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豬促甲狀腺激素釋放激素受體基因trhr的克隆及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:584535閱讀:375來源:國知局
專利名稱:豬促甲狀腺激素釋放激素受體基因trhr的克隆及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于家豬分子輔助選育技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種豬促甲狀腺激素釋放激素 受體基因TRHR的克隆及其單核苷酸多態(tài)性的檢測方法和作為豬生產(chǎn)性狀的分子遺傳標(biāo)記 應(yīng)用。
背景技術(shù)
隨著人民生活水平的提高,對豬肉需求量以及豬肉品質(zhì)的提高已引起了生產(chǎn)者和 消費者的廣泛關(guān)注。豬是我國人民肉制品消費的重要商品來源,而且它也是研究人類異種 移植的重要動物模型并可能成為合適的移植器官供應(yīng)源。養(yǎng)豬業(yè)在我國畜牧業(yè)和國民經(jīng)濟 中有重要地位,胴體品質(zhì)評定已成為遺傳、育種學(xué)家、生產(chǎn)者以及消費者普遍關(guān)心的問題。 所以分離克隆影響豬生長和胴體品質(zhì)性狀的新基因并尋找重要的分子標(biāo)記用于豬標(biāo)記輔 助選擇,對加速豬新品種的選育,加快我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展具有極其重要的價值。下丘腦合成和分泌的促甲狀腺激素釋放激素(Thyrotropin-releasinghormone, TRH)作用于垂體,與垂體表面的促甲狀腺激素釋放激素受體(Thyrotropin-releasing hormone receptor,TRHR)結(jié)合激活胞內(nèi)信使通路,促進促甲狀腺激素和催乳素的分泌和合 成。其中促甲狀腺激素經(jīng)血液循環(huán)至甲狀腺與位于其表面的促甲狀腺激素受體結(jié)合,啟動 胞內(nèi)信使通路,促進甲狀腺對碘的運轉(zhuǎn)和攝取以及甲狀腺激素合成和分泌。而甲狀腺激素 作用遍及全身,主要功能為促進組織分化、生長和成熟,促進三大營養(yǎng)物質(zhì)和能量代謝,應(yīng) 激以及維持個體正常生長發(fā)育等。此外,甲狀腺激素在機體內(nèi)有產(chǎn)熱作用,影響蛋白質(zhì)、脂 肪、糖、維生素和水鹽的代謝,并對消化、吸收、心血管、性腺、骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)均有重要作用 (陳守良,1996)。實驗表明,在豬飼料中添加甲狀腺素可提高個體的采食量且不影響肉料 比(重慶市飼料公司飼料研究所,1996),有效提高豬的生長速度。因此,調(diào)控甲狀腺激素分 泌水平的促甲狀腺激素和促甲狀腺激素釋放激素及其受體基因是影響豬生長和胴體性狀 的重要功能候選基因。然而目前國內(nèi)外關(guān)于豬甲狀腺激素分泌相關(guān)調(diào)控基因的研究寥寥無 幾。最近,Liu等的研究顯示人類促甲狀腺激素釋放激素受體TRHR基因中存在的變異是導(dǎo) 致人類個體瘦體重差異的主要原因。TRHR 屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體超家族(G protein-coupled receptor superfamily, GPCR)的視紫素/β-腎上腺素受體家族(Family A)。1990年,從小鼠垂體腫瘤cDNA文庫 克隆得到第一個TRH受體。隨后,其垂直同源受體在其他物種中也得到克隆,包括大鼠、 牛、雞、羊、非洲爪蟾、白鯉以及人類等,但未見有關(guān)豬TRHR基因的報道。本專利申請人利用 輻射雜種細胞系定位等技術(shù)將豬TRHR基因定位到豬4號染色體上,發(fā)現(xiàn)相應(yīng)區(qū)域存在多個 影響日增重、胴體長、背膘厚和肉質(zhì)性狀相關(guān)的QTL,表明豬TRHR基因是一個重要的生長和 胴體品質(zhì)相關(guān)基因。