專利名稱：腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體的構(gòu)建 方法。
背景技術(shù)：
腺病毒有三種核心蛋白，分別為pVII、pV和mu。這些核心蛋白與腺病毒基因組DNA 結(jié)合，在腺病毒感染細(xì)胞后，核心蛋白會(huì)隨著病毒基因組DNA進(jìn)入細(xì)胞核。因此，如果對(duì)腺 病毒的核心蛋白進(jìn)行熒光蛋白的標(biāo)記則可以觀察到病毒感染細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程。由于腺病毒基因組DNA核心蛋白基因區(qū)域沒(méi)有合適的限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，因此 通過(guò)同源重組的方法對(duì)腺病毒核心蛋白進(jìn)行成功的徹底的遺傳標(biāo)記非常困難。目前研究報(bào) 道標(biāo)記核心蛋白的方法是在不刪除腺病毒基因組原有的核心蛋白基因的前提下，在腺病毒 基因組E3區(qū)域插入CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)的核心蛋白-熒光蛋白基因表達(dá)元件，通過(guò)這種方法研 究獲得了熒光 標(biāo)記核心蛋白的腺病毒。經(jīng)過(guò)該方法標(biāo)記的腺病毒基因組同時(shí)編碼野生型核 心蛋白和熒光標(biāo)記的核心蛋白，這兩種蛋白要競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到腺病毒基因組DNA上，熒光標(biāo)記 后的核心蛋白由于分子量和蛋白體積變大，很難與野生型核心蛋白競(jìng)爭(zhēng)，因此熒光蛋白標(biāo) 記的核心蛋白結(jié)合到病毒基因組DNA上的效率很低，這樣得到病毒大部分是未經(jīng)標(biāo)記或部 分標(biāo)記的病毒顆粒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決技術(shù)問(wèn)題在于克服上述熒光蛋白標(biāo)記的核心蛋白結(jié)合到病毒基 因組DNA上效率很低的缺點(diǎn)，提供一種能快速、腺病毒核心蛋白完全能夠標(biāo)記的腺病毒核 心蛋白遺傳標(biāo)記載體的構(gòu)建方法。解決上述技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案它是由下述步驟組成1、構(gòu)建向腺病毒基因組核心蛋白DNA序列3’端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的穿梭載體采用酶切連接的方式將合成的DNA片段連入pUC19質(zhì)粒載體，pUC19質(zhì)粒載體為 市場(chǎng)上銷售的商品，由英國(guó)NEB公司生產(chǎn)，獲得的陽(yáng)性克隆命名為PUG19M，采用聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)擴(kuò)增核心蛋白DNA序列上下游序列，將獲得的核心蛋白上下游DNA片段連入pUC19M載 體；將含有一個(gè)酶切位點(diǎn)的篩選基因連入含有核心蛋白上下游序列的PUC19M載體，獲得向 腺病毒基因組核心蛋白DNA序列3’端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的穿梭載體。2、引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體將步驟1中獲得的腺病毒基因組核心蛋白DNA序列3’端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的穿 梭載體經(jīng)雙酶切回收后與重組腺病毒載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Bj5183感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)鑒定后獲 得引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體。3、構(gòu)建標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白穿梭載體采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得標(biāo)記基因的DNA序列，將標(biāo)記基因序列連入含有核心蛋 白上下游序列的PUC19M載體，經(jīng)過(guò)鑒定獲得標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白的穿梭載體；
4、構(gòu)建標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白腺病毒質(zhì)粒載體將步驟3中獲得的標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白的穿梭載體經(jīng)雙酶切回收后與經(jīng)過(guò)線性化的引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體共轉(zhuǎn)化Bj5183感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)鑒定后獲得 標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白的腺病毒質(zhì)粒載體。5、標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白腺病毒的包裝及純化將線性化的標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白腺病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，擴(kuò)增、分 離、純化，得到標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白的腺病毒，在冰箱內(nèi)-80°C保存。本發(fā)明的穿梭載體為任何含有核心蛋白開(kāi)放閱讀框上下游SOObp IOkb DNA序 列的任何載體。本發(fā)明的篩選基因包括抗性基因或半乳糖苷酶基因。本發(fā)明的標(biāo)記基因包括熒光蛋白基因或熒光素酶基因。