專利名稱：一種檢測(cè)基因家族中基因種類的方法及專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)基因家族中基因種類的方法及專用試劑盒。
技術(shù)背景 小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾娜蠹Z食作物(小麥、水稻和玉米)之一，世界上每年總產(chǎn) 量達(dá)到6億噸以上(http://faostat· fao. org/) 0小麥在我國得到了廣泛的種植，我國的 小麥種植面積、總產(chǎn)量和消費(fèi)量皆居世界首位，目前是我國的第三大糧食作物，僅次于水稻 和玉米。小麥之所以能夠在世界各地得到很好的發(fā)展，最關(guān)鍵的是小麥具有獨(dú)特的特性，其 面粉可以被加工成各種各樣的面食，如面包、蛋糕、餅干、面條和饅頭等。這種獨(dú)特特性的 形成主要依賴于小麥籽粒儲(chǔ)藏蛋白——面筋蛋白的結(jié)構(gòu)和相互作用，即小麥面粉加工品質(zhì) 的好壞主要取決于面筋蛋白的數(shù)量和質(zhì)量。這些面筋蛋白之間可以通過很強(qiáng)的共價(jià)鍵和非 共價(jià)鍵相互作用，賦予面團(tuán)粘彈特性。面筋蛋白主要包括醇溶蛋白(Gliadin)和麥谷蛋白 (Glutenin)，其中麥谷蛋白可以通過分子間二硫鍵形成大聚體，影響面團(tuán)的彈性和強(qiáng)度。麥 谷蛋白按其分子量大小又分為高分子量麥谷蛋白亞基(high molecular weight glutenin subunits，簡稱 HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(low molecular weight glutenin subunits,簡稱LMW-GS)，二者是面筋蛋白的主要成份，與小麥的加工品質(zhì)密切相關(guān)，賦予面 團(tuán)彈性，共同決定小麥面粉加工品質(zhì)。高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)基因拷貝數(shù)較少，分子量較大，易于通過 SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，其等位基因變異與小麥品質(zhì)的關(guān)系已經(jīng)得到了廣泛深入的研究。 LMW-GS基因大多數(shù)被定位到第一同源群1A、1B和ID染色體的短臂末端，命名為Glu_A3、 Glu-B3和Glu-D3位點(diǎn)，其基因的拷貝數(shù)目前尚不清楚。通過Southern印跡分析，在六倍體 普通小麥中LMW-GS基因的拷貝數(shù)可能為10-15個(gè)，也有研究認(rèn)為可能為35-40個(gè)。LMW-GS 基因沒有內(nèi)含子，是一個(gè)單一的開放閱讀框，其編碼序列一般含有900-1200個(gè)堿基，其編 碼的成熟蛋白亞基的分子量大小約30-45kDa。一般而言，LMW-GS可以分成信號(hào)肽(20個(gè)氨 基酸殘基)、N-末端區(qū)(13個(gè)氨基酸殘基)、重復(fù)區(qū)域和C-末端區(qū)四個(gè)部分，而且C-末端 區(qū)域可進(jìn)一步細(xì)分為3個(gè)區(qū)，分別是C-I區(qū)、C-II區(qū)和C-III區(qū)(圖1)。由于低分子量麥谷蛋白亞基對(duì)小麥面粉加工品質(zhì)的形成具有重要作用，對(duì)其編碼 基因的數(shù)目和組成的探索一直是小麥品質(zhì)改良課題的研究熱點(diǎn)。對(duì)LMW-GS基因的分離和 克隆，早期是通過探針雜交篩選文庫的方法獲得的。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，同源基因克隆作 為一種快速可靠的方法，在小麥及其近緣物種的LMW-GS基因研究中得到廣泛應(yīng)用。Zhao 等分析了多個(gè)小麥品種Glu-D3位點(diǎn)的基因組成，發(fā)現(xiàn)在一個(gè)品種中存在6個(gè)編碼基因； Wang等對(duì)Glu-B3位點(diǎn)基因的分析，發(fā)現(xiàn)了 4個(gè)編碼基因，共有17種單體型；而Zhang等 對(duì)Glu-A3位點(diǎn)編碼i類蛋白的基因做了分析，但是對(duì)基因和單體型的數(shù)目并未形成具體 的結(jié)論。隨著基因文庫技術(shù)的發(fā)展，對(duì)LMW-GS基因的組成有了更深入的研究。Ikeda等利 用cDNA文庫的篩選和常規(guī)PCR的方法從Norin61中分離得到了 12類LMW-GS基因，并利 用中國春缺四體將這些基因分別定位到了 Glu-A3(3類)、Glu-B3(2類)和Glu_D3 (7類)位點(diǎn)上。Huang等利用BAC文庫篩選的方法，從Glenlea中分離得到了 19個(gè)LMW-GS基因， 其中12個(gè)基因具有完整的開放讀碼框，染色體定位分析表明，1個(gè)基因位于Glu-A3位點(diǎn) (EU189087)，2 個(gè)基因位于 Glu_B3 位點(diǎn)(EU189088and EU189089)，而 Glu_D3 位點(diǎn)有 9 個(gè)基 因(EU189090-EU189098)。以上研究極大地豐富了人們對(duì)低分子量麥谷蛋白亞基基因組成 的認(rèn)識(shí)。但是，由于LMW-GS基因數(shù)目較多，常規(guī)同源克隆的方法具有很大的盲目性，而且 操作繁瑣；而文庫構(gòu)建和篩選的方法則工作量太大，效率低。目前為止，尚沒有簡便有效的 方法分離鑒定LMW-GS基因，無法明確LMW-GS基因的數(shù)目和組成，這極大地阻礙了對(duì)不同 LMW-GS與面粉品質(zhì)形成之間關(guān)系的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種一種輔助檢測(cè)目的基因家族的基因種類的方法。本發(fā)明所提供的輔助檢測(cè)目的基因家族的基因種類的方法，包括如下步驟1)根據(jù)待測(cè)目的基因家族的已知基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)；所述待測(cè)目的基因家族 的基因均具有保守序列區(qū)I和保守序列區(qū)II，且所述保守序列區(qū)I和所述保守序列區(qū)II之 間的序列在所述目的基因家族的不同基因間具有多態(tài)性；所述引物對(duì)中的一條引物序列位 于所述保守序列區(qū)I中，所述引物對(duì)中的另一條引物序列位于所述保守序列區(qū)II中；2)用步驟1)得到的引物對(duì)對(duì)待測(cè)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3)檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，根據(jù)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性確定所述待 測(cè)材料中待測(cè)目的基因家族的基因種類。上述方法中，所述目的基因家族為麥谷蛋白基因家族。
上述方法中，所述多態(tài)性為長度多態(tài)性。上述方法中，所述麥谷蛋白基因家族為低分子量麥谷蛋白亞基基因家族；上述方法中，所述保守序列區(qū)I和保守序列區(qū)II之間的序列具有重復(fù)序列。上述方法中，所述待測(cè)材料為小麥。上述方法中，所述待測(cè)材料為小麥品種。上述方法中，所述引物對(duì)為如下1)或2)或3)所示1)SEQ ID 1, SEQ ID 2 ；2) SEQ ID 1, SEQ ID 3 ；3)由如下a、b和c所示引物對(duì)組成a.SEQ ID 4, SEQ ID 5 ；b、SEQ ID :6，SEQ ID :7 ；c、SEQ ID :8，SEQ ID :9。上述方法中，所述根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性確定所述待測(cè)材料中待測(cè)目的基因 家族的基因種類的方法為將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度種類數(shù)目作為所述待測(cè)目的基因家 族中的基因種類數(shù)目；(即一種長度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)一種基因)。所述檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度多態(tài)性的方法為如下I或II所示I、用DNA分析儀對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到的信號(hào)峰的數(shù)目即為 所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度種類數(shù)目；所述引物對(duì)用熒光基團(tuán)標(biāo)記；II、對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種輔助檢測(cè)目的基因家族中基因種類的試劑盒。本發(fā)明所提供的輔助檢測(cè)目的基因家族中基因種類的試劑盒，為如下1)或2)或 3)所示的引物對(duì)1)SEQ ID 1, SEQ ID 2 ；2) SEQ ID 1, SEQ ID 3 ；3)由如下a、b和c所示引物對(duì)組成a.SEQ ID 4, SEQ ID 5 ；b、SEQ ID :6，SEQ ID :7 ；c、SEQ ID :8，SEQ ID :9。上述試劑盒中，所述目的基因家族為麥谷蛋白基因家族。上述試劑盒中，所述麥谷蛋白基因家族為低分子量麥谷蛋白基因家族。本發(fā)明的目的是為解決普通小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因的分離鑒定的技術(shù) 問題，提供一種檢測(cè)方法，有助于快速有效地分離鑒定小麥LMW-GS基因。該方法是基于普 通小麥品種中LMW-GS基因的特點(diǎn)序列間部分區(qū)域的保守性及長度多態(tài)性(即中間重復(fù)區(qū) 兩端的序列具有很高的保守性，重復(fù)區(qū)的序列又具有很高的長度多態(tài)性)，在保守的區(qū)域設(shè) 計(jì)基因間保守的PCR引物，通過PCR的方法擴(kuò)增得到這些LMW-GS基因的DNA片段，然后通 過一定的檢測(cè)方法(3730DNA分析儀)來展示這些DNA片段之間的多態(tài)性，進(jìn)而可以達(dá)到鑒 定一個(gè)小麥品種中所有LMW-GS基因的目的。應(yīng)用該策略可以建立基因分子標(biāo)記檢測(cè)體系， 對(duì)LMW-GS基因進(jìn)行快速有效的分離鑒定，也可以對(duì)其他麥類作物的LMW-GS基因進(jìn)行分離 鑒定；這種分子標(biāo)記體系構(gòu)建策略也可以進(jìn)一步推廣到對(duì)具有類似的序列保守性和長度多 態(tài)性的復(fù)雜多基因家族的成員分離鑒定。本發(fā)明方法中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究的結(jié)果以及Genbank中的LMW-GS基因序列所 設(shè)計(jì)的引物，用保守引物進(jìn)行LMW-GS基因分離鑒定的驗(yàn)證試驗(yàn)證明了該引物的保守性和 有效性，也表明了該分子標(biāo)記體系的準(zhǔn)確性和可靠性。本發(fā)明方法，無需昂貴的儀器和試劑，通過常規(guī)的PCR儀和3730DNA分析儀就可以 完成，易于操作。本發(fā)明方法基于3730DNA分析儀極高的靈敏度和分辨率，可以有效分離并 準(zhǔn)確鑒定不同的LMW-GS基因。在本發(fā)明方法中，通過一次PCR反應(yīng)可以檢測(cè)一個(gè)小麥品種 中幾乎所有的LMW-GS基因，而且PCR儀和3730DNA分析儀都是高自動(dòng)化和高通量的儀器， 一人一天可以分析近三百個(gè)小麥品種。本發(fā)明方法克服了傳統(tǒng)的同源克隆測(cè)序方法的繁復(fù) 性和無目的性，也無需耗費(fèi)大量的人力物力構(gòu)建和篩選基因文庫，極大地提高了 LMW-GS基 因鑒定的效率和準(zhǔn)確性。本發(fā)明的基于序列保守性和長度多態(tài)性的分子標(biāo)記構(gòu)建策略，不僅適用于低分子 量麥谷蛋白亞基基因分子標(biāo)記檢測(cè)體系的構(gòu)建，同樣適用于具有序列保守性和長度多態(tài)性 的多基因家族分子標(biāo)記檢測(cè)體系的構(gòu)建。該發(fā)明將直接促進(jìn)LMW-GS基因家族成員數(shù)目、組 成以及LMW-GS對(duì)小麥面粉加工品質(zhì)形成的貢獻(xiàn)等研究的深入開展。


圖1典型的小麥低分子量麥谷蛋白亞基一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。Sig，信號(hào)肽，N_ter，N末端區(qū)；R印，重復(fù)區(qū)；C-ter I，II和III，C末端I區(qū)，II區(qū)和III區(qū)。圖2普通小麥小偃54低分子量麥谷蛋白亞基序列比對(duì)分析。Sig，信號(hào)肽，N_ter，N末端區(qū)；R印，重復(fù)區(qū)；C-ter I，II和III，C末端I區(qū)，II區(qū) 和III區(qū)?？蛑兴谐龅臄?shù)字展示了不同低分子量麥谷蛋白亞基之間在重復(fù)區(qū)域的長度多 態(tài)性。圖3低分子量麥谷蛋白亞基基因保守的PCR引物在基因中的具體位置。圖中框表示保守引物所在的區(qū)域。三套引物分別是LMWGS1(LMW_GS1，2F與 LMW-GS1R)，LMWGS2(LMWGS1，2F 與 LMWGS2R)和 LMWGS3(LMWGS3aF 與 LMWGS3aR，LMWGS3bF 與 LMWGS3bR, LMWGS3cF 與 LMWGS3cR)。圖4利用保守引物對(duì)小偃54低分子量麥谷蛋白亞基基因進(jìn)行分析，利用瓊脂糖凝 膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。圖5利用保守引物對(duì)小偃54低分子量麥谷蛋白亞基基因進(jìn)行分析，利用3730DNA 分析儀檢測(cè)PCR產(chǎn)物。橫軸表示DNA片段大小，縱軸表示信號(hào)強(qiáng)度，即PCR產(chǎn)物的量的多少； 圖中的空心峰表示分子量標(biāo)準(zhǔn)(1200 LIZ Standard內(nèi)標(biāo))，實(shí)心峰表示PCR產(chǎn)物中的特異 DNA片段，對(duì)應(yīng)著一個(gè)特異的低分子量麥谷蛋白亞基基因。圖6利用保守引物對(duì)中國春低分子量麥谷蛋白亞基基因進(jìn)行分析，利用3730DNA 分析儀檢測(cè)PCR產(chǎn)物。