但到目前為止,國內(nèi)外對豬TRHR基因的研究還是空白。研究突變位點 在群體中的多態(tài)性,并進行性狀關(guān)聯(lián)分析是研究基因功能的一個非常有利的手段。所以申 請人克隆了這個基因的cDNA序列和部分DNA序列并進行了多態(tài)研究和關(guān)聯(lián)分析,以期能夠 揭示它的功能并運用于豬的分子輔助標(biāo)記選擇中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷,提供一種豬促甲狀腺激素釋放激素受體基 因TRHR的克隆及其應(yīng)用。本發(fā)明克隆與豬生產(chǎn)性狀相關(guān)的促甲狀腺激素釋放激素受體基 因TRHR的cDNA編碼序列全長及DNA序列,并利用該基因的多態(tài)性位點作為豬生產(chǎn)性狀的 分子標(biāo)記的應(yīng)用,為豬的育種提供一種新的標(biāo)記輔助選擇。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)實現(xiàn)一種豬促甲狀腺激素釋放激素受體基因TRHR, 它的cDNA序列為SEQ ID NO :1所示的序列,它具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3所示的
基因序列。該cDNA序列長度為1469bp,序列中包含1198bp的開放閱讀框,233bp的5,非翻 譯區(qū)和38bp的3,非翻譯區(qū)。序列表SEQ ID NO 2的第442bp處有一個T442-C442堿基突 變,以及第626bp處有一個G626-T626堿基突變。一上述的基因TRHR在豬分子標(biāo)記輔助選擇和動物基因工程中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是,本發(fā)明克隆與豬生產(chǎn)性狀相關(guān)的促甲狀腺激素釋放激素受 體基因TRHR的cDNA編碼序列全長及DNA序列,并利用該基因的多態(tài)性位點作為豬生產(chǎn)性 狀的分子標(biāo)記的應(yīng)用,為豬的育種提供一種新的標(biāo)記輔助選擇。


圖1是本發(fā)明設(shè)計和優(yōu)化的快速突變檢測技術(shù)所依據(jù)的Tetra primersARMS-PCR 方法原理示意圖;圖中,上、下游外引物(黑色箭頭表示)擴增包含此多態(tài)位點的大片段, 上、下游內(nèi)引物(紅色和藍色箭頭表示)分別擴增兩等位基因中的一種;圖2是本發(fā)明中豬TRHR基因T442-C442多態(tài)性座位的分型電泳圖譜;圖中,M泳 道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);圖3是本發(fā)明中豬TRHR基因G626-T626多態(tài)性座位的分型電泳圖譜;圖中,M泳 道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實施例方式本發(fā)明首先克隆得到豬促甲狀腺激素釋放激素受體基因TRHR,它的cDNA序列如 序列表SEQ ID NO :1所述,該序列全長為1469bp,序列中包含1198bp的開放閱讀框,233bp 的5’非翻譯區(qū)和38bp的3’非翻譯區(qū)。即在該序列中,第l-233bp處為5,UTR,第234-1431 位 CDS,第 1432-1469 位為 3,UTR。在此基礎(chǔ)上,獲得了豬TRHR基因的部分DNA序列如序列表SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3所述。其中SEQ ID NO 2的DNA片段長度為2188bp,第1-159位為第1外顯子序 列,第160-711位為第1內(nèi)含子,第712-1582位為第2外顯子,第1583-2188為部分第2內(nèi) 含子序列;SEQ ID NO 3的DNA片段長度為947bp,第1-539位為第2內(nèi)含子部分序列,第 540-947位為第3外顯子。所獲得的豬TRHR基因部分DNA序列中有如序列表SEQ ID NO :2所述的一個 T442-C442堿基突變和一個G626-T626突變?;趖etra primers ARMS-PCR方法原理設(shè)計 并優(yōu)化用于檢測序列表SEQ ID NO :2中兩個突變的快速分型技術(shù)具體見實施例部分。
