專利名稱：一種培養(yǎng)小球藻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微藻生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說涉及一種利用廉價碳源進行混養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)微藻的方法。
背景技術(shù)：
微藻富含蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分(如螺旋藻)，可用于食品、醫(yī)藥和能源方面；可以大量積累脂肪酸，有些微藻脂肪酸含量可占干重的30% 60%。利用培養(yǎng)微藻來積累油脂資源，已經(jīng)成為目前利用太陽能開發(fā)可再生資源最熱門的研究領(lǐng)域。不僅具有強大的市場潛力，而且具有非凡的社會價值。但大部分野生微藻生長速度不快，固定二氧化碳能力也有限，要實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)， 就消耗大量的人力物力，而收獲甚微。當前，微藻研究正值熱門時期，微藻的生長速度和油脂積累量成為研究的重點。微藻根據(jù)其營養(yǎng)方式分為自養(yǎng)與異養(yǎng)兩種。第一種自養(yǎng)過程就是微藻利用(X)2氣體進行光合作用來固定碳源的同時獲得能源，進行生長，并積累油脂。由于CO2在培養(yǎng)液中溶解度有限，吸收利用效率低下，CO2的有效利用吸收，是實現(xiàn)理想培養(yǎng)效果的關(guān)鍵。目前開放的光生物培養(yǎng)微藻技術(shù)中，有不少CO2補給方式和裝置。CN 200610018771. 9采用一種與養(yǎng)殖池相連的CO2補給裝置，可以有效提高(X)2利用率，但工藝繁瑣，增加了設(shè)備投資。CN 200410020978. 0和CN 03U8138. 9中均采用在光生物反應(yīng)器系統(tǒng)中加入一種裝置方法，來實現(xiàn)(X)2的補給，同時也能實現(xiàn)一定的氧解析效果。這些都難免增加設(shè)備投資， 工藝過程繁瑣。目前文獻報道中還有另外的一種(X)2補給方式，CN200410009360. 4和CN 200510126465. 2中使用煙道氣補碳。第二種是異養(yǎng)培養(yǎng)方式，就是在培養(yǎng)過程人為提供碳源，比如葡萄糖等，顯而易見，葡萄糖作為異養(yǎng)碳源，屬于速效碳源，可以提高微藻生長的速度，但其油脂積累效率并沒有得到相應(yīng)的提高，同時該類碳源必然增加培養(yǎng)成本，將會受到原料的極大限制。CN03109312. 4公開了一種用淀粉酶解培養(yǎng)異養(yǎng)藻快速熱解制備生物柴油的方法。 該專利以低質(zhì)糧食淀粉為原料，利用酶解淀粉制葡萄糖水溶液配制培養(yǎng)液，再通過異養(yǎng)轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得異養(yǎng)小球藻；然后用高脂肪含量的異養(yǎng)藻細胞快速熱解，獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的生物柴油。該方法選擇低質(zhì)糧食淀粉水解后提供葡糖糖用作有機碳源，成本仍較高了。在微藻培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式的基礎(chǔ)上，人們的目光轉(zhuǎn)向利用微藻生產(chǎn)生物柴油的培養(yǎng)策略。單步培養(yǎng)策略完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，雖然油脂的含量會比較低(加大提取成本)， 但生長速率快，能快速地增加生物量；不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，雖然生產(chǎn)速率比較慢，但高的油脂含量能抵消生物量的不足。兩步培養(yǎng)策略先利用完全培養(yǎng)基異養(yǎng)培養(yǎng)，使其生物量快速增加，再利用不完全培養(yǎng)基自養(yǎng)培養(yǎng)如氮限制或改變培養(yǎng)條件如光強、溫度，使藻類大量積累油脂。CN 2008101U998.9公開了一種從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的方法。該方法包括小球藻的自養(yǎng)培養(yǎng)、細胞濃縮、異養(yǎng)發(fā)酵、藻類細胞收集和干燥、從干燥的細胞中提取油脂和酯化反應(yīng)制備生物柴油等步驟。該方法在異養(yǎng)階段加入的有機碳源選自葡萄糖、果糖、玉米淀粉水解液、木薯淀粉水解液等，成本較高。由于在異養(yǎng)培養(yǎng)過程均加入了價格較高的葡萄糖作為有機碳源，因而現(xiàn)有兩步培養(yǎng)方法存在異養(yǎng)碳源的經(jīng)濟性較差與培養(yǎng)效率不理想等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種適用于小球藻高密度高品質(zhì)培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法可利用廉價碳源為異養(yǎng)碳源，對小球藻實現(xiàn)異養(yǎng)與光自養(yǎng)耦合培養(yǎng)，可使小球藻達到高密度培養(yǎng)的效果，同時藻體含油量與單一培養(yǎng)相比有較大幅度提高，藻體品質(zhì)與異養(yǎng)培養(yǎng)相比有較大幅度提高，藻體含油量在培養(yǎng)結(jié)束時達到光自養(yǎng)培養(yǎng)時的水平。本發(fā)明培養(yǎng)小球藻的方法包括如下內(nèi)容往生物反應(yīng)器中加入PH值為6. 0 7. 0 的培養(yǎng)基，按工作體積的5% 15%接入小球藻藻種進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為攪拌速度為 80 lOOrpm，通入空氣和二氧化碳的混和氣(其中CO2含量為5v% 15v% )，通氣量為 0. 1 1. Ovvm，光照強度為1000 60001x，培養(yǎng)溫度為25°C 32°C，培養(yǎng)過程中控制pH值小于10。本發(fā)明方法中，所用的小球藻包括市場上普通小球藻，也可包括經(jīng)過馴化后可以進行異養(yǎng)快速生長的異養(yǎng)小球藻。本發(fā)明方法中所用小球藻培養(yǎng)基，是在常規(guī)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上主要加入廉價碳源作為異養(yǎng)培養(yǎng)過程的生長碳源得到的。該廉價碳源是一種經(jīng)過預(yù)處理之后的菌渣(包括細菌菌渣或酵母菌菌渣)或藻渣(微藻細胞破碎除油后得到藻渣)，優(yōu)選為克雷伯氏肺炎桿菌菌渣或酵母菌菌渣。通常需要往培養(yǎng)基中加入3v% 15v%的菌渣或藻渣預(yù)處理液作為有機碳源。本發(fā)明方法中，由于菌渣或藻渣基本上為固體物質(zhì)，為了能更好的被小球藻吸收利用。優(yōu)選在加入培養(yǎng)基前對菌渣或藻渣進行預(yù)處理，以獲得菌渣或藻渣處理液用作營養(yǎng)液。所述菌渣的預(yù)處理方法為微生物發(fā)酵結(jié)束后，在60°C 80°C蒸煮30min 60min，在常溫下過濾獲得菌渣濾餅，然后加入0. 01 0. lmol/L的稀堿進行水解，所用的稀堿選自 NaOH和/或NaHCO3,水解過程的固液比為1 10 1 20，處理溫度為15°C 30°C，處理時間為5d 10d。所述藻渣的預(yù)處理方法為藻細胞破碎除油后得到藻餅，對藻餅以上述稀堿水解條件進行水解處理，獲得預(yù)處理液。本發(fā)明方法中，菌渣或藻渣預(yù)處理液在用于小球藻培養(yǎng)時是一種固液混合物，對培養(yǎng)體系具有一定的遮光性，遮光區(qū)對光自養(yǎng)的暗反應(yīng)及異養(yǎng)生長均有利。本發(fā)明方法中，使用的異養(yǎng)營養(yǎng)源為上述菌渣或藻渣預(yù)處理液。其在作為小球藻異養(yǎng)營養(yǎng)源的同時，還可以在小球藻培養(yǎng)基中加入0. 01 0. 05mmol/L濃度的Na2SO3 和0. 5 1. 0mL/L的微量元素混合液。上述每升微量元素混合液成份如下=H3BO3 5. 5 6. 5g、ZnSO4 · 7Η20 4· 0 5. 0g、MnCl2 · H2O 0· 5 1. 0g、(NH4)6Mo7O24 · 4Η20 0. 20 0· 40g、 CuSO4 · 5H20 0. 50 1. 00g、Co (NO3) 2 · 6H200. 10 0. 20g。本發(fā)明方法中，提供了小球藻生長的自養(yǎng)與異養(yǎng)兩種生長過程條件，根據(jù)廉價異養(yǎng)碳源的加入方式可以將此培養(yǎng)過程分為批式培養(yǎng)、批式流加培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)三種方式， 三種培養(yǎng)方式均可實現(xiàn)光自養(yǎng)與異養(yǎng)兩個過程的耦合培養(yǎng)。
本發(fā)明方法中，三種培養(yǎng)方式均是本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的發(fā)酵培養(yǎng)方式。批式培養(yǎng)方式就是一次投料一次收獲，將所需培養(yǎng)基與小球藻種子在無菌條件下一次性轉(zhuǎn)入反應(yīng)器中， 設(shè)定基本的培養(yǎng)條件，實施溫度轉(zhuǎn)速光照以及通氣和PH控制等條件，在小球藻細胞濃度不再增加或者增加變化很小的情況下即可收獲。當采用批式流加發(fā)酵方式時，在培養(yǎng)過程中，可以對異養(yǎng)碳源(菌渣或藻渣預(yù)處理液)進行流加補充，初始培養(yǎng)條件同批式培養(yǎng)條件。流加起始時間根據(jù)取樣分析藻細胞濃度數(shù)值而定，當分析得藻細胞濃度達到1. 0 2. OX IO6時，開始流加異養(yǎng)碳源，此流加的異養(yǎng)碳源濃度配制在10 30% (初始菌渣或藻渣預(yù)處理液體積與稀釋用蒸餾水體積比)，配制好后消毒滅菌處理，流加速度控制在0. 1 l.OmL/min水平，當細胞濃度達到 1. OX 101° 2. OX 101°時，停止流加，直至培養(yǎng)結(jié)束。若采用連續(xù)發(fā)酵進行培養(yǎng)初始培養(yǎng)條件與操作同批式培養(yǎng)，連續(xù)過程控制參數(shù)為反應(yīng)器中藻細胞濃度，當藻細胞濃度為1. OX IOltl 2. OX 101°時，向反應(yīng)器中流加新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成份同培養(yǎng)初始條件，采用上加下出方式，流加進去新鮮培養(yǎng)基混合均勻后， 反應(yīng)器下端放出相應(yīng)培養(yǎng)液，流加和放出量一致，維持反應(yīng)器中總的培養(yǎng)液體積不變，放出的培養(yǎng)液進行藻細胞的收集處理過程，以獲得藻細胞。根據(jù)培養(yǎng)過程藻細胞增殖情況，保證反應(yīng)器藻細胞濃度處于1.0X 101° 2. O X 101°水平，根據(jù)此參數(shù)來設(shè)定流加與放料速度，連續(xù)操作的流加與放料速度應(yīng)在0. 5 1. OmL/min。此連續(xù)培養(yǎng)方式下，可以實現(xiàn)長期運轉(zhuǎn)， 無需更換種子，連續(xù)加料連續(xù)收獲藻細胞產(chǎn)品。直到設(shè)備需要維修或者種子性能下降為止， 終止培養(yǎng)過程。本發(fā)明方法中，所述的小球藻可以為普通自養(yǎng)小球藻，也可以通過對普通自養(yǎng)小球藻進行異養(yǎng)條件馴化獲得可以同時進行異養(yǎng)生長的小球藻。例如，可以以自養(yǎng)小球藻出發(fā)，經(jīng)多批次誘導，獲取一種可以在自養(yǎng)與異養(yǎng)條件下均可生長的小球藻藻種。該藻種生長過程可以利用菌渣或藻渣預(yù)處理液作為生長的部分碳源，實現(xiàn)較高的藻細胞收獲和油脂積累效率，為大規(guī)模高效培養(yǎng)微藻提供基礎(chǔ)。通過對自養(yǎng)小球藻進行異養(yǎng)條件馴化以獲得異養(yǎng)小球藻的方法為本領(lǐng)域的普通常識。例如，所述通過馴化獲得混養(yǎng)小球藻的方法包括出發(fā)藻種為一種自養(yǎng)小球藻，對自養(yǎng)藻種進行異養(yǎng)條件馴化培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為添加葡萄糖與菌渣或藻渣預(yù)處理液的基本培養(yǎng)基，異養(yǎng)馴化培養(yǎng)條件為，避光情況下 25°C 30°C、100 150rpm、空氣浴搖床培養(yǎng)7 IOd ；經(jīng)過多批次異養(yǎng)馴化之后，對異養(yǎng)馴化藻種進行分離純化，將培養(yǎng)在異養(yǎng)條件下的指數(shù)期藻液稀釋涂布于基本培養(yǎng)基所做的固體平板上，弱光條件培養(yǎng)IOd 20d，得到若干單藻落，將此單藻落挑取后，劃到固體斜面基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待生長后，即可獲得純種藻種，該藻種既可用于異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)微藻，也可用于混合發(fā)酵培養(yǎng)微藻過程中。根據(jù)本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法，所述的常規(guī)培養(yǎng)基為本領(lǐng)域中異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)普通小球藻通常采用的培養(yǎng)基，所述常規(guī)培養(yǎng)基的基本組成一般為
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)小球藻的方法，所述方法包括往生物反應(yīng)器中加入PH值為6. 0 7. 0的培養(yǎng)基，按工作體積的5% 15%接入小球藻藻種進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為攪拌速度為80 IOOrpm (轉(zhuǎn)/分鐘)，通入空氣和二氧化碳的混和氣，通氣量為0. 1 1. Ovvm，光照強度為 1000 60001x，培養(yǎng)溫度為25°C 32°C，培養(yǎng)過程中控制pH值小于10。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，往所述的培養(yǎng)基中加入3v% 15v%的菌渣或藻渣預(yù)處理液作為有機碳源。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的菌渣選自克雷伯氏肺炎桿菌菌渣或酵母菌菌渣。
4.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的菌渣選自克雷伯氏肺炎桿菌菌渣。
5.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的菌渣處理液通過如下方法處理制得微生物發(fā)酵結(jié)束后，在60°C 80°C蒸煮30min 60min，在常溫下過濾獲得菌渣濾餅， 然后加入0. 01 0. lmol/L的堿液進行水解，水解過程的固液比為1 10 1 20，處理溫度為15°C 30°C，處理時間為5d 10d。
6.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的藻渣處理液通過如下方法制得藻細胞破碎除油后得到藻餅，然后加入0. 01 0. lmol/L的堿液進行水解，水解過程的固液比為1 10 1 20，處理溫度為15°C 30°C，處理時間為5d 10d。
7.按照權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的堿選自NaOH和/或NaHC03。
8.按照權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基中還含有0.01 0. 05mmol/L 的 Na2S03。
9.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基里面還含有0.5 1. 0mL/L 的微量元素溶液。
10.按照權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的微量元素溶液組成為=H3BO3 5. 5 6. 5g、ZnSO4 · 7Η20 4· 0 5. 0g、MnCl2 · H2O 0· 5 1. 0g、(NH4)6Mo7Om · 4Η20 0. 20 0. 40g、CuSO4 · SH2O 0. 50 1. OOg, Co (NO3)2 · 6Η200· 10 0. 20g、去離子水 1L。
11.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)方式為批式發(fā)酵、批式流加發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)小球藻的方法。本發(fā)明提出了一種以微生物菌渣處理液為主要異養(yǎng)碳源來實現(xiàn)混合培養(yǎng)的方法，利用自養(yǎng)出發(fā)藻種，經(jīng)過異養(yǎng)條件馴化培養(yǎng)，自養(yǎng)與異養(yǎng)兩個過程耦合，進行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)后藻液經(jīng)絮凝分離后，萃取獲得油脂，剩余的藻細胞與未利用的細菌菌渣再經(jīng)過本發(fā)明所提供的預(yù)處理過程，可以繼續(xù)用于微藻培養(yǎng)。本發(fā)明方法利用廉價碳源作為有機碳源，實現(xiàn)了自養(yǎng)與異養(yǎng)過程的耦合，本發(fā)明技術(shù)路線為大規(guī)模培養(yǎng)微藻生長油脂技術(shù)提供了新思路。
文檔編號C12N1/12GK102311921SQ20101022094
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者佟明友, 師文靜, 李曉姝, 王崇輝, 王領(lǐng)民, 金平, 黎元生 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院