)為5， -GGAATTCCATATGACTGTCGAAACCGCCACC-3‘下游引物(CRII-anti含 BamH I)為5’ -CGCGGATCCCTAGACAGAACAGTAACCACCT-3‘所有引物均由上海申能博彩公司合成。基因的PCR條件94°C變性7min，按如下參數(shù)循環(huán)30次94°C變性lmin，60°C退火50s，72°C延伸 1. 5min。最后 72°C延伸 IOmin0實施例2:基因的表達用Nde I 及 BamH I 分別酶切 pET_22b (pET_22b 購于 Novagen (默克中國))及 所擴增含有兩個酶切位點的目的基因，分別膠回收已雙酶切的目的片段和表達載體，將已 雙酶切的表達載體pET-22b與目的基因用T4連接酶進行連接過夜，將IOuL的連接產物 pET-22b-PsCRII加入IOOuL的Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中，冰上放置30min，42°C熱激 90sec。冰上放置2min。加入預熱的0. 45mL培養(yǎng)基。220rpm 37°C C Ih0將200uL菌液加 入分別含有100 μ g/mL的氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)12_16h。構建圖 譜見圖1。實施例3 酶活的測定挑取重組菌E.coli Rosseta(pET-22b-PsCR)及出發(fā)大腸桿菌Rosseta(DE3)至含 抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。然后按2%接種量分別接種到新鮮培養(yǎng)液 中，37°C培養(yǎng)至OD600約為0. 6時，加入IPTG至終濃度0. 8mmol · Λ 25°C，220rpm,誘導表達 IOh后，離心(4°C，5000rpm，15min)，菌泥用IOOmM磷酸鉀緩沖(pH7. 0)重懸，超聲破碎細胞 (功率300W，超聲5s，間歇5s，共5min)，離心(4°C, 12000rpm, 15min)，測定上清中的酶活。酶反應體系包括IOOmM 磷酸鉀緩沖液(pH6. 0)，5mM NADH, 20mM COBE, 30°C，340nm 處測定吸光值的下降。酶活定義為每分鐘內氧化lymol NADH所需要的酶量為一個酶活單 位U。蛋白采用Brandford法進行測定。結果顯示，出發(fā)大腸桿菌Rosseta (DE3)的比酶活為0. 13U/mg,而重組菌 E. coliRosseta(pET22b-PsCRII)的比酶活為15U/mg,高于能夠催化該底物COBE為(S)-CHBE的羰基還原酶的最高報道(Si的比酶活為13. 7U/mg[6])。實施例4 重組大腸桿菌 Ε. coli Rosseta(pET-22b-PsCRII)的發(fā)酵挑取重組菌Ε. coli Rosseta (pET-22b-PsCRII)至含抗生素的LB培養(yǎng)液，37°C振 蕩培養(yǎng)過夜。然后按2%接種量分別接種到新鮮培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)至0D_約為0. 6時，加 入 IPTG 至終濃度 0. 8mmol/L，25°C，220rpm，誘導表達 IOh 后，8000rpm，4°C離心 lOmin，棄上 清，沉淀備用。實施例5 取實施例4的沉淀用磷酸鉀緩沖(lOOmmol/L，pH 6. 5)洗滌兩次，稱取0. 5g (濕 重)的大腸桿菌菌泥，懸浮于15mL的pH6. 5磷酸鉀緩沖中。超聲處理細胞(功率300W，超 聲 5s，間歇 5s，共 5min)，加入葡萄糖 200mmol/L，COBE 1. 5g/L, GDH 50U, NAD 0. 05mmol/ L，20°C，180rpm，16h。產物(S)-CHBE的產量為1. 38g/L，產物的得率為92. 0%，光學純度 e. e.為 100%。實施例6:取實施例4的沉淀用磷酸鉀緩沖(lOOmmol/L，pH 7. 5)洗滌兩次，稱取Ig (濕重) 的大腸桿菌菌泥，懸浮于15mL的pH 7.5磷酸鉀緩沖中。超聲處理細胞(功率300W，超 聲 5s，間歇 5s，共 5min)，加入葡萄糖 500mmol/L，COBE 25g/L(0、l、2、8、14h 各 5g/L)，GDH 200U，NAD 0. lmmol/L，25°C，220rpm，24h。產物(S)-CHBE 的產量為 23. lg/L，產物的得率為 92. 4%，光學純度e. e.為100%。實施例7 取實施例4的沉淀用磷酸鉀緩沖(lOOmmol/L，pH 7. 0)洗滌兩次，稱取2g (濕重) 的大腸桿菌菌泥，懸浮于50mL的pH 7.0磷酸鉀緩沖中。超聲處理細胞(功率300W，超聲5s， 間歇 5s，共 5min)，加入葡萄糖 600mmol/L, COBE 35g/L (0、1、2、8、14h 各 7g/L)，GDH500U, NAD 0. 15mmol/L，30°C，240rpm，28h。產物(S)-CHBE 的產量為 32. 3g/L，產物的得率為92. 3%, 光學純度e. e. %為100%。實施例8 取實施例4的沉淀用磷酸鉀緩沖(lOOmmol/L，pH 6. 0)洗滌兩次，稱取4g (濕重) 的大腸桿菌菌泥，懸浮于50mL的pH 6.0磷酸鉀緩沖中。超聲處理細胞(功率300W，超聲5s， 間歇5s，共5min)，加入葡萄糖1. 