專利名稱：應(yīng)答H₂O₂的miRNA-528及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)答H2O2的miRNA-528及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
過氧化氫(H2O2)是一種雙功能分子，在植物體內(nèi)起雙重作用，既是一種毒性分子 能導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，又是一種信號(hào)分子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用(Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci. ,2002,7 405-410.； Mittler R, Vanderauwera S, Gollery Μ, Breusegem F V. Reactiveoxygen gene network of plants. Trends Plant Sci. ,2004,9 =490-498.) H2O2 的雙功能性決定了植物體內(nèi)必 然存在著H2O2相關(guān)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，使它的濃度處于相對(duì)穩(wěn)態(tài)。在H2O2引起氧化脅迫的條件 下，網(wǎng)絡(luò)中許多基因或蛋白都會(huì)對(duì)H2O2產(chǎn)生應(yīng)答，自身的表達(dá)發(fā)生變化從而影響植物多種 生理活動(dòng)，最終使植物對(duì)H2O2脅迫產(chǎn)生適應(yīng)。目前，轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)已經(jīng)揭示 出植物中相當(dāng)多的應(yīng)答H2O2的基因和蛋白，主要集中在細(xì)胞防御、氧化還原平衡等功能 (Vanderauwera S，Van Der Kelen K，Dat J，Gadjev I，Boonefaes T，Morsa S，Rottiers P，Slooten L，Van Montagu M，ZabeauM. et al. A comprehensive analysis of hydrogen peroxide-regulated geneexpression in tobacco.Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2003，100 16113-16118. ；Wan X Y,Liu J Y. Comparative proteome analysis reveals an intimate proteinnetwork provoked by hydrogen peroxide stress in rice seedling leaves. Mol. CellProteomics，2008，7 1469-1488. )。Wan等通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定出144個(gè) 在H2O2處理的水稻幼苗葉片中差異表達(dá)的蛋白，這些蛋白大多與細(xì)胞防御、氧化還原平衡、 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白合成和降解、光合成和光呼吸以及能量代謝相關(guān)，通過這些差異表達(dá)的蛋白 以及它們的功能和參與的生理過程，構(gòu)建了水稻幼苗應(yīng)答H2O2的蛋白網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)闡明了 水稻幼苗葉片通過提高抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)和抑制代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)來適應(yīng)氧化脅 迫(Wan X Y, Liu J Y. Comparative proteome analysis revealsan intimate protein network provoked by hydrogen peroxide stress in riceseedling leaves. Mol. Cell Proteomics,2008,7 :1469_1488.)。miRNA(microRNA,微小RNA)是一類長度約為20_24nt的內(nèi)源單鏈非編碼小分子 RNA，在生物體中廣泛存在(Bartel D P. MicroRNAs genomics, biogenesis, mechanisms, and function. Cell, 2004,116 :281_297.)。近年來大量研究表明，miRNA參與調(diào)控植物生長 發(fā)育以及應(yīng)答生物和非生物脅迫等許多重要生物學(xué)過程(Bushati N,Cohen S M. MicroRNA functions. Annu. Rev. Cell Dev. Biol.，2007，23 175-205.；金龍國，王川，劉進(jìn)元.植物 MicroRNA.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2006，22 =609-614.)。因此，有理由相信miRNA — 定在植物應(yīng)答H2O2的過程中起著關(guān)鍵作用。但是，目前的植物應(yīng)答H2O2的相關(guān)研究主要集 中在基因和蛋白，還很少涉及到植物小分子RNA、特別是miRNA領(lǐng)域。植物中是否存在著應(yīng) 答H2O2的miRNA，這些miRNA的作用是什么，目前還沒有明確的答案。尋找和鑒定植物體內(nèi) 應(yīng)答H2O2的miRNA，對(duì)于完善植物H2O2相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，全面解析植物應(yīng)答H2O2的分子機(jī)制具有重要意義。水稻不僅是世界最重要的糧食作物之一，同時(shí)也是一種重要的模式生物，在植物 研究特別是單子葉植物研究中占有重要地位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)答H2O2的miRNA-528及其應(yīng)用。本發(fā)明保護(hù)的miRNA-528的序列如下(5，一 3，)UGGAAGGGGCAUGCAGAGGAG (序列表的序列 1)。本發(fā)明還保護(hù)miRNA-528在抑制IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因(0s08g0467400)表 達(dá)中的應(yīng)用；所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1如序列表的序列2所示。所述IAA-丙氨酸抗性 蛋白1基因可如序列表的序列3自5’末端第126至1622位核苷酸所示。所述IAA-丙氨 酸抗性蛋白1基因也可如序列表的序列3所示。本發(fā)明還保護(hù)miRNA-528在促進(jìn)IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因(0s08g0467400)的 mRNA降解中的應(yīng)用；所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1如序列表的序列2所示。所述IAA-丙氨酸 抗性蛋白1基因可如序列表的序列3自5’末端第126至1622位核苷酸所示。所述IAA-丙 氨酸抗性蛋白1基因也可如序列表的序列3所示。序列1所示miRNA-528可用于水稻種質(zhì)改良。本發(fā)明采用國際上先進(jìn)的Solexa高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析、 Northern雜交、實(shí)時(shí)定量PCR等多種生物學(xué)手段，首次從基因組水平鑒定到應(yīng)答H2O2的 miRNA-528,并且證實(shí)該miRNA在植物體內(nèi)調(diào)控的靶基因。miRNA-528可以通過改變IAA-丙 氨酸抗性蛋白I(IARl)基因表達(dá)量調(diào)節(jié)IAA平衡。植物細(xì)胞內(nèi)游離的IAA極易受到H2O2氧 化而降解，而IAA對(duì)于植物維持生理活動(dòng)是必需的，在這種情況下，植物體內(nèi)的miR528表達(dá) 受到抑制，從而增加了其靶基因IARl的表達(dá)，IARl的表達(dá)升高能促進(jìn)更多的結(jié)合態(tài)IAA水 解成游離態(tài)IAA，釋放出更多的游離態(tài)IAA來補(bǔ)充體內(nèi)被破壞的IAA，維持植物必需的生理 活動(dòng)。本發(fā)明揭示了應(yīng)答H2O2的miRNA-528在植物應(yīng)對(duì)氧化脅迫所起的重要作用。將 miRNA-528基因轉(zhuǎn)入水稻中過量表達(dá)或?qū)iRNA-528基因缺失，就可能獲得在耐受氧化脅 迫能力方面有明顯變化的轉(zhuǎn)基因植株，并有望通過改造獲得對(duì)氧化脅迫、干旱、高鹽等有較 強(qiáng)耐受性的植株，造福于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。


圖1為Northern雜交檢測(cè)不同濃度H2O2處理的水稻幼苗中miRNA-528的表達(dá)。圖2為miRNA-528的的靶基因5’ RACE驗(yàn)證；序列上方的箭頭表示發(fā)生切割的位 點(diǎn)，數(shù)值表示該切點(diǎn)處發(fā)生切割的克隆數(shù)與克隆總數(shù)比值。圖3為實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)靶基因的表達(dá)；誤差桿表示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中所用水稻品種均為秈稻品種93-11 (Oryza sativa L. ssp indica cv. 93-11)，水稻種子購自國家農(nóng)作物種質(zhì)保存中心(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，郵 編100081聯(lián)系電話010-68919715)。該水稻品種已經(jīng)由中國北京基因組研究所完成基因
