專利名稱：大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法，屬于植物基因工 程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大豆是重要的經(jīng)濟(jì)作物，因此提高和優(yōu)化大豆品質(zhì)成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。建立一 個良好的組培再生系統(tǒng)，是大豆遺傳轉(zhuǎn)化成功的前提。雖然目前轉(zhuǎn)基因大豆在全球已經(jīng)大 規(guī)模種植，其遺傳轉(zhuǎn)化仍然是基因工程領(lǐng)域的難點(diǎn)之一。大豆遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)局限于農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和胚芽轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。這幾種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)都存在轉(zhuǎn)化頻率低、難于重復(fù)及 依賴于特定的基因型等問題。大豆基因轉(zhuǎn)移和功能基因組學(xué)的進(jìn)步因而受到目前的轉(zhuǎn)化系 統(tǒng)限制。農(nóng)桿菌是一種土壤寄生菌，具有天然感染植物細(xì)胞的能力，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳 轉(zhuǎn)化已經(jīng)廣泛應(yīng)用于單子葉和雙子葉植物中。目前應(yīng)用的農(nóng)桿菌主要有根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)禾口發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)，在植物基因 工程中，利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化最多。根癌農(nóng)桿菌具有趨化性，侵染受體時，在植 物受傷組織產(chǎn)生的一些糖類和酚類物質(zhì)誘導(dǎo)下，向受傷組織集中，通過供體和受體特異互 作，農(nóng)桿菌細(xì)胞識別并附著到植物細(xì)胞表面，將Ti質(zhì)粒上的一段T-DNA片段導(dǎo)入植物細(xì)胞 并整合到植物基因組中。這個轉(zhuǎn)化過程主要包括農(nóng)桿菌積聚、農(nóng)桿菌致毒系統(tǒng)的誘導(dǎo)、 T-DNA轉(zