專利名稱：一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種可溶性融合蛋白，尤其是人Notch配體Delta-likel(hDlll)的截 短體、血管內皮細胞靶向蛋白質基序R⑶和氨基末端融合的TrxHis表達標簽的一種血管靶 向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，屬于醫(yī)藥技術領域。
背景技術：
Notch信號途徑廣泛存在于多種生物體內，且進化上高度保守，在胚胎發(fā)育、血細 胞發(fā)育及腫瘤形成等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)已在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了四種Notch同源分子，即Notch 1-4，并發(fā)現(xiàn)了五種 Notch配體，分別是Jaggedl、2和Delta-likel、3、4。這些配體都是I型跨膜蛋白，N端有一 個結合Notch受體必需的DSL結構域，由含6個半胱氨酸、3個甘氨酸的45個氨基酸組成； 配體胞外區(qū)還含有數(shù)量不等的EGF樣重復區(qū)；胞漿區(qū)很短，只有70-215個氨基酸殘基，保守 性差。其中，hDlll屬于果蠅Delta配體在人的同源物，由723個氨基酸組成，其胞外段中 有 1 個 DSL 結構域和 8 個 EGF 樣重復區(qū)(Radtke F 等，EMB0 reports, 2005,6 1120-1125 ； PfisterS 等，J. Mol. Biol.，2003，333 :229_35 ；Ascano JM 等，J. Biol. Chem.，2003，278 8771-8779)。Notch受體和配體都屬于EGF樣超家族分子。其細胞外區(qū)包含的多個EGF樣重 復序列可以參與鄰近細胞表面的Notch配體和Notch受體之間相互作用。如Notchl的第 11-12個EGF樣重復序列可以與配體DSL結構域相互作用，從而激活Notch信號途徑(Rebay I等，Cell, 1991，67 :687_699)。Notch信號的激活對細胞具有廣泛而復雜的作用。在干細 胞系統(tǒng)，Notch信號激活的主要作用是通過促進干細胞的增殖和存活、抑制干細胞的分化促 使干細胞維持在低分化狀態(tài)；在細胞的分化過程中，Notch信號途徑的作用主要是輔助細 胞在雙向分化時選擇其中的一個分化方向而抑制向另一個方向的分化，或者在細胞成熟過 程中抑制細胞的成熟；在分化的細胞，Notch信號的激活可以影響細胞的功能狀態(tài)。此外， Notch信號還參與多種復雜的病理過程，如腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，隨著細胞所處狀態(tài)不一，Notch 信號激活可以抑制腫瘤或者促進腫瘤；Notch信號還是維持腫瘤干細胞的重要因素；此外， Notch信號途徑對腫瘤微環(huán)境的形成和維持具有關鍵作用Notch信號阻斷可以破壞腫瘤 新生血管的完整性，從而引起腫瘤組織缺氧而抑制腫瘤生長，Notch信號的激活還是巨噬細 胞和樹突狀細胞發(fā)揮其抗腫瘤活性的關鍵因素。綜上所述，建立激活或者阻斷Notch信號 途徑的人工手段，具有重要的應用價值。研究發(fā)現(xiàn)，Notch配體從N末端到DSL結構域的片段足以激活Notch信號途徑 (FitzgeraldK 等，Development，1995，121 4275 ；Henderson ST 等，Mol. Biol. Cell.，1997， 8 1751 ；ParksAL等，Genetics，2006，174 1947-1961)。這些結果提示，如果能夠在大腸桿 菌中表達生產(chǎn)Notch配體的DSL結構域片段，有可能提供一種人工的刺激Notch信號途徑 的手段，用于在體外和體內研究Notch信號對細胞增殖、分化和凋亡的影響，以及治療與血 管新生相關的某些疾病如惡性腫瘤和視網(wǎng)膜黃斑變性。因此，近年來有多個研究組先后利用真核表達系統(tǒng)和原核表達系統(tǒng)，表達了不同的Notch配體的DSL結構域片段。但是活性分 析的結果卻不一致有些表達產(chǎn)物可以激活Notch信號，有些則沒有激活活性，有些甚至有 抑制Notch信號激活的活性?？傮w來說，激活活性不佳，無法在實驗研究中獲得穩(wěn)定結果， 不能應用于體內。可溶性Notch配體對Notch信號的激活活性不佳的主要原因是在Notch受體的激 活過程中，在Notch受體的跨膜區(qū)附近要發(fā)生多個步驟的蛋白酶裂解反應。當Notch配體 和Notch受體結合后，Notch跨膜區(qū)的S2位點暴露，并收到ADAM金屬蛋白酶家族的TACE 或Kuz的酶切。這時，切割產(chǎn)生的游離的胞外區(qū)必需在錨定于細胞表面的Notch配體的作 用下，被表達Notch配體的細胞內吞(Endocytosis)。然后，在、分泌酶的作用下，殘存在 細胞膜上Notch受體片段在跨膜區(qū)內發(fā)生裂解，向細胞內釋放出Notch受體胞內段，引起 Notch信號途徑的激活。由這一過程可以看出，必需將Notch配體固定于固體(如細胞、塑 料培養(yǎng)皿等)表面，才能有效地激活Notch受體。血管內皮細胞靶向蛋白質基序RGD是以精氨酸(R)-甘氨酸(G)_門冬氨酸(D)為 核心的多肽，可以特異識別血管內皮細胞表面的整合素分子，從而將與之融合的其他蛋白 分子錨定于血管內皮細胞表面。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，該蛋白可 以結合于血管內皮細胞表面，有效地刺激細胞的Notch受體的激活。本發(fā)明的技術方案是一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是它是由人Delta-likel即hDlll蛋白截短體、血管內皮細胞靶向蛋白質基序R⑶和融合 的TrxHis表達標簽組成；其中hDlll蛋白截短體是hDlll第127-225位氨基酸。所述的hDlll第127-225位氨基酸包含負責與Notch受體結合的DSL結構域和部 分上游序列；所述的血管內皮細胞靶向蛋白質基序RGD是該可溶性融合蛋白的羧基末端； 所述的融合的TrxHis表達標簽是該可溶性融合蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是Nol， 并由No2的核酸序列編碼Nol :TrxHis-hDlll-RGD 的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap kygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferq hmdspdlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvc dehyygegcsvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry ；No2 :TrxHis-hDlll-RGD 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg atcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggc
aaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggt atcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaa gagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacgacaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccag aaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagc ggccgcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttt tctgccgtccccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaa agggccct&ctgc&c&g&gccg&tctgccg&gg&g&ttgcgg&gttcg&t&t0所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD具有No3的氨基酸序列，并由 No4的核酸序列編碼No3 :hDlll的DSL和上游片段的氨基酸序列l(wèi)htdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrpr ddafghftc
gergekvcnpgwkgpyctepi ；
No4 :hDlll的DSL和上游片段的核酸序列
ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacc acctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcct
cagaggc
accgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcg gccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatco所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD具有No5的氨基酸序列，并由 No6的核酸序列編碼No5 :RGD基序的氨基酸序列crgdcgvry ；No6 :RGD基序的核酸序列 tgccgaggagattgcggagttcgatat。 所述氨基末端融合的TrxHis表達標簽，包含No7的氨基酸序列，并由No8的核酸 序列編碼
7
N。7TrXHi S的氨基酸序列
msclkiihltddSfdtdVlkadgailVdfWaeWCgpCkmiapildeiadeyqgkltVaklnidqnpgtapkygirg
iptlllfkngeVaatkVgalSkgqlkefldanlagSgSghmhhhhhhSSglVprgSgmkctaaakferqhmdSp
dl gtddddkamadi gS；
N。8TrXHiS的核酸序列
atgagCgataaaattattCaCCtgaCtgaCgaCagttttgaCaCggatgtaCtCaaagCggaCgggg(gatCCtCgtC
gatttCtgggCagagtggtgCggtCCgtgCaaaatgatCgCCCCgattCtggatgaaatCgCtgaCgaatatCagggc
aaaCtgaCCgttgCaaaaCtgaaCatCgatCaaaaCCCtgg(aCtgCgCCgaaatatggcatCCgtggtatCCCgaCt
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aCaagg(Catgg(tgatatCggatCC。
所述血管靶向可溶性融合蛋白TrXHiS—hDll卜RGD是在大腸桿菌BL2l中用低溫誘導方法實現(xiàn)可溶性表達，并用針對HiS標簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的TrXHiS—hDlll—RGD蛋白。
本發(fā)明的特點是TrXHiS—hDll卜RGD在體外可以通過基因工程進行大量生產(chǎn)，應用于體內時可以結合于血管內皮細胞表面，從而向內皮細胞和其他細胞提供針對N。tCh受體的激活型刺激，可應用于在體外和體內研究N。tCh信號對細胞增殖、分化和凋亡的影響，以及治療與血管新生相關的某些疾病如惡性腫瘤和視網(wǎng)膜黃斑變性。


圖l、融合蛋白的結構、構建和作用模式 圖2、目的基因(hDll卜RGD)的PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；
圖3、表達載體pET32a—hDll卜RGD的結構示意 圖4、表達載體pET32a—hDll卜RGD的酶切鑒定 圖5、TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白表達的蛋白電泳 圖6、TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白的純化的電泳圖及免疫印跡檢測；
圖7、TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白與血管內皮細胞系的結合；
圖8、游離的TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白對Raji細胞N。tCh信號的激活作用；
圖9、游離的TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白對Raji細胞N。tCh信號的激活作用；
圖lo、與血管內皮細胞系結合的TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白對Raji細胞N。tCh信號的激活作用；圖11、與血管內皮細胞系結合的TrxHis-hDlll-RGD融合蛋白對Raji細胞Notch 信號的激活作用。
具體實施例方式以下通過附圖結合實施例對本發(fā)明做詳盡的說明。1、構建表達載體。圖1是融合蛋白的結構、構建和作用模式圖。根據(jù)hDlll的序 列、RGD九肽的序列(CRGDCGVRY)和其對照DGR九肽的序列(CDGRCGVRY)設計引物，P1 :5’ -CGGGATCCCTCCACACAGATTCTCCTG-3‘ ；P2 5-CGGAATTCATATCGAACTCCGCAATCTCCTCGGCAGATCG GCTCTGTGCAGTAG-3’ ；P3 :5’ -CGGAATTCATATCGAACTCCGCATCGTCCATCGCAGATCGGCTCTGTGCAGTA G-3，。以pET32a-hDlll(127-225)(Shi ZX等，Protein Expr Purif. ，2008，59 242~248)為 模板，聚合酶鏈反應擴增編碼hDlll-RGD和對照hDlll-DGR氨基酸的多核苷酸序列(其中 hDlll為其氨基酸的127-225位)(圖2)，瓊脂糖電泳回收后與pMD18_T載體16°C連接 2小時，熱休克轉化大腸桿菌XL10，擴增后將目的片段亞克隆至表達載體pET32a (+)，構建 pET32a-hDlll-RGD(圖 3)和 pET32a-hDlll_DGR，限制性酶切(圖 4)、測序鑒定。圖1、融合蛋白的結構、構建和作用模式圖。圖2為目的基因(hDlll-RGD)的PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，1道(M)是分子 量標志(DL2000)，2和3道(PCR)分別是擴增hDlll的127-225位氨基酸片段融合DGR基 序(hDlll-DGR)和hDlll的127-225位氨基酸片段融合R⑶基序(hDlll-RGD)，箭頭所指為 擴增片段。圖3、表達載體pET32a-hDlll_RGD的結構示意圖。圖4為表達載體pET32a-hDlll_RGD的酶切鑒定圖；(質粒分別用限制性內切酶 EcoRI+NotI和EcoRI+BamHI酶切，瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。M道是marker DL2000,1-5 道分別是不同克隆的酶切結果)2、誘導表達融合蛋白。將表達載體 pET32a(+)、pET32a_hDlll、pET32a-hDlll_DGR 和pET32a-hDlll-RGD分別以熱休克法轉化大腸桿菌BL21，涂布含100 y g/ml氨芐青霉素 LB平板，37°C培養(yǎng)12小時后挑取單克隆接種到含100 u g/ml氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基， 200rpm，37°C培養(yǎng)12h，以轉接到新鮮LB(+)培養(yǎng)基中，200rpm，37°C培養(yǎng)3h后，加入終 濃度 1. OmM 的 IPTG，200rpm, 28_30°C培養(yǎng) 24h。3、獲得TrxHis-hDlll-RGD和TrxHis_hDlll_DGR的包涵體蛋白。離心收集細菌， 200 u 1/ml培養(yǎng)基PBS重懸細菌，超聲裂菌，加入1 % Triton-X100,混勻，4°C靜置30分鐘， 4°C離心收集上清和沉淀，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，TrxHis-hDlll能以可溶形式存在于裂解上 清中，而TrxHis-hDlll-RGD和TrxHis-hDlll-DGR蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中 (圖 5)。圖5為TrxHis-hDlll-R⑶融合蛋白表達的蛋白電泳圖。將質粒pET32a(+)、 pET32a-hDl 11、pET32a_hDl 11-DGR 和 pET32a_hDl 11-RGD 分別轉化大腸桿菌 BL21，小體積培 養(yǎng)后IPTG誘導融合蛋白的表達，然后取全細菌裂解物、裂解上清(可溶性組分)和裂解沉 淀(即包涵體)分別進行SDS-PAGE分析。M是分子量標志(由上到下分別是250KD，150KD, 100KD,75KD,50KD,37KD,25KD,20KD)
4、純化包涵體蛋白。pET32a(+)空載體蛋白TrxHis從細菌裂解上清中純化， TrxHis-hDlll-DGR和 TrxHis-hDlll-RGD 以鎳離子螯合柱(Invitrogen ProBondTM)純化包 涵體蛋白，為了減小誤差，將TrxHis-hDlll也從包涵體中純化，所有純化步驟以ProBondTM 純化手冊操作。純化后的蛋白進行SDS-PAGE，然后用抗His標簽抗體進行免疫印跡實驗 (Immuno-blot)，見在 TrxHis-hDlll、TrxHis-hDlll-DGR、TrxHis-hDlll-RGD 都可檢測到大 小正確的蛋白條帶(圖6)。圖6為TrxHis-hDlll-RGD融合蛋白的純化及免疫印跡檢測。從轉化有質粒 pET32a-hDlll、pET32a-hDlll-DGR 和 pET32a_hDlll_RGD 的轉化大腸桿菌 BL21 的裂解上清 或過復性上清用鎳金屬螯合柱純化含有His標簽的蛋白，進行SDS-PAGE分析。M道是蛋白 分子量標志。下圖是融合蛋白免疫印跡檢測結果，一抗是抗His標簽抗體。5、蛋白活性測定。A.ECV304細胞爬片的免疫熒光染色。24孔板底部鋪一片圓形蓋玻片，然后 接種1 X 105ECV304,分別在各孔加入5 ii g/ml表達的蛋白TrxHis、TrxHis-hDlll、 TrxHis-hDlll-DGR 和 TrxHis-hDlll-RGD, 48h 后棄去培養(yǎng)基，4% 多聚甲醛固定，抗 His 的單抗染色過夜，第二天用PBS洗滌后，抗小鼠IgG-FITC染色兩小時，之后PBS洗滌， Hoechst染色10min，PBS洗滌，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。見只有加入 TrxHis-hDlll-RGD的細胞呈現(xiàn)綠色熒光信號，且定位于細胞表面(圖7)。圖7為TrxHis-hDlll-R⑶融合蛋白與血管內皮細胞系的結合。體外培養(yǎng) 內皮細胞系 ECV304，加入純化的蛋白 TrxHis、TrxHis-hDlll、TrxHis-hDlll-DGR 和 TrxHis-hDlll-RGD，48h后用抗His抗體進行免疫熒光染色，Hoechst染色細胞核，熒光 顯微鏡觀察。B.實時定量檢測重組蛋白TrxHis-hDll 1-RGD激活Notch下游基因Hes 的表達。六孔板接種lX106Raji細胞，分別在各孔加入5iig表達的蛋白TrxHis和 TrxHis-hDlll-RGD, 12h后TRzol法提取RNA，反轉錄成cDNA后，實時定量PCR檢測Notch下 游基因Hesl和Hes5的表達變化。結果顯示TrxHis-hDlll-RGD可以有效地刺激Hotch信 號下游基因Hesl和Hes5的表達(圖8，圖9)，提示具有激活Notch信號的活性。圖8為游離的TrxHis-hDlll-RGD融合蛋白對Raji細胞Notch信號的激活作用。 培養(yǎng)Raji細胞，向培養(yǎng)基中加入純化的蛋白TrxHis和TrxHis-hDlll-RGD，12h后收獲細 胞，提取總RNA，用實時定量RT-PCR檢測Notch下游基因Hesl的表達水平P < 0. 05)。圖9為游離的TrxHis-hDlll-RGD融合蛋白對Raji細胞Notch信號的激活作用。 培養(yǎng)Raji細胞，向培養(yǎng)基中加入純化的蛋白TrxHis和TrxHis-hDlll-RGD，12h后收獲細 胞，提取總RNA，用實時定量RT-PCR檢測Notch下游基因Hes5的表達水平P < 0. 05)。為了更進一步確定表達的TrxHis-hDlll-R⑶事結合于整合素分子，并且能更 好的激活Notch信號，將培養(yǎng)皿接2X105ECV304細胞，48h后加入終濃度為10 y g/ml的 絲裂霉素作用2. 5h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗一遍后，換新的培養(yǎng)液，接種1X106ECV304細 胞，分別在各孔加入 5 ii g/ml 表達的蛋白TrxHis、TrxHis-hDlll, TrxHis-hDlll-DGR ^P TrxHis-hDlll-RGD, 12h后TRzol法提取RNA，反轉錄成cDNA后，實時定量PCR檢測Notch 下游基因Hesl和Hes5的表達變化。結果顯示與非細胞表面錨定的TrxHis-hDlll相比， TrxHis-hDlll-RGD可以更有效地有效地刺激Notch信號下游基因Hesl和Hes5的表達(圖 10，圖11)，提示具有激活Notch信號的活性。
圖10為與血管內皮細胞系結合的TrxHis-hDlll-R⑶融合蛋白對Raji細胞Notch 信號的激活作用。培養(yǎng)ECV304細胞，用絲裂霉素C抑制細胞增殖，向培養(yǎng)液加入純化的蛋 白 TrxHis、TrxHis-hDlll、TrxHis-hDlll-DGR 和 TrxHis_hDlll_RGD，2. 5h 后換液，在加入 Raji細胞，培養(yǎng)12h后收獲Raji細胞，提取總RNA，用實時定量RT-PCR檢測Notch下游基 因Hesl的表達水平(* P < 0. 05)。圖11為與血管內皮細胞系結合的TrxHis-hDlll-R⑶融合蛋白對Raji細胞Notch 信號的激活作用。培養(yǎng)ECV304細胞，用絲裂霉素C抑制細胞增殖，向培養(yǎng)液加入純化的蛋 白 TrxHis、TrxHis-hDlll、TrxHis-hDlll-DGR 和 TrxHis_hDlll_RGD，2. 5h 后換液，再加入 Raji細胞，培養(yǎng)12h后收獲Raji細胞，提取總RNA，用實時定量RT-PCR檢測Notch下游基 因Hes5的表達水平< 0. 01)。由以上可制得本發(fā)明這種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，它是由人 Delta-likel即hDlll蛋白截短體、血管內皮細胞靶向蛋白質基序RGD和融合的TrxHis表 達標簽組成；其中hDlll蛋白截短體是hDlll第127-225位氨基酸。所述的hDlll第127-225位氨基酸包含負責與Notch受體結合的DSL結構域和部 分上游序列；所述的血管內皮細胞靶向蛋白質基序RGD是該可溶性融合蛋白的羧基末端； 所述的融合的TrxHis表達標簽是該可溶性融合蛋白的氨基末端。其中，氨基酸序列是Nol， 并由No2的核酸序列編碼Nol TrxHis-hDlll-RGD 的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap kygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferq hmdspdlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvc dehyygegcsvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry ；No2 TrxHis-hDlll-RGD 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg atcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggt atcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaa gagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacg acaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagc ggccgcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttt tctgccgtccccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaa agggccctactgcacagagccgatctgccgaggagattgcggagttcgatat。所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-R⑶具有No3的氨基酸序列，并由 No4的核酸序列編碼No3 :hDlll的DSL和上游片段的氨基酸序列l(wèi)htdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrpr ddafghftc
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No4 :hDlll的DSL和上游片段的核酸序列
ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacc acctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcct
tcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcg gccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatc。所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-R⑶具有No5的氨基酸序列，并由 No6的核酸序列編碼
列編碼

kygirg rqhmdsp
No5 :RGD基序的氨基酸序列 crgdcgvry ；
No6 :RGD基序的核酸序列 tgccgaggagattgcggagttcgatat0
所述氨基末端融合TrxHis表達標簽，包含No7的氨基酸序列，并由No8的核酸序 No7 :TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap
iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakdwfe
dlgtddddkamadigs ； No8 :TrxHis的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg
atcctcgtc
12
gatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggt atcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaa gagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacgacaaggccatggctgatatcggatcc0所述血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD是在大腸桿菌BL21中用低溫 誘導方法實現(xiàn)可溶性表達，并用針對His標簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的 TrxHis-hDlll-RGD 蛋白。本發(fā)明的一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD在體外可以通過基因 工程進行大量生產(chǎn)，應用于體內時可以結合于血管內皮細胞表面，從而向內皮細胞和其他 細胞提供針對Notch受體的激活型剌激，還可應用于在體外和體內研究Notch信號對細胞 增殖、分化和凋亡的影響，以及治療與血管新生相關的某些疾病如惡性腫瘤和視網(wǎng)膜黃斑變性。序列表序列號Nol :TrxHis-hDlll-RGD的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap kygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferq hmdspdlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvc dehyygegcsvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry序列號No2 :TrxHis-hDlll-RGD 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg atcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggt atcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaa gagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttct
ggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacgacaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccag aaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagc ggccgcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttt tctgccgtcc agggcc
ccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaa
ctactgcacagagccgatctgccgaggagattgcggagttcgatat 序列號No3 :hDlll的DSL和上游片段的氨基酸序列
lhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrpr
ddafghftc
cagaggc accgct
gergekvcnpgwkgpyctepi
序列號No4 :hDlll的DSL和上游片段的核酸序列
ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacc acctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcct
tcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcg
gccacttca

kygirg hmdsp
cctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatc
序列號No5 :RGD基序的氨基酸序列
crgdcgvry
序列號No6 :RGD基序的核酸序列 tgccgaggagattgcggagttcgatat 序列號No7 :TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferq
dlgtddddkamadigs 序列號No8 :TrxHis的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg atcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttga aagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacgacaaggccatggctgatatcggatcc
權利要求