組測(cè)序工作。實(shí)施例1、miRNA-528的發(fā)現(xiàn)一、H2O2 處理水稻種子經(jīng)表面消毒后，37°C浸泡24h，然后催芽萌發(fā)45h。萌發(fā)后將水稻轉(zhuǎn)移 到光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱條件設(shè)定為溫度28°C /21 V (白天16h/夜晚8h)，光照強(qiáng)度 400μ mol/m2 · s，相對(duì)濕度70%，由Hogland營養(yǎng)液提供水稻生長所需的全部營養(yǎng)，營養(yǎng)液 每2天更換一次。12天齡的水稻幼苗采用H2O2處理分別浸泡在0. 6mM、3. OmM和15. OmM H2O2水溶 液中，將浸泡在蒸餾水中的水稻幼苗作為對(duì)照；各種處理的幼苗同時(shí)置于25°C搖床中處理 6h。處理完畢后，將各個(gè)處理的水稻樣品按0. 5g分裝，液氮速凍后保存于-80°C備用。二、miRNA-528 的發(fā)現(xiàn)1、RNA 提取將水稻樣品在液氮中研磨，用TRIZOL試劑盒(Invitrogen)提取總RNA，操作步驟 按TRIZOL試劑盒自帶的說明書進(jìn)行。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度計(jì)(Amersham Biosciences)測(cè)定提取的RNA在260nm(OD26tl)和280nm(OD28tl)波長的吸光度值以確定RNA 的純度和濃度。質(zhì)量合格的RNA濃度應(yīng)在1 μ g/ μ 1以上，OD260/OD280的比值在1. 8-2. 0之 間，且經(jīng)電泳檢測(cè)條帶清晰，無明顯降解和DNA污染。2、小RNA文庫的構(gòu)建將質(zhì)量檢驗(yàn)合格的水稻幼苗總RNA用于構(gòu)建小RNA文庫。3種濃度(0. 6mM、3. OmM 和15. OmDH2O2處理的水稻樣品提取的RNA各取10 μ g等量混合，總共30 μ g用于構(gòu)建水 稻幼苗H2O2處理的小RNA文庫。對(duì)照樣品提取的RNA取30 μ g，用于構(gòu)建水稻幼苗對(duì)照小 RNA文庫。小RNA文庫的構(gòu)建按照Illumina Sample Preparation Protocol文庫構(gòu)建方 法進(jìn)行，構(gòu)建好的文庫采用Solexa高通量測(cè)序(北京華大基因研究中心)，獲得高質(zhì)量的 18-30nt的小RNA序列(兩個(gè)小RNA文庫均獲得了五百多萬條序列)。3、兩個(gè)小RNA文庫中應(yīng)答H2O2的miRNA的鑒定參考之前國外文獻(xiàn)對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析的成功方法(Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification of plant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell，2004，14 :787_799.)，建立一套計(jì)算機(jī) 分析方法用來發(fā)現(xiàn)和鑒定測(cè)序數(shù)據(jù)中的水稻miRNA。①將獲得的兩個(gè)小RNA文庫中的 原始序列通過計(jì)算機(jī)方法去掉3’接頭，并過濾掉序列長度在18nt以下的序列；②通過 SOAP 禾呈序(Li R, Li Y, Kristiansen K, Wang J. SOAP short oligonucleotidealignment program. Bioinformatics, 2008, 24 :713_714.)將序列與水稻 93-11 基因組(http //rice, genomics, org. cn/rice/)進(jìn)行匹配，保留能與基因組完全匹配的序列，進(jìn)行后續(xù)分析；③ 將與基因組匹配的序列與國際權(quán)威的miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase (http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/)中公布的水稻miRNA成熟序列及前體序列進(jìn)行BLAST，從而發(fā)現(xiàn)哪些序列來自于已知的水稻miRNA。鑒定出近300個(gè)水稻miRNA序列，分屬于100余個(gè)miRNA家族。由于高通量測(cè)序能給出每個(gè)miRNA的測(cè)序次數(shù)，通過比較水稻幼苗H2O2處理小RNA 文庫和對(duì)照小RNA文庫中miRNA的測(cè)序數(shù)(測(cè)序數(shù)已經(jīng)根據(jù)小RNA文庫測(cè)序總數(shù)進(jìn)行了標(biāo) 準(zhǔn)化)，可以從中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)庫中測(cè)序數(shù)相差較大的miRNA，這部分miRNA可能就是應(yīng)答H2O2 的miRNA?；诖朔椒?，比較了兩個(gè)小RNA文庫中miRNA的測(cè)序數(shù)，并采用以下兩個(gè)限制條 件來提高發(fā)現(xiàn)應(yīng)答H2O2的miRNA的成功率①miRNA在H2O2處理小RNA文庫或?qū)φ招NA 文庫中測(cè)序數(shù)要大于100，從而可以保證比較的可靠性；②miRNA在H2O2處理小RNA文庫和 對(duì)照小RNA文庫中測(cè)序數(shù)相對(duì)差異要大于30%。發(fā)現(xiàn)有7個(gè)miRNA家族的測(cè)序數(shù)存在顯著 差異，可能是應(yīng)答H2O2的miRNA家族,其中一個(gè)為osa_miR528 (miRNA_528 ；miR528)。osa-miR528 的序列如下(5，— 3，) :UGGAAGGGGCAUGCAGAGGAG (序列 1)。H2O2處理小RNA文庫的測(cè)序次數(shù)(Q11202)為1915，對(duì)照小RNA文庫的測(cè)序次數(shù)(Q5iffi) 為2953，相對(duì)差異(0腦2/0對(duì)照-1)\100%為-35· 2%0三、miRNA Northern 雜交為了進(jìn)一步驗(yàn)證osa_miR528具有應(yīng)答H2O2的表達(dá)模式，采用miRNA Northern雜 交檢測(cè)幾種H2O2處理濃度下(0、0. 6,3. 0,15. 0mM)miRNA的表達(dá)情況。1、制備探針檢測(cè)osa-miR528 的探針(5，一 3，)的序列CTCCTCTGCATGCCCCTTCCA。采用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)對(duì)上述序列末端磷酸基團(tuán)進(jìn)行 同位素(Y -32P ATP)標(biāo)記，得到探針，用Microspin G-25柱(GE Healthcare)純化探針，去 除未標(biāo)記的同位素，純化后的探針用于Northern雜交。2、miRNA Northern 雜交Northern雜交中，每個(gè)泳道上樣量為20 μ g低分子量RNA，TO基因作為內(nèi)參，與 miRNA在同一張膜上檢測(cè)。TO基因的探針序列為TATGCGTGTCATCCTTGCGCAG。(1)分別提取步驟一制備的各水稻樣品的總RNA。(2)采用 Park 等報(bào)道的 PEG8000/NaCl 沉淀法(Park W, Li J, Song R, MessingJ， Chen X. CARPEL FACTORY,a Dicer homolog, and HENl, a novel protein,act inmicroRNA metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol.，2002，12 :1484_1495.)從總 RNA 中富 集低分子量RNA (有利于提高miRNA的檢測(cè)能力)。(3) miRNA Northern 雜交①富集的低分子量RNA溶于DEPC水，再加入等體積的2 X RNA上樣緩沖液(95%甲 酰胺，18mM EDTA, 0. 1 %溴酚藍(lán)和0. 1 %二甲苯青)，混合后95°C變性5min，得到RNA樣品。②RNA樣品用15%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后用電轉(zhuǎn)移裝置 (BIO-RAD)轉(zhuǎn)移到 Hybond N+尼龍膜(Amersham Biosciences)上。③轉(zhuǎn)移有RNA樣品的尼龍膜經(jīng)6XSSC溶液短暫漂洗，紫外交聯(lián) (Stratagene) 5min,再80°C烘烤2h，使RNA完全固定在尼龍膜上。④將轉(zhuǎn)移了 RNA的尼龍膜放入雜交管中，加入5ml ULTRAhyb-Oligo雜交液 (Ambion)在雜交爐中42°C預(yù)雜交2h，然后加入探針，混勻，42°C雜交過夜。⑤雜交結(jié)束后，小心倒出雜交液，加入含0. 5% SDS的2XSSC溶液，42°C洗滌三次，每次IOmin。⑥洗膜結(jié)束后，將膜用保鮮膜包裹，平整壓于X光片下，附加增感屏，-70°C曝光1 周。⑦曝光結(jié)束后，沖洗X光片，進(jìn)行光密度掃描，以對(duì)照組的雜交信號(hào)為1，計(jì)算各個(gè) 處理組雜交信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度。結(jié)果見圖1。Northern雜交結(jié)果和測(cè)序數(shù)據(jù)很吻合，OSa-miR528受H2O2抑制表達(dá)。實(shí)施例2、應(yīng)答H2O2的miRNA的靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證由于植物miRNA與靶基因mRNA近乎完全互補(bǔ)，因此可以通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè) osa-miR528的靶基因。采用Schwab等描述的方法預(yù)測(cè)miRNA的靶基因(Schwab R，Palatnik J F, Riester Μ,Schommer C, Schmid Μ,Weigel D. Specific effects ofmicroRNAs on the plant transcriptome. Dev. Cell, 2005,8 :517_527.)。使用 Patscan程序在水稻 93-11 全長 cDNA和基因庫(http://rice. genomics, org. cn/rice/)中尋找能與miRNA序列近乎完全互 補(bǔ)的cDNA或基因，即為miRNA的靶標(biāo)；參數(shù)設(shè)置為=Patscan程序參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置，允許最 大錯(cuò)配數(shù)為3個(gè)，miRNA的第10和11位堿基不允許有錯(cuò)配，靶標(biāo)的功能通過NCBI (http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/)同源性檢索，以同源性最高的已知功能基因進(jìn)行注釋。預(yù)測(cè)結(jié)果見表1。表losa-miR528的靶基因及功能 注(丨)表示在H2O2處理下表達(dá)量下調(diào)；bNB，Northern雜交分析得出的結(jié)果。osa-miR528 的革巴標(biāo)是 IAA-丙氨酸抗性蛋白 1 (IAA—alanine resistance proteinl ；IAR1)基因 0s08g0467400 (GENBANK ACCESSION NO. 0s08g0467400 ；見序列表的 序列3;0s08g0467400編碼的蛋白質(zhì)如序列表的序列2所示)。IAA(吲哚乙酸)是植物 重要的生長激素，在植物體內(nèi)，大多數(shù)IAA是以結(jié)合態(tài)的形式存在，結(jié)合態(tài)的IAA比較有 利于儲(chǔ)存、運(yùn)輸以及避免受到氧化破壞(Bartel B. Auxin biosynthesis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.，1997,48 :51_66· )。IARl 則在調(diào)節(jié)游離態(tài)和結(jié)合態(tài) IAA 的平 衡中起重要作用，IARl能夠促進(jìn)結(jié)合態(tài)的IAA水解，釋放出游離態(tài)ΙΑΑ，從而調(diào)節(jié)植物的生 長以及維持植物重要的生理活動(dòng)(Lasswell J，Rogg L E，Nelson DC, Rongey C，Bartel B. Cloning and characterization of IARl, a gene requiredfor auxin conjugate sensitivity in Arabidopsis. Plant Cell, 2000，12 :2395_2408.)。實(shí)施例3、miRNA對(duì)靶基因mRNA的切割osa-miR528對(duì)靶基因0s08g0467400 (見序列表的序列3)mRNA的切割用5，RACE TjfeiHiT^ilH (Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification ofplant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell, 2004,14 787-799.)。靶基因mRNA被miRNA切割后，其較為穩(wěn)定的3’切割產(chǎn)物5’端核苷酸磷酸集團(tuán)暴露，用T4RNA連接酶在該切割產(chǎn)物5’端連接上5’ RACE專用接頭；通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合 成cDNA ；通過靶基因特異的巢式外引物和試劑盒所帶的巢式外引物進(jìn)行第一輪PCR，靶基 因特異的巢式內(nèi)引物和試劑盒所帶的巢式內(nèi)引物進(jìn)行第二輪PCR;將5’RACE獲得的PCR產(chǎn) 物連接到PMD 19-T載體后測(cè)序，就能知道精確的靶基因mRNA切割位點(diǎn)。1、分別提取實(shí)施例1的步驟一制備的各水稻樣品的總RNA。2、按 Firstchoice RLM-RACE 試劑盒(Ambion)操作說明進(jìn)行 5，RACE。靴基 因0s08g0467400特異的巢式外引物的序列為GCGTGATTCAACTTGGCCTTGTCG，靶基因 0s08g0467400 特異的巢式內(nèi)引物的序列為ATGATCATGTGTATGAGAATGCCCTCC。3、PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，回收540bp左右的特異條帶(圖2中泳道1所示)。4、將回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD 19-T載體(TaKaRa)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α (TaKaRa)。5、挑單克隆測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定靶基因mRNA的切割位點(diǎn)。測(cè)序結(jié)果顯示的切割位點(diǎn)見圖2。osa-miR528的靶基因在與其互補(bǔ)的區(qū)域發(fā)生了 切割，這個(gè)結(jié)果強(qiáng)有力的證明了 0s08g0467400確實(shí)是OSa-miR528體內(nèi)真正調(diào)控的靶基因。 (圖2中，有三個(gè)切割位點(diǎn)，切割概率比為1 1 8)。實(shí)施例4、靶基因的表達(dá)量分析為了進(jìn)一步考察OSa-miR528的功能，用實(shí)時(shí)定量RT-PCR分別檢測(cè)靶基因 0s08g0467400在幾種H2O2處理濃度下(0、0. 6,3. O、15. OmM)的水稻幼苗中的表達(dá)情況。1、分別提取實(shí)施例1的步驟一制備的各水稻樣品(2g)的總RNA。2、總RNA加入DNase I (TaKaRa)，室溫放置30min以除去基因組DNA的污染。3、加入終止緩沖液(50mM EDTA)后，70°C加熱IOmin以變性DNase I和RNA。4、采用TaKaRa RNA PCR Kit，用RNA合成cDNA模板，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。