橫軸表示DNA片段大小，縱軸表示信號(hào)強(qiáng)度，即PCR產(chǎn)物的量的多 少；圖中的空心峰表示分子量標(biāo)準(zhǔn)(1200LIZ Standard內(nèi)標(biāo))，實(shí)心峰表示PCR產(chǎn)物中的特 異DNA片段，對(duì)應(yīng)著一個(gè)特異的低分子量麥谷蛋白亞基基因。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、檢測(cè)小麥品種小偃54低分子量麥谷蛋白基因家族中基因種類數(shù)目一、引物設(shè)計(jì)首先利用ClustalW2軟件將普通小麥小偃54的低分子量麥谷蛋白進(jìn)行多序列比 對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些蛋白序列存在兩個(gè)特點(diǎn)序列保守性和長度多態(tài)性(圖2)。由圖2可以發(fā)現(xiàn)， 第一、信號(hào)肽區(qū)(Sig)、N-末端區(qū)(N-ter)和C-末端I區(qū)(C_ter I)在不同蛋白序列之間 存在很高的保守性；第二、LMW-GS序列間在重復(fù)區(qū)域(Rep)存在很高的長度多態(tài)性，圖2中 的一組數(shù)字(134，137，140，150，182，184，197，199，200，230，238)可以很好地展現(xiàn)這種多 態(tài)性。基于這兩個(gè)特點(diǎn)，提出了一種LMW-GS基因檢測(cè)策略根據(jù)保守的區(qū)域的編碼序列設(shè) 計(jì)基因間保守的PCR引物，通過PCR的方法擴(kuò)增得到這些LMW-GS基因的DNA片段，然后檢 測(cè)(利用3730DNA分析儀)展示這些DNA片段之間的多態(tài)性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)小麥品種中 所有LMW-GS基因的分離鑒定。將小偃54中的LMW-GS基因進(jìn)行了多序列比對(duì)，根據(jù)其保守的區(qū)域(信號(hào)肽區(qū)、 N-末端區(qū)和C-末端I區(qū)的編碼序列)的編碼序列設(shè)計(jì)PCR引物。為了提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性
7和準(zhǔn)確度，設(shè)計(jì)了 3套PCR引物，分別是LMWGS 1、LMWGS2和LMWGS3。LMWGSl和LMWGS2均有一對(duì)引物組成，理論上他們均可以擴(kuò)增一個(gè)小麥品種中所有的LMW-GS基因，而LMWGS3由三 對(duì)獨(dú)立的引物組成(LMWGS3a，LMWGS3b和LMWGS3c)(圖3)，分別可以擴(kuò)增不同的LMW-GS基 因，這些基因共同組成小麥中的LMW-GS基因家族。這三套保守引物的所得到的檢測(cè)結(jié)果可 以相互驗(yàn)證。為了進(jìn)一步提高所設(shè)計(jì)PCR保守引物的代表性，利用關(guān)鍵詞“(low glutenin) 0R(lmw glutenin) OR(LMW GS) AND Triticum AND Complete”，從Genbank 中下載了 384條完 整的LMW-GS基因序列，并將它們進(jìn)行了多序列比對(duì)。然后將所設(shè)計(jì)的PCR引物與Genbank 中的序列進(jìn)行比較，并根據(jù)所發(fā)現(xiàn)的差異將設(shè)計(jì)的PCR保守引物進(jìn)行修正，提高所設(shè)計(jì)引 物的保守性，使所設(shè)計(jì)的保守PCR引物能夠代表目前已知的所有LMW-GS基因(表1)。表1、低分子量麥谷蛋白亞基基因的兼并保守PCR引物 *表示的是該引物5’端被6FAM標(biāo)記。二、PCR 擴(kuò)增小偃54種子購自河南舞陽縣種子公司。利用CTAB法從小偃54的幼苗中提取基 因組DNA。由于LMW-GS基因序列中G/C含量較高，所以在PCR反應(yīng)中使用LATaq酶(Takara 公司產(chǎn)品)。首先在Takara公司合成熒光基團(tuán)6FAM標(biāo)記的引物，利用表1的引物以小偃 54基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系如下LA Taq (5U/ μ L) (Takara 公司) 0. 2 μ LIOXbuffer II(Mg2+)2μ L
dNTP (2mM)4 u L上游引物(6iiM)luL下游引物(6iiM)luLddH2010. 8u L模板DNA (lOOng/ u L)1 u L_反應(yīng)體系為20iiL利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR的擴(kuò)增效果(圖4)，由于瓊脂糖電泳的分辨率比較 低，只能檢測(cè)到2條清晰的條帶，無法充分展示PCR產(chǎn)物的長度多態(tài)性。為了進(jìn)一步檢測(cè) PCR產(chǎn)物的組成，采用3730DNA分析儀，該儀器具有很高的分辨率，可達(dá)lbp，已被廣泛應(yīng)用 于DNA片段分析研究中，例如微衛(wèi)星標(biāo)記、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性和DNA足跡分析。三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物種類檢測(cè)用ddH20將PCR產(chǎn)物稀釋為原濃度的1/30，取稀釋產(chǎn)物1 y L到一個(gè)新的96孔板 (ABI公司產(chǎn)品)中，每孔再加入7 iiL甲酰胺(含有0. liiL LIZ-1200size standard) (ABI 公司產(chǎn)品)，將混合物在95°C條件下變性5分鐘，然后在冰上靜置10分鐘。利用3730DNA分析儀對(duì)變性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5。利用 GeneMapper軟件分析檢測(cè)到的信號(hào)峰所對(duì)應(yīng)的DNA片段大小(表2)?？梢园l(fā)現(xiàn)保守引物 LMWGS1和LMWGS2的PCR產(chǎn)物均分別可檢測(cè)到有15個(gè)和16個(gè)信號(hào)峰，綜合引物L(fēng)MWGS3中 三對(duì)引物的檢測(cè)結(jié)果，也可以發(fā)現(xiàn)16個(gè)信號(hào)峰(A，7個(gè)信號(hào)峰；B，6個(gè)信號(hào)峰；1，3個(gè)信號(hào) 峰)。比較三套PCR引物的檢測(cè)結(jié)果(圖5)，可以發(fā)現(xiàn)不同引物的PCR產(chǎn)物的信號(hào)峰是彼 此對(duì)應(yīng)的，即三套保守引物的PCR產(chǎn)物檢測(cè)圖譜之間存在很高的一致性。利用本發(fā)明的方 法可以從小偃54中檢測(cè)到17個(gè)信號(hào)峰，即17個(gè)DNA片段，相當(dāng)于可以檢測(cè)到17個(gè)LMW-GS 基因，這與從小偃54中分離得到13個(gè)LMW-GS基因(FJ7553302至FJ7553307，和FJ7553309 至FJ7553315)的結(jié)果比較吻合。表2、利用分子標(biāo)記體系從小偃54中實(shí)際檢測(cè)到的DNA片段的驗(yàn)證分析 相似性是指檢測(cè)到的基因與數(shù)據(jù)庫中的基因的相似性，F(xiàn)J755302至FJ755307和 FJ755309至FJ755315是已報(bào)道的小偃54中的LMW-GS基因；一表示無該片段；N表示應(yīng)當(dāng)有該DNA片段，但沒有檢測(cè)到；LGS2-477, LGS2-590, LGS2-655，LGS2-690 為檢測(cè)到的 4 個(gè)新的 LMW-GS 基因。四、利用測(cè)序的方法驗(yàn)證低分子量麥谷蛋白基因分子標(biāo)記體系的有效性已知小偃54中分離得到14個(gè)LMW-GS基因，其中13個(gè)基因具有完整的DNA序列， 另外的1個(gè)基因由于轉(zhuǎn)座子的插入而使基因分成兩個(gè)部分。為了驗(yàn)證保守引物PCR得到的 17個(gè)DNA片段是否都是LMW-GS基因的序列，將3730DNA分析儀檢測(cè)到的DNA片段大小與理 論的DNA片段大小進(jìn)行了比較(表2)。DNA片段的實(shí)際檢測(cè)大小與理論分析大小存在一定 的偏差，這種偏差是由于3730DNA分析儀的系統(tǒng)誤差造成的，剔除這種系統(tǒng)誤差，可以發(fā)現(xiàn) 實(shí)際檢測(cè)值和理論值之間可以很好地匹配。分析發(fā)現(xiàn)13個(gè)已知LMW-GS基因均可以從PCR 產(chǎn)物中找到其對(duì)應(yīng)的DNA片段，即從片段長度上來講，檢測(cè)的DNA片段均可以與已知的基因 很好地匹配。更進(jìn)一步，為了驗(yàn)證檢測(cè)到的這17個(gè)DNA片段是否是LMW-GS基因，將PCR產(chǎn)物 進(jìn)行了 pGEM-T載體連接和轉(zhuǎn)化，然后再用熒光標(biāo)記的PCR保守引物進(jìn)行菌落PCR，利用 3730DNA分析儀對(duì)菌落PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，分離含有目標(biāo)大小DNA片段的克隆，通過測(cè)序得 到DNA片段的序列。將得到的序列與小偃54中已知的基因進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中的13 個(gè)DNA片段的序列與已知基因的序列完全一致，相似性達(dá)到了 100%。除了可以檢測(cè)到已知 的13個(gè)基因，通過該分子標(biāo)記體系還鑒定得到了 4個(gè)新的DNA片段(477，590，655和690 ； 以引物L(fēng)MWGS2擴(kuò)增得到的DNA片段大小來表示)，序列分析表明，它們都屬于LMW-GS基因。 通過在線Blast分析發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)序列與Genbank中的LMW-GS基因具有很高的相似性，達(dá) 到97%以上。進(jìn)而根據(jù)DNA片段的大小，將這4個(gè)新基因分別命名為LGS-477，LGS-590，
10LGS-655和LGS-690。DNA片段大小比較和序列比對(duì)的分析結(jié)果表明，三套保守引物所擴(kuò)增 的DNA片段都屬于LMW-GS基因。這些結(jié)果都表明了所建立的LMW-GS分子標(biāo)記體系的準(zhǔn)確 性和有效性，也證實(shí)了該分子標(biāo)記體系構(gòu)建策略的可行性。實(shí)施例2、檢測(cè)小麥品種中國春低分子量麥谷蛋白基因家族中基因種類數(shù)目一、引物設(shè)計(jì)采用實(shí)施例1中所 設(shè)計(jì)的各對(duì)低分子量麥谷蛋白基因保守引物(表1)。二、PCR 擴(kuò)增中國春購自河南舞陽縣種子公司。利用表1的引物以中國春幼苗的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系如下LA Taq (5U/ μ L) (Takara 公司) 0. 2 μ LIOXbuffer II(Mg2+)2μ LdNTP (2mM)4 μ L上游引物(6μ Μ)1 μ L下游引物(6μ Μ)1 μ LddH2010. 8 μ L模板DNA (1 OOng/ μ L)1 μ L_反應(yīng)體系為20 μ L三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物種類檢測(cè)用ddH20將PCR產(chǎn)物稀釋為原濃度的1/30，取稀釋產(chǎn)物1 μ L到一個(gè)新的96孔板 (ABI公司產(chǎn)品)中，每孔再加入7μ L甲酰胺(含有0. IyL LIZ-1200 size standard) (ABI 公司產(chǎn)品)，將混合物在95°C條件下變性5分鐘，然后在冰上靜置10分鐘。利用3730DNA分析儀對(duì)變性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖6。利用 GeneMapper分析檢測(cè)到的信號(hào)峰所對(duì)應(yīng)的DNA片段大小(表3)。可以發(fā)現(xiàn)保守引物L(fēng)MWGSl 和LMWGS2的PCR產(chǎn)物均分別可檢測(cè)到有15個(gè)和14個(gè)信號(hào)峰，綜合引物L(fēng)MWGS3中三對(duì)引 物的檢測(cè)結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)16個(gè)信號(hào)峰(A，7個(gè)信號(hào)峰；B，7個(gè)信號(hào)峰；I，2個(gè)信號(hào)峰)。比較 三套PCR引物的檢測(cè)結(jié)果(圖6)，可以發(fā)現(xiàn)不同引物的PCR產(chǎn)物的信號(hào)峰是彼此對(duì)應(yīng)的，即 三套保守引物的PCR產(chǎn)物檢測(cè)圖譜之間存在很高的一致性。利用本發(fā)明的方法，通過PCR 反應(yīng)和3730DNA分析儀，從中國春中檢測(cè)到了 16個(gè)信號(hào)峰，即16個(gè)DNA片段，對(duì)應(yīng)著16個(gè) LMW-GS 基因。四、利用利用測(cè)序的方法驗(yàn)證低分子量麥谷蛋白基因分子標(biāo)記體系的有效性為了驗(yàn)證檢測(cè)到的DNA片段是否都是LMW-GS基因，將這些DNA片段進(jìn)行了測(cè)序。 對(duì)于中國春的LMW-GS基因已經(jīng)有初步的研究，在Genbank中也存在一些序列，進(jìn)一步將DNA 片段的序列與數(shù)據(jù)庫中發(fā)表的中國春中的LMW-GS基因序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)DNA片段序列可 以與以報(bào)道的序列只存在個(gè)別的SNP的差異，相似性均在99%以上(表3)。這樣，除了已經(jīng) 報(bào)道的8個(gè)LMW-GS基因之外，利用本發(fā)明的方法在中國春中還檢測(cè)得到了 8個(gè)新LMW-GS基 因的DNA片段。在中國春中的檢測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步證明了本發(fā)明檢測(cè)方法準(zhǔn)確性和可靠性。表3、利用分子標(biāo)記體系從中國春中實(shí)際檢測(cè)到的DNA片段的驗(yàn)證分析 序列號(hào)(Genbank)中所列出的是數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的中國春中的LMW-GS基因序列。一表示無該片段；N表示應(yīng)當(dāng)有該DNA片段，但沒有檢測(cè)到。實(shí)施例3、檢測(cè)其他小麥品種低分子量麥谷蛋白基因家族中基因種類數(shù)目利用本發(fā)明方法已經(jīng)有效分析了小麥育種中的骨干親本(200多份)的低分子量 麥谷蛋白基因的組成，用于指導(dǎo)分子育種實(shí)踐，隨機(jī)選取其中的12個(gè)品種進(jìn)行展示。一、引物設(shè)計(jì)采用實(shí)施例1中所設(shè)計(jì)的各對(duì)低分子量麥谷蛋白基因保守引物(表1)。二、PCR 擴(kuò)增所用的小麥品種，小偃6，陜253，PH-82-2，鄭農(nóng)16，農(nóng)大340，PH85-16，農(nóng)大135，PH3259，白春5號(hào)，小偃81，農(nóng)大195，農(nóng)大1193，均購自河南舞陽縣種子公司，利用常規(guī)的 CTAB法提取基因組DNA。利用表1的引物以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系如下LA Taq (5U/ u L) (Takara 公司)0. 2 ii L10XbufferII (Mg2+) 2 u LdNTP (2mM)4 u L上游引物(6iiM)luL下游引物(6iiM)luLddH2010. 8u L模板DNA(100ng/ u L) 1 u L_反應(yīng)體系為20iiL三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物種類檢測(cè)用ddH20將PCR產(chǎn)物稀釋為原濃度的1/30，取稀釋產(chǎn)物1 ii L到一個(gè)新的96孔板 (ABI公司產(chǎn)品)中，每孔再加入7 iiL甲酰胺(含有0. liiL LIZ-1200size standard) (ABI 公司產(chǎn)品)，將混合物在95°C條件下變性5分鐘，然后在冰上靜置10分鐘。利用3730DNA分析儀對(duì)變性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用GeneMapper 3. 5進(jìn) 行分析，檢測(cè)到的信號(hào)峰所對(duì)應(yīng)的DNA片段大小整理在表4中。再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，根 據(jù)測(cè)序結(jié)果判定的基因長度多態(tài)性數(shù)目與用3730DNA分析儀判定的基因長度多態(tài)性數(shù)目 一致，即用測(cè)序方法檢測(cè)出的基因種類數(shù)目結(jié)果與用3730DNA分析儀方法檢測(cè)出的基因種 類數(shù)目是一致的。為了便于理解和容易比較，在表4中只呈現(xiàn)了保守引物L(fēng)MWGS2為代表的DNA片 段。利用該保守引物，在每個(gè)小麥品種中均可以檢測(cè)到十幾個(gè)信號(hào)峰，即十幾個(gè)DNA片段， 對(duì)應(yīng)著十幾個(gè)LMW-GS基因。比較這12個(gè)小麥品種的檢測(cè)結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)DNA片段492、 499、501、637、655、682和684在這些小麥品種中是普遍存在的，序列分析也表明，具有相同 大小的DNA片段在序列組成上具有很高的相似性(彡98% )，只存在個(gè)別的SNP。另外，其 他基因的不同等位變異之間存在長度的差異，如477與485(Glu-A3)，但是序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)， 這兩種等位變異之間也存在很高的序列相似性(》95% )，僅在重復(fù)區(qū)域存在相應(yīng)的序列 缺失。這些比較結(jié)果表明，在不同的小麥品種中，LMW-GS基因的不同等位變異是很保守的， 某個(gè)DNA片段與LMW-GS基因的特定等位變異是一一對(duì)應(yīng)的，可以利用本發(fā)明的方法，通過 檢測(cè)PCR產(chǎn)物DNA片段的組成來判定某個(gè)小麥品種中的LMW-GS基因家族成員的組成。表4.利用分子標(biāo)記體系對(duì)小麥育種中的骨干親本(隨機(jī)選取其中的12個(gè)品種) 的LMW-GS基因組成進(jìn)行分析。
權(quán)利要求
一種輔助檢測(cè)目的基因家族的基因種類的方法，包括如下步驟1)根據(jù)待測(cè)目的基因家族的已知基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)；所述待測(cè)目的基因家族的基因均具有保守序列區(qū)I和保守序列區(qū)II，且所述保守序列區(qū)I和所述保守序列區(qū)II之間的序列在所述目的基因家族的不同基因間具有多態(tài)性；所述引物對(duì)中的一條引物序列位于所述保守序列區(qū)I中，所述引物對(duì)中的另一條引物序列位于所述保守序列區(qū)II中；2)用步驟1)得到的引物對(duì)對(duì)待測(cè)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3)檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，根據(jù)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性確定所述待測(cè)材料中待測(cè)目的基因家族的基因種類。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因家族為麥谷蛋白基因家族；所述多態(tài)性為長度多態(tài)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述麥谷蛋白基因家族為低分子量 麥谷蛋白亞基基因家族；所述保守序列區(qū)I和保守序列區(qū)II之間的序列具有重復(fù)序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述待測(cè)材料為小麥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述待測(cè)材料為小麥品種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述引物對(duì)為如下1)或2)或 3)所示1)SEQID :1，SEQ ID 32)SEQID 1, SEQ ID 2 ；3)由如下a、b和c所示引物對(duì)組成a、SEQID 4, SEQ ID 5 ；b、SEQID 6, SEQ ID 7 ；c、SEQID :8, SEQ ID :9。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性確定所述待測(cè)材料中待測(cè)目的基因家族的基因種類 的方法為將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度種類數(shù)目作為所述待測(cè)目的基因家族中的基因種類 數(shù)目；所述檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度多態(tài)性的方法為如下I或II所示I、用DNA分析儀對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到的信號(hào)峰的數(shù)目即為所述 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度種類數(shù)目；所述引物對(duì)用熒光基團(tuán)標(biāo)記；II、對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
8.一種輔助檢測(cè)目的基因家族中基因種類的試劑盒，為如下1)或2)或3)所示的引物對(duì)1)SEQID :1，SEQ ID 32)SEQID 1, SEQ ID 2 ；3)由如下a、b和c所示引物對(duì)組成a、SEQID 4, SEQ ID 5 ；b、SEQID 6, SEQ ID 7 ；C、SEQ ID 8, SEQ ID :9。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于所述目的基因家族為麥谷蛋白基因家族。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于所述麥谷蛋白基因家族為低分子量麥谷蛋白基因家族。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)基因家族中基因種類的方法及專用試劑盒。該試劑盒，為如下1)、2)或3)所示的引物對(duì)1)SEQ ID1，SEQ ID2；2)SEQ ID1，SEQ ID3；3)由如下a、b和c所示引物對(duì)組成a、SEQ ID4，SEQ ID5；b、SEQ ID6，SEQ ID7；c、SEQ ID8，SEQ ID9。利用該引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)合毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，可以簡便而有效地分離普通小麥低分子量麥谷蛋白基因組成。本發(fā)明方法，無需昂貴的儀器和試劑，通過常規(guī)的PCR儀和DNA分析儀就可以完成，易于操作。通過一個(gè)PCR反應(yīng)可以檢測(cè)一個(gè)小麥品種中幾乎所有的LMW-GS基因，簡便而且具有很高的通量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101871012SQ20101021970
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月28日
發(fā)明者劉冬成, 孫家柱, 張愛民, 張相岐, 張肖飛, 王道文, 郭小麗, 陽文龍 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所