本發(fā)明的核心蛋白DNA序列3’端引入的酶切位點(diǎn)為重組腺病毒載體本身所不含 有的任何酶切位點(diǎn)。本發(fā)明的重組腺病毒載體為下列載體中的任意一種(1)用數(shù)均分子量為4000 8000的聚乙二醇化學(xué)修飾或不修飾的重組腺病毒載 體；(2)腺病毒載體衣殼蛋白的遺傳修飾或不修飾的重組腺病毒載體；(3)條件復(fù)制型重組腺病毒載體；(4)攜帶至少一個(gè)治療基因或小干擾RNA的條件復(fù)制型的重組腺病毒載體；(5)攜帶至少一個(gè)治療基因或小干擾RNA的非復(fù)制型的重組腺病毒載體；本發(fā)明的核心蛋白為腺病毒的核心蛋白ΥΠ或核心蛋白V或核心蛋白X。本發(fā)明采用一種新的標(biāo)記腺病毒核心蛋白的方法，該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)腺病毒核心蛋 白真正意義的遺傳水平上的熒光標(biāo)記，這種標(biāo)記方法刪除了腺病毒基因組中的原有的核心 蛋白基因，因此采用本發(fā)明的方法標(biāo)記腺病毒核心蛋白，可以獲得的100%被熒光蛋白標(biāo)記 的病毒顆粒。


圖1是用于組裝核心蛋白pVII上下游同源臂的穿梭質(zhì)粒載體示意圖。圖2是核心蛋白pVII上下游同源臂連入穿梭質(zhì)粒載體后的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是通過(guò)同源重組獲得的引入特異SfuI酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體結(jié)構(gòu)示意 圖。圖4是核心蛋白pVII被紅色熒光蛋白mCherry標(biāo)記后的腺病毒載體的結(jié)構(gòu)示意 圖。圖5是核心蛋白pVII被綠色熒光蛋白eGFP標(biāo)記后的腺病毒載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖6是核心蛋白pVII被熒光素酶Luciferase標(biāo)記后的腺病毒載體的結(jié)構(gòu)示意 圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1以紅色熒光蛋白(mCherry)標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒載體的構(gòu)建過(guò)程為例其構(gòu) 建方法步驟如下1、構(gòu)建向腺病毒基因組核心蛋白DNA序列3’端引入單一酶切位點(diǎn)的穿梭載體通過(guò)酶切連接方式將合成的DNA序列連入pUC19質(zhì)粒載體，pUC19質(zhì)粒載體為市 場(chǎng)上銷售的商品，由英國(guó)NEB公司生產(chǎn)，通過(guò)質(zhì)粒提取酶切鑒定以及測(cè)序獲得陽(yáng)性克隆，將 陽(yáng)性克隆命名為PUC19M，載體結(jié)構(gòu)如圖1所示，由圖1可見(jiàn)，合成的DNA序列包含以下酶切 位點(diǎn)=Xbal-BamHl-SfuI-XhoI-ClaI。以腺病毒基因組DNA為模板設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別用來(lái)擴(kuò)增用于同源重組的核心蛋 白DNA序列上下游1500bp的DNA序列，上游DNA序列包含腺病毒的核心蛋白ΥΠ本身的DNA 序列。Ρ1-Ρ4為兩對(duì)引物的序列
Pl:ATCTAGACATTCCCGCACTGTTGGATGTGGACGCCTAP2 :TGGATCCACCTCCACCTCCGTTGCGCGGGGGGCGGGTGCGP3 :ACTCGAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTCP4 :TATCGATTGCGCCTGCAAGGCCACGGATGCAATT聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 2分鐘，30個(gè)循 環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段。將回收的 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物與pGEMT-easy載體連接。連接條件為pGEMT-eaSy載體0. 5 μ 1，聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)回收產(chǎn)物4 μ 1，2 X T4DNA快速連接酶緩沖液5 μ 1，T4DNA快速連接酶0. 5 μ 1， 25°C反應(yīng)1個(gè)小時(shí)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 α細(xì)胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的 LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí) 后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性克隆。將所獲得的陽(yáng)性克隆 分別命名為 pGEMT/pVII no stop up 和 pGEMT/pVII HRdown。將 pVII no stop up 片段從 pGEMT/pVII no stop up載體上經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切下來(lái)，經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳回收 后連入同樣經(jīng)XbaI和BamHI酶切過(guò)的穿梭載體中。連接條件是4μ 1酶切純化片段，5 μ 1 2父140嫩連接酶緩沖液，0.5111酶切載體，0.5111 Τ4 DNA連接酶。連接產(chǎn)物采用同樣的方 法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，命名為pUC19M pVII up shuttle。將pVII HR down片段從pGEMT/pVII HR down載體上經(jīng)XhoI和ClaI雙酶切下來(lái)，經(jīng)1 %瓊脂糖凝 膠電泳回收后連入同樣經(jīng)XhoI和ClaI雙酶切的pUC19M pVII up shuttle載體中。連接 條件是4μ 1酶切純化片段，5μ 1 2XT4DNA連接酶緩沖液，0. 5μ 1酶切載體，0. 5μ 1 Τ4 DNA連接酶。連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，命名為 PUC19M pVII up down shuttle，該載體的結(jié)構(gòu)如圖2所示，由圖2可見(jiàn)，核心蛋白pVII基 因及其上下游基因序列連入PUC19M載體中。將兩端酶切位點(diǎn)為BamHI和SfuI位點(diǎn)的β -半乳糖苷酶基因(LacZa)表達(dá)元件 連入經(jīng)過(guò)BamHI和SfuI雙酶切的pUC19M-pVII up down shuttle載體，該β -半乳糖苷酶 基因(LacZa)表達(dá)元件也可采用氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素等篩選基因中的任意一種 替換。連接條件是4μ1酶切純化片段，5μ1 2\140嫩連接酶緩沖液，0.541酶切載體， 0.5μ1 Τ4 DNA連接酶。連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，命名為 pUC19M-pVII up down/LacZa shuttle。2、引入單一的酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體將pUC19M-pVII up down/LacZa shuttle 經(jīng) XbaI 和 ClaI 雙酶切，經(jīng) 1 %瓊脂糖 凝膠電泳回收大片段后與用數(shù)均分子量為4000 8000的聚乙二醇化學(xué)修飾的重組腺病 毒質(zhì)粒載體pAd5EB214共轉(zhuǎn)化Bj5183感受態(tài)細(xì)胞，也可用不經(jīng)數(shù)均分子量為4000 8000 的聚乙二醇化學(xué)修飾的重組腺病毒載體，涂布于含有100μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板并 加入50 μ 1的40mg/ml的Χ-gal進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。經(jīng)搖菌、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽(yáng) 性克隆，命名為pAd5EB214/LaCZa ，該腺病毒骨架質(zhì)粒載體中被引入單一 SfuI的酶切位點(diǎn)， 該載體的結(jié)構(gòu)如圖3所示，上述的單一 SfuI的酶切位點(diǎn)，也可采用PacI、SwaI中的任意一 個(gè)。由圖3可見(jiàn)穿梭載體的pVII up down/LacZaDNA序列與腺病毒骨架質(zhì)粒同源重組后 將SfuI位點(diǎn)引入腺病毒骨架質(zhì)粒載體中。3、構(gòu)建紅色熒光蛋白(mCherry)標(biāo)記核心蛋白pVII穿梭載體根據(jù)mCherry基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增mCherry基因，P1-P2為mCherry基因 擴(kuò)增引物Pl:AAGATCTGGAGGTGGCGGAATGGTGAGCAAGGGCGAGP2 TGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCAT聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 2分鐘，30個(gè)循 環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段。將回收的 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物與pGEMT-easy載體連接。連接條件為pGEMT-eaSy載體0. 5 μ 1，聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)回收產(chǎn)物4 μ 1，2 X T4DNA快速連接酶緩沖液5 μ 1，T4DNA快速連接酶0. 5 μ 1， 25°C反應(yīng)1個(gè)小時(shí)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 α細(xì)胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的 LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí) 后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。將所獲得陽(yáng)性克隆命名為 pGEMT/mCherry。將mCherry基因片段從pGEMT/mCherry載體上經(jīng)BglII和SalI雙酶切回收后連 入經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切的pUC19M pVII up down shuttle載體中。連接條件是4 μ 1酶 切純化片段，5 μ 1 2 X T4DNA連接酶緩沖液，0. 5 μ 1酶切載體，0. 5 μ 1 T4DNA連接酶。連接 產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，命名為pUC19M pVII up down/mCherry shuttle。4、構(gòu)建紅色熒光蛋白mCherry標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒質(zhì)粒載體將pUC19M-pVII up down/mCherry shuttle 質(zhì)粒載體經(jīng) ClaI 和 XbaI 雙酶切， 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳大片段后與經(jīng)SfuI線性化的腺病毒骨架載體pAd5 EB214/LacZa 共轉(zhuǎn)化Bj5183，涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板并加入50 μ 1的40mg/ml 的X-gal用來(lái)藍(lán)白斑篩選。經(jīng)搖菌、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，命名為pAd5 EB214/mCherry，此載體即為紅色熒光標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒質(zhì)粒載體，該載體的結(jié)構(gòu) 如圖4所示，由圖4可見(jiàn)，紅色熒光蛋白基因mCherry插入在核心蛋白pVII下游，形成 pVII-mCherry 融合蛋白。5、紅色熒光蛋白mCherry標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒的包裝及純化將PacI線性化的熒光標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒質(zhì)粒載體pAd5 EB214/mCherry轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，7-10天后收獲病毒，經(jīng)過(guò)HEK293細(xì)胞大量擴(kuò)增后采用氯化銫密度梯度離 心純化病毒，獲得mCHerry標(biāo)記核心蛋白的腺病毒Ad5/pVII-mCherry，在冰箱內(nèi)_80°C內(nèi)保存。實(shí)施例2以綠色熒光蛋白(eGFP)標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒載體的構(gòu)建過(guò)程為例其構(gòu)建方 法步驟如下1、腺病毒基因組核心蛋白DNA序列3’端引入單一的酶切位點(diǎn)的穿梭載體
以腺病毒基因組DNA為模板設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別用來(lái)擴(kuò)增用于同源重組的核心蛋 白DNA序列上下游800bp的DNA序列，上游DNA序列包含腺病毒的核心蛋白ΥΠ本身的DNA 序列。Ρ1-Ρ4為兩對(duì)引物的序列Pl:ATCTAGACGCGCCCGCCAGCCCCCACCATCACCACCGP2 :TGGATCCACCTCCACCTCCGTTGCGCGGGGGGCGGGTGCGP3 :ACTCGAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTCP4 :TATCGATGAGGCAACCGGGGACGTTTGTGTCTCC聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 1分鐘，30個(gè)循 環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段。將回收的 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物與pGEMT-easy載體連接。該步驟中的其他步驟與實(shí)施例1相同2、引入單一的酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體引入單一的酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體的構(gòu)建過(guò)程與實(shí)施例1相同，獲得成功引 入單一的酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體pAd5EB214/LaCZa。3、構(gòu)建綠色熒光蛋白eGFP標(biāo)記核心蛋白pVII穿梭載體以綠色熒光蛋白eGFP基因序列為模板設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增eGFP基因，P1-P2為eGFP基 因擴(kuò)增引物Pl:AAGATCTGGAGGTGGCGGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGP2 TGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 2分鐘，30個(gè)循 環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段。將回收的 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物與pGEMT-easy載體連接。連接條件為pGEMT-eaSy載體0. 5 μ 1，聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)回收產(chǎn)物4 μ 1，2 X T4DNA快速連接酶緩沖液5 μ 1，T4DNA快速連接酶0. 5 μ 1， 25°C反應(yīng)1個(gè)小時(shí)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 α細(xì)胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的 LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí) 后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。將所獲得陽(yáng)性克隆命名為 pGEMT/eGFP。將eGFP基因片段從pGEMT/eGFP載體上經(jīng)BgIII和SalI雙酶切回收后連入經(jīng) BamHI和XhoI雙酶切的pUC19M pVII up down shuttle載體中。連接條件是4 μ 1酶切純化 片段，5μ1 2\140嫩連接酶緩沖液，0.5111酶切載體，0.5111 T4DNA連接酶。連接產(chǎn)物采 用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，命名為pUC19M-pVII up down/ eGFP shuttle。
4、構(gòu)建綠色熒光蛋白eGFP標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒質(zhì)粒載體綠色熒光蛋白eGFP標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建過(guò)程與實(shí)施例1相 同，獲得eGFP標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒質(zhì)粒載體PAd5EB214/eGFP，該載體的結(jié)構(gòu)如圖5 所示，由圖5可見(jiàn)，綠色熒光蛋白基因eGFP插入在核心蛋白pVII下游，形成pVII-eGFP融
合蛋白ο5、綠色熒光蛋白eGFP標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒的包裝及純化
綠色熒光蛋白eGFP標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒的包裝及純化與實(shí)施例1相同，最 終獲得eGFP標(biāo)記核心蛋白pVII的腺病毒Ad5/pVII_eGFP。本實(shí)施例中用于標(biāo)記核心蛋白pVII的綠色熒光蛋白基因eGFP也可用黃色熒光蛋 白基因YFP、藍(lán)色熒光蛋白基因EBFP、青色熒光蛋白基因ECFP等熒光蛋白基因替換。實(shí)施例3以熒光素酶Iuciferase標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒載體的構(gòu)建過(guò)程為例其構(gòu)建方 法步驟如下1、構(gòu)建腺病毒基因組核心蛋白DNA序列3、端引入單一的酶切位點(diǎn)的穿梭載體以腺病毒基因組DNA為模板設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別用來(lái)擴(kuò)增用于同源重組的核心蛋 白DNA序列上下游IOkb的DNA序列，上游DNA序列包含腺病毒的核心蛋白ΥΠ本身的DNA序 列。Ρ1-Ρ4為兩對(duì)引物的序列Pl:ATCTAGAAAGGTCAACGCTGGTGGCTACCTCTCCGCGP2 :TGGATCCACCTCCACCTCCGTTGCGCGGGGGGCGGGTGCGP3 :ACTCGAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTCP4 :TATCGATTCGGCGAACGGGCAGTGCCGGCGGCGC聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 10分鐘，30個(gè)循 環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段。將回收的 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物與pGEMT-easy載體連接。該步驟中的其他步驟與實(shí)施例1相同。2、引入單一的酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體引入單一的酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體的構(gòu)建過(guò)程與實(shí)施例1相同，獲得成功引 入單一的酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體pAd5EB214/LaCZa。3、構(gòu)建熒光素酶Iuciferase標(biāo)記核心蛋白pVII穿梭載體以熒光素酶Iuciferase基因序列為模板設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Iuciferase基因，P1-P2為 Iuciferase基因擴(kuò)增引物Pl:AAGATCTATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGP2 :TTCTAGATTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTCTTGG聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 2分鐘，30個(gè)循 環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段。將回收的 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物與pGEMT-easy載體連接。連接條件為pGEMT-eaSy載體0. 5 μ 1，聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)回收產(chǎn)物4 μ 1，2 X T4DNA快速連接酶緩沖液5 μ 1，T4DNA快速連接酶0. 5 μ 1， 25°C反應(yīng)1個(gè)小時(shí)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 α細(xì)胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的 LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。將所獲得陽(yáng)性克隆命名為 pGEMT/luciferase。將Iuciferase基因片段從pGEMT/luciferase載體上經(jīng)BglII和XbaI雙酶切回 收后連入經(jīng)BamHI和XhaI雙酶切的pUC19M pVII up down shuttle載體中。連接條件是 4μ 1酶切純化片段，5μ 1 2\140嫩連接酶緩沖液，0.5111酶切載體，0.5111 T4DNA連接 酶。連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，命名為pUC19M pVII up down/luciferase shuttle。4、構(gòu)建熒光素酶luciferase標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒質(zhì)粒載體熒光素酶Iuciferase標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建過(guò)程與實(shí)施例1 相同，獲得Iuciferase標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒質(zhì)粒載體pAd5EB214/luciferase，該載 體的結(jié)構(gòu)如圖6所示，由圖6可見(jiàn)，熒光素酶基因Iuciferasw插入在核心蛋白pVII下游， 形成pVII-luciferase融合蛋白。5、熒光素酶Iuciferase標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒的包裝及純化熒光素酶Iuciferase標(biāo)記核心蛋白pVII腺病毒的包裝及純化與實(shí)施例1相同， 獲得Iuciferase標(biāo)記核心蛋白pVII的腺病毒Ad5/pVII_luciferase。