Power SYBR Green PCR Master Mix(Appl ied Biosystems) ^t iCycler iQ5Multicolor實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)儀(Bio-Rad)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過比較Ct值 法(Δ Δ Ct {t ^ )(Schmittgen T D. Real-Time Quantitative PCR. Methods,2001,25 383-385.)計(jì)算靶基因在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)量(對(duì)照組基因的表達(dá)量設(shè)定為1)。靶 基因的檢測(cè)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。以水稻β-tubulin基因作為內(nèi)參(Zhao B， Ge L, LiangR, Li W, Ruan K, Lin H, Jin Y. Members of miR-169 family are induced by highsalinity and transiently inhibit the NF-YA transcription factor. BMC Mol. Biol. ，2009，10 :29·)。擴(kuò)增靶基因0s08g0467400的引物如下(5，— 3，)上游引物GCGGTCGCTAGCCCTAATGCGC；下游引物CTCCGCGAGCTCCTCGGGGAGA。擴(kuò)增β -tubulin基因引物如下(5，— 3，)上游引物CCTCCAAGGATTTCAAGTCTGC；下游引物TTGTAAGGTTCCACCACGGTA。結(jié)果見圖3。靶基因0s08g0467400在H2O2處理下表達(dá)量發(fā)生了明顯的變化，通過 和osa-miR528的表達(dá)(圖1)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)0s08g0467400的表達(dá)和osa_miR528的表達(dá) 呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)性，即oSa-miR528表達(dá)上調(diào)的時(shí)候，0s08g0467400的表達(dá)就相應(yīng)下調(diào)，這與miRNA對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控作用是完全一致的。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果進(jìn)一步證明了 0s08g0467400 確實(shí)是 osa_miR528 的靴基因。
權(quán)利要求
序列表的序列1所示的RNA。
2.序列1所示RNA在抑制IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因表達(dá)中的應(yīng)用；所述IAA-丙氨 酸抗性蛋白1如序列表的序列2所示。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因如序列表 的序列3自5’末端第126至1622位核苷酸所示。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因如序列表 的序列3所示。
5.序列1所示RNA在促進(jìn)IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因的mRNA降解中的應(yīng)用；所述 IAA-丙氨酸抗性蛋白1如序列表的序列2所示。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因如序列表 的序列3自5’末端第126至1622位核苷酸所示。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因如序列表 的序列3所示。
8.序列表的序列1所示的RNA在水稻種質(zhì)改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)答H2O2的miRNA-528及其應(yīng)用。本發(fā)明保護(hù)的miRNA-528是序列表的序列1所示的RNA。本發(fā)明還保護(hù)序列1所示RNA在IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因表達(dá)和/或促進(jìn)IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因的mRNA降解中的應(yīng)用；所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1如序列表的序列2所示，所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因如序列表的序列3所示。應(yīng)用miRNA-528有望獲得對(duì)氧化脅迫、干旱、高鹽等有較強(qiáng)耐受性的植株，造福于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101892234SQ201010221440
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者劉進(jìn)元, 李甜 申請(qǐng)人:清華大學(xué)