本發(fā)明中分子標(biāo)記的克隆及其制備方法按照以下步驟進行(1)利用GeneBank數(shù)據(jù)庫中已知豬TRHR部分DNA序列(959bp)與人TRHR基因 DNA序列和mRNA序列進行比對分析,獲得豬TRHR基因第2外顯子部分序列;設(shè)計3’ RACE 引物,其中豬TRHR基因特異引物序列如SEQ IDNO :4和SEQ ID NO :5所示,上游外引物GGTGTCTTTTATGTTGTGCCAAT上游內(nèi)引物TCAACAGCACAGTATCTTCAAGG提取豬垂體組織總RNA ;3'RACE PCR擴增和純化回收產(chǎn)物、克隆并測序;通過序列 分析獲得如SEQ ID NO :1所述的序列。根據(jù)此序列設(shè)計了一對引物,可從豬垂體組織cDNA 中擴增到一長為1256bp,編碼豬促甲狀腺激素釋放激素受體蛋白完整序列的PCR產(chǎn)物,該 產(chǎn)物可應(yīng)用于動物基因工程領(lǐng)域;所用引物序列如SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所示
上游引物TTTCAGAGAAACCTCAAGCCACT下游引物TCTTTGTCATACATTTTCTTCTACTCPCR 擴增條件為94°C預(yù)變性 3min ;94°C 30s,58°C 45s, 72°C Imin 30s,40 個循 環(huán);72°C延伸 IOmin0(2)根據(jù)序列表SEQ ID NO 1所述的cDNA序列,搜索多個豬基因組數(shù)據(jù)庫,篩選 豬DNA序列片斷。然后設(shè)計引物進行PCR擴增和測序分析,最后確證獲得如序列表SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所述的豬TRHR基因DNA序列。相關(guān)引物序列如SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 17 所示FO TTGGAAAGGGCTGTGAGGGTTTAG,RO :AGGCTGTGATTGAACAAGAGGAG ;FlTTGAGAGGAAAGGAGGCAGA,Rl:AGGCTGAAGCTGTGTTTGGT ;F2 GGGAGAGAACCACTGCGATA,R2 :ATGGATGTGAAAGCCCAGAC ;F3 :ATCTGTCACCCCATCAAAGC,R3 :ATTCTGGTTTTGCCATCAGC ;F4 CACTTTTGGAGCCGTGAGTAAAC,R4 :GGAATTTCTGGGACATGAGATTG。下面根據(jù)附圖和實施例詳細說明本發(fā)明,本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。實施例1 (一)基于Tetra primers ARMS-PCR原理建立的檢測序列表SEQ ID NO :2所述 的一個T442-C442堿基突變的診斷方法。采集代測個體血樣或耳樣樣本提取基因組,基因組DNA采用傳統(tǒng)酚/氯仿抽提 法提取,經(jīng)紫外分光光度計檢測DNA純度和濃度后,以滅菌蒸餾水稀釋到lOng/μ 1。通過 tetra primers ARMS-PCR 在線弓I物設(shè)計程序(http //cedar. Renetics. soton. ac. uk/ public html/primerl. html)設(shè)計突變分型引物。T442-C442堿基突變的分型引物如SEQ ID NO 18 SEQ ID NO 21 所示上游內(nèi)引物GATAGCAGATATTGTTTAGGTTTTTTCAAT下游內(nèi)引物AATGCTCCCTGTTTTGAGAGTGCTAAG