實(shí)施例4在以上的實(shí)施例1 3的步驟1中，所用的pVII no stop up片段用pVno stop up片段替換，pVIIHR down片段用pV HR down片段替換，pGEMT/pVII HR down載體用 pGEMT/pV HR down載體替換，該步驟的其他步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。在步驟2中，所用的 pUC19M-pVII up down/LacZashuttle 用 pUC19M-pV up down/LacZa shuttle 替換，該步驟 的其他步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。在步驟3中，所用的pUC19MpVII up down shuttle載體 用pUC19M-pV up down shuttle載體替換，該步驟的其他步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。在步驟 4 中，所用的 pUC 19M-pVII up down/mCherry shuttle 質(zhì)粒載體用 pUC 19M-pV up down/ mCherry shuttle質(zhì)粒載體替換，該步驟的其他步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。在步驟5中，所 用的PVII腺病毒質(zhì)粒載體用pV腺病毒質(zhì)粒載體替換，該步驟的其他步驟與相應(yīng)的實(shí)施例 相同。構(gòu)建成腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體。實(shí)施例5在以上的實(shí)施例1 3的步驟1中，所用的pVIIno stop up片段用pXno stop up片段替換，pVIIHR down片段用ρΧ HR down片段替換，pGEMT/pVII HR down載體用 pGEMT/pX HR down載體替換，該步驟的其他步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。在步驟2中，所用的 pUC19M-pVII up down/LacZashuttle用pUC 19M_pX up down/LacZa shuttle替換，該步驟的其他步驟與相應(yīng) 的實(shí)施例相同。在步驟3中，所用的pUC19M-pVII up down shuttle載體用pUC19M_pX up down shuttle載體替換，該步驟的其他步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。在步驟4中，所用的pUC 19M-pVII up down/mCherry shuttle質(zhì)粒載體用 pUC19M_pX up down/mCherry shuttle質(zhì) 粒載體替換，該步驟的其他步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。在步驟5中，所用的pVII腺病毒質(zhì) 粒載體用PX腺病毒質(zhì)粒載體替 換，該步驟的其他步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。構(gòu)建成腺病毒 核心蛋白遺傳標(biāo)記載體。實(shí)施例6
在以上的實(shí)施例1 5的步驟2中，所用的經(jīng)數(shù)均分子量為4000 8000的聚乙 二醇化學(xué)修飾或不修飾的重組腺病毒載體用腺病毒載體衣殼蛋白的遺傳修飾或不修飾的 重組腺病毒載體替換。其他步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。構(gòu)建成腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載 體。實(shí)施例7在以上的實(shí)施例1 5的步驟2中，所用的經(jīng)數(shù)均分子量為4000 8000的聚乙 二醇化學(xué)修飾或不修飾的重組腺病毒載體用條件復(fù)制型重組腺病毒載體替換。其他步驟與 相應(yīng)的實(shí)施例相同。構(gòu)建成腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體。實(shí)施例8在以上的實(shí)施例1 5的步驟2中，所用的經(jīng)數(shù)均分子 量為4000 8000的聚乙 二醇化學(xué)修飾或不修飾的重組腺病毒載體用攜帶2個(gè)治療基因的條件復(fù)制型重組腺病毒 載體替換，也可用攜帶1個(gè)小干擾RNA的條件復(fù)制型的重組腺病毒載體替換。其他步驟與 相應(yīng)的實(shí)施例相同。構(gòu)建成腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體。實(shí)施例9在以上的實(shí)施例1 5的步驟2中，所用的經(jīng)數(shù)均分子量為4000 8000的聚乙
二醇化學(xué)修飾或不修飾的重組腺病毒載體用攜帶1個(gè)治療基因的非復(fù)制型重組腺病毒載 體替換，也可用攜帶2個(gè)小干擾RNA的條件復(fù)制型的重組腺病毒載體替換。其他步驟與相 應(yīng)的實(shí)施例相同。構(gòu)建成腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體。
權(quán)利要求
一種腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體的構(gòu)建方法，其特征在于它是由下述步驟組成(1)構(gòu)建向腺病毒基因組核心蛋白DNA序列3’端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的穿梭載體采用酶切連接的方式將合成的DNA片段連入pUC19質(zhì)粒載體，獲得的陽(yáng)性克隆命名為pUC19M，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增核心蛋白DNA序列上下游序列，將獲得的核心蛋白上下游DNA片段連入pUC19M載體；將含有一個(gè)酶切位點(diǎn)的篩選基因連入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M載體，獲得向腺病毒基因組核心蛋白DNA序列3’端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的穿梭載體；(2)引