一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis hDll1 RGD，其特征是它是由人Delta like1即hDll1蛋白截短體、血管內皮細胞靶向蛋白質基序RGD和融合的TrxHis表達標簽組成；其中hDll1蛋白截短體是hDll1第127 225位氨基酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是所述的hDlll第127-225位氨基酸包含負責與Notch受體結合的DSL結構域和部分上 游序列；所述的血管內皮細胞靶向蛋白質基序RGD是該可溶性融合蛋白的羧基末端；所述 的融合的TrxHis表達標簽是該可溶性融合蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是Nol，并由 No2的核酸序列編碼Nol :TrxHis-hDlll-RGD 的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsPdlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry ； No2 :TrxHis-hDlll-RGD 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcc tcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatc agggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcc cgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagt tcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccac gcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggcc gcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctg ccgtccccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggcc
3.根據(jù)權利要求1所述的一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列編碼No3 :hDlll的DSL和上游片段的氨基酸序列l(wèi)htdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrprddaf ghftcgergekvcnpgwkgpyctepi ；No4 :hDlll的DSL和上游片段的核酸序列ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcggcca cttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatco
4.根據(jù)權利要求1所述的一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD具有No5的氨基酸序列，并由No6 的核酸序列編碼No5 :RGD基序的氨基酸序列 crgdcgvry ；No6 :RGD基序的核酸序列 tgccgaggagattgcggagttcgatat0
5.根據(jù)權利要求2所述的一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是所述氨基末端融合TrxHis表達標簽，包含No7的氨基酸序列，并由No8的核酸序列編 碼No7 :TrxHis的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsPdlgtddddkamadigs ； No8 :TrxHis的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcc tcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatc agggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcc cgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagt tcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccac3gcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggatcc。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特 征是所述血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD是在大腸桿菌BL21中用低溫誘 導方法實現(xiàn)可溶性表達，并用針對His標簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的 TrxHis-hDlll-RGD 蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，它由人Delta-like1蛋白截短體即hDll1第127-225位氨基酸、血管內皮細胞靶向蛋白質基序RGD和TrxHis表達標簽組成；表達載體是pET32a/hDll1-RGD。轉化大腸桿菌BL21后采取28-30℃低溫誘導24h實現(xiàn)與TrxHis可溶性融合表達，用針對His標簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的TrxHis-hDll1-RGD蛋白。TrxHis-hDll1-RGD在體外可以通過基因工程進行大量生產(chǎn)，應用于體內時可以結合于血管內皮細胞表面，從而向內皮細胞和其他細胞提供針對Notch受體的激活型刺激，還可應用于在體外和體內研究Notch信號對細胞增殖、分化和凋亡的影響，以及治療與血管新生相關的某些疾病如惡性腫瘤和視網(wǎng)膜黃斑變性。
文檔編號C12N15/62GK101891824SQ20101022147
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月8日 優(yōu)先權日2010年7月8日
發(fā)明者何飛, 趙星成, 韓驊 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學