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上游外引物GAAATTGTTCTCTGTTGGGTCTGTAAG下游外引物AGTAATTGGGTTCATAGGTACTCCTGAAPCR 擴增程序均為94°C預(yù)變性 3min ;94°C 30s,60°C lmin,72°C lmin,35 個循 環(huán);72°C延伸 lOmin。擴增體系為 10μ 1,其中模板DNA 20ng,rTaq 0. 4U(Takara公司),IOmM dNTPs 0. 2 μ 1,10 XBuffer 1. O μ 1,10 μ M 的上游外引物 0. 08 μ 1、下游外引物 0. 12μ 1、上 游內(nèi)引物0. 4 μ 1、下游內(nèi)引物0. 4 μ 1。PCR產(chǎn)物用2 %瓊脂糖凝膠檢測。結(jié)果如附圖2所示非突變特異條帶為443bp,即不管個體為何種突變基因型,均 能獲得443bp的條帶;等位基因T特異產(chǎn)物為200bp,即如果存在T442突變,會出現(xiàn)200bp 的條帶;等位基因C特異產(chǎn)物為300bp,即如果存在C442突變,會出現(xiàn)300bp的條帶。如果 個體為T442和C442雜合子,則可同時獲得200bp和300bp條帶;若為純合子則僅出現(xiàn)其相 應(yīng)的突變條帶。(二)基于Tetra primers ARMS-PCR原理建立的檢測序列表SEQ ID NO :2所述 的一個G626-T626堿基突變的診斷方法?;蚪MDNA提取及引物設(shè)計方法同上。G626-T626堿基突變的分型引物SEQ ID NO 22 SEQ ID NO 25 所示上游內(nèi)引物ACCCAATTACTGCAGATAAATGGAAT下游內(nèi)引物GTAACTCTCACATCCTCTCTTTTCGTC上游外引物CTTCTTTATTGTACTTTTCCCAAGCATC下游外引物TCACTTACTGTCTCGTTTTCCATCTTTAPCR 擴增程序均為94°C預(yù)變性 3min ;94°C 30s, 60°C lmin,72°C lmin,35 個循 環(huán);72°C延伸 lOmin。擴增體系為 10μ 1,其中模板DNA 20ng,rTaq 0. 4U(Takara公司),IOmM dNTPs 0.2 μ 1, IOXBuffer 1.0 μ 1,10 μ M 的上游外引物 0. 08 μ 1、下游外引物 0.08 μ 1、上 游內(nèi)引物0. 8 μ 1、下游內(nèi)引物0. 4 μ 1。PCR產(chǎn)物用2 %瓊脂糖凝膠檢測。結(jié)果如附圖3所示非突變特異條帶為460bp,即不管個體為何種突變基因型,均 能獲得460bp的條帶;等位基因G特異產(chǎn)物為296bp,即如果存在G626突變,會出現(xiàn)296bp 的條帶。等位基因T特異產(chǎn)物為217bp,即如果存在T626突變,會出現(xiàn)217bp的條帶。如果 個體為G626和T626雜合子,則可同時獲得296bp和217bp條帶;若為純合子則僅出現(xiàn)其相 應(yīng)的突變條帶。實施例2 豬TRHR基因多態(tài)性在不同豬群中的分布在4個國外豬種(皮特蘭、長白、杜洛 克、約克夏豬)和2個中國豬種(金華豬和嘉興黑豬)共228頭豬中采用實施例1所述的突 變檢測技術(shù)進行SNP分型。檢測結(jié)果如表1所示。T442-C442在所檢測的幾個豬種中,國外 豬群以及嘉興黑豬均為T等位基因占優(yōu)勢,而在金華豬中以C等位基因占優(yōu)勢。G626-T626 在所檢測的幾個豬種中,中國豬種與國外豬種等位基因頻率差別較大,國外豬種為T等位 基因占優(yōu)勢,而中國豬種嘉興黑豬和金華豬均固定為等位基因G。表1.六個豬種中TRHR基因多態(tài)性的基因型和基因頻率 實施例3 豬TRHR基因多態(tài)性標(biāo)記與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析申請人選擇了 354頭金華豬X 皮特蘭豬F2代作為關(guān)聯(lián)分析試驗材料,分析的性狀包括日增重、胴體長、頭重、胴體重、后 腿重、后腿肌肉重、后腿脂肪重、蹄重、板油重、四點背膘厚(肩最厚處、6-7肋間、最后肋和 腰薦結(jié)合處)、平均背膘厚、眼肌面積、系水力、肌內(nèi)水份、肌內(nèi)蛋白、肌內(nèi)脂肪以及后腿肌肉 和眼肌的PH值、導(dǎo)電率和溫度。SNP分型采用實施例1所述的突變檢測技術(shù)進行。檢測結(jié) 果采用SAS統(tǒng)計軟件(SAS Institute Inc, Version 9· 0) GLM程序進行單標(biāo)記方差分析,所 采用的模型為Yijklmn = μ +Fi+Dj+S.+Mn+M^+Mn^+ β *XiJklmn+eiJklnm其中,Yijklnm為性狀觀測值,μ為平均值,F(xiàn)i父本效應(yīng),Dj為母本效應(yīng),Sk為性別效 應(yīng),M11為多態(tài)座位T442-C442基因型效應(yīng),M2m為多態(tài)座位G626-T626基因型效應(yīng),M11^M2m 為兩座位交互作用,P*Xijklmn表示以宰前活重為協(xié)變量,eijkl 為殘差效應(yīng)?;蛐蜋z測結(jié)果表明在所檢測的354頭金華豬X皮特蘭豬F2代個體中,多態(tài)座 位T442-C442的TT基因型占53. 14%, CC基因型占8%,TC基因型占38. 86% ;多態(tài)座位 G626-T626的GG基因型占51. 76%,TT基因型占27. 06%,TG基因型占21.18%。關(guān)聯(lián)分析 結(jié)果顯示,多態(tài)座位T442-C442與后腿脂肪重、板油重、肩部背膘厚、蹄重和肌內(nèi)水分含量 顯著關(guān)聯(lián)(P < 0. 05);而多態(tài)座位G626-T626與日增重、后腿肌肉重、后腿脂肪重、后腿肌 肉溫度、蹄重、所有4點背膘厚以及平均背膘厚均有顯著關(guān)聯(lián)(P < 0. 05)。兩座位的互作效 應(yīng)與后腿脂肪重、后腿肌肉PH值、眼肌pH值和胴體重有顯著關(guān)聯(lián)(P<0. 05)。結(jié)果說明本 發(fā)明中的豬TRHR基因多態(tài)突變可作為以上生產(chǎn)性狀的分子輔助選擇標(biāo)記。
權(quán)利要求
一種豬促甲狀腺激素釋放激素受體基因TRHR,其特征在于,它的cDNA序列為SEQ ID NO1所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cDNA序列,其特征在于,該cDNA序列長度為1469bp,序列中 包含1198bp的開放閱讀框,233bp的5,非翻譯區(qū)和38bp的3,非翻譯區(qū)。
3.一種豬促甲狀腺激素釋放激素受體基因TRHR,其特征在于,它具有SEQ IDNO :2和 SEQ ID NO 3所示的基因序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA序列,其特征在于序列表SEQID NO 2的第442bp處 有一個T442-C442堿基突變,以及第626bp處有一個G626-T626堿基突變。
5.一種權(quán)利要求1-6所述的基因TRHR在豬分子標(biāo)記輔助選擇和動物基因工程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬促甲狀腺激素釋放激素受體基因TRHR的克隆及其應(yīng)用,克隆得到如序列表SEQ ID NO1所示的豬TRHR基因cDNA全長和如序列表SEQ ID NO2與SEQ ID NO3所示的DNA序列,經(jīng)過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)序列表SEQ ID NO2中一個T442-C442堿基突變和一個G626-T626突變與豬多個生產(chǎn)性狀存在顯著關(guān)聯(lián),本發(fā)明為豬的標(biāo)記輔助育種提供了新的分子標(biāo)記。
文檔編號C12N15/12GK101914544SQ20101022040
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月6日
發(fā)明者張立凡, 徐寧迎, 蔣曉玲, 蔡兆偉, 陳哲 申請人:浙江大學(xué)
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