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體將步驟(1)中獲得的腺病毒基因組核心蛋白DNA序列3’端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的穿梭載體經(jīng)雙酶切回收后與重組腺病毒載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Bj5183感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)鑒定后獲得引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體；(3)構(gòu)建標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白穿梭載體采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得標(biāo)記基因的DNA序列，將標(biāo)記基因序列連入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M載體，經(jīng)過(guò)鑒定獲得標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白的穿梭載體；(4)構(gòu)建標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白腺病毒質(zhì)粒載體將步驟(3)中獲得的標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白的穿梭載體經(jīng)雙酶切回收后與經(jīng)過(guò)線性化的引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體共轉(zhuǎn)化Bj5183感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)鑒定后獲得標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白的腺病毒質(zhì)粒載體；(5)標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白腺病毒的包裝及純化將線性化的標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白腺病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，擴(kuò)增、分離、純化，得到標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白的腺病毒，在冰箱內(nèi) 80℃保存。
2.按照權(quán)利要求1所述的腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體的構(gòu)建方法，其特征在于所 說(shuō)的穿梭載體為任何含有核心蛋白開(kāi)放閱讀框上下游SOObp IOkb DNA序列的任何載體。
3.按照權(quán)利要求1所述的腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體的構(gòu)建方法，其特征在于所 說(shuō)的篩選基因包括抗性基因或半乳糖苷酶基因。
4.按照權(quán)利要求1所述的腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體的構(gòu)建方法，其特征在于所 說(shuō)的標(biāo)記基因包括熒光蛋白基因或熒光素酶基因。
5.按照權(quán)利要求1所述的腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體的構(gòu)建方法，其特征在于所 說(shuō)的核心蛋白DNA序列3’端引入的酶切位點(diǎn)為重組腺病毒載體本身所不含有的任何酶切 位點(diǎn)。
6.按照權(quán)利要求1所述的腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體的構(gòu)建方法，其特征在于所 說(shuō)的重組腺病毒載體為下列載體中的任意一種(1)用數(shù)均分子量為4000 8000的聚乙二醇化學(xué)修飾或不修飾的重組腺病毒載體；(2)腺病毒載體衣殼蛋白的遺傳修飾或不修飾的重組腺病毒載體；(3)條件復(fù)制型重組腺病毒載體；(4)攜帶至少一個(gè)治療基因或小干擾RNA的條件復(fù)制型的重組腺病毒載體；(5)攜帶至少一個(gè)治療基因或小干擾RNA的非復(fù)制型的重組腺病毒載體。
7.按照權(quán)利要求1或2所述的腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體的構(gòu)建方法，其特征在于 所說(shuō)的核心蛋白為腺病毒的核心蛋白VD或核心蛋白V或核心蛋白X。全文摘要
一種腺病毒核心蛋白遺傳標(biāo)記載體的構(gòu)建方法，由構(gòu)建向腺病毒基因組核心蛋白DNA序列3’端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的穿梭載體、引入一個(gè)酶切位點(diǎn)的腺病毒骨架載體、構(gòu)建標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白穿梭載體、構(gòu)建標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白腺病毒質(zhì)粒載體、標(biāo)記基因標(biāo)記核心蛋白腺病毒的包裝及純化組成。本發(fā)明采用一種新的標(biāo)記腺病毒核心蛋白的方法，該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)腺病毒核心蛋白真正意義的遺傳水平上的熒光標(biāo)記，這種標(biāo)記方法刪除了腺病毒基因組中的原有的核心蛋白基因，因此采用本發(fā)明的方法標(biāo)記腺病毒核心蛋白，可以獲得的100％被熒光蛋白標(biāo)記的病毒顆粒。
文檔編號(hào)C12N15/65GK101935671SQ20101021477
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者夏海濱, 趙俊麗 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)