5mol/L, 50mL乙酸正丁酯(可促進COBE的溶解并解除底 物和產物對酶和細胞的抑制作用)JnACOBE 100g/L(0、2、4、6、10各20g/L)，⑶H 3KU，NAD 0. 3mmol/L，20°C，240rpm，28h。產物(S)-CHBE 的產量為 95. 2g/L，產物的得率為-.95.2%, 光學純度e. e為100%。實施例9 取實施例4的沉淀用磷酸鉀緩沖(lOOmmol/L，pH 6. 5)洗滌兩次，稱取2g (濕重) 的大腸桿菌菌泥，懸浮于15mL的pH 6. 5磷酸鉀緩沖中。超聲處理細胞(功率300W，超聲 5s,間歇5s，共5min)，加入15mL乙酸正丁酯(可促進COBE的溶解并解除底物和產物對酶 和細胞的抑制作用)，加入葡萄糖Imol/L,C0BE 50g/L (0、2、4、6、10各10g/L)，⑶H 2KU，NAD 0. 2mmol/L,20°C,240rpm,28ho 產物(S)-CHBE 的產量為 46. 9g/L，產物的得率為-.93.8%, 光學純度e. e為100%。實施例10
7
取實施例4的沉淀用磷酸鉀緩沖(lOOmmol/L，pH 6. 5)洗滌兩次，稱取IOg(濕 重)的大腸桿菌菌泥，懸浮于200mL的pH 6. 5磷酸鉀緩沖中。超聲處理細胞(功率300W， 超聲5s，間歇5s，共5min)，加入200mL乙酸正丁酯(可促進COBE的溶解并解除底物和產 物對酶和細胞的抑制作用)，加入葡萄糖2mol/L，COBE 300g/L(0、2、4、6、10各60g/L)，⑶H 5KU，NAD 0. 5mmol/L，25°C，280rpm，32h。產物(S)-CHBE 的產量為 276. 6g/L，產物的得率為 92. 2%，光學純度e. e.為100%。實施例11 產物的檢測方法對于水相反應反應結束后，加入等體積乙酸乙酯，劇烈振蕩IOmin然后放置兩小 時，SOOOrpm離心IOmin分離有機層和水層。小心吸取上層乙酸乙酯過有機膜，加入內標，保
存測樣。對于水/有機兩相反應反應結束后SOOOrpm離心IOmin分離有機層和水層。小 心吸取上層乙酸乙酯過有機膜，加入內標，保存測樣。PEG-20M毛細管柱，內標物為萘。程序為檢測器FID，溫度210°C，汽化室溫度 210°C，柱溫 1500C，柱頭壓 0. 03MPa,氫氣 0. 05MPa,空氣 0. IMPa,尾吹 0. 08MPa。用 HPLC 對 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的旋光性進行分析(手性柱Chiralcel 0B,4. 6X 250mm ；Daicel Chemical Industries，日本)，檢測條件流動相為正己烷正己烷(9 1)，波長214nm， 流量為0. 8mL/min, R型和S型CHBE的出峰時間分別為10. 5min和11. 6min。
權利要求
一種氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰還原酶在4 氯乙酰乙酸乙酯不對稱還原制備(S) 4 氯 3羥基丁酸乙酯中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于以氨基酸序列如SEQID N0:2所示的 羰酰還原酶為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以NADH為輔因子，不對稱還原制備 (S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于表達基因序列如SEQID NO :1所示的重組 菌，經過破碎后與200mmol/L 2mol/L葡萄糖、1. 6 320g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯、50U 5KU 的葡萄糖脫氫酶和 0. 05 0. 5mmol/L 的 NAD，在 pH6. 0 7. 5、20 30°C、150 300rpm 條件下反應15 30h，得到(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰還原酶在4-氯乙酰乙酸乙酯不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應用。即以氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰還原酶為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以NADH為輔因子，不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。本發(fā)明首次將氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰還原酶應用于4-氯乙酰乙酸乙酯不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中，取得很好的效果，其酶活高達15U/mg，其對底物的得率高達91％，產物的對映體過量值為100％，且產量高，大大降低了生產成本。
文檔編號C12P7/62GK101962661SQ20101021372
公開日2011年2月2日 申請日期2010年6月29日 優(yōu)先權日2010年6月29日
發(fā)明者葉齊, 應漢杰, 張月圓, 曹厚, 栗西木, 熊健, 王艷, 陳勇 申請人:南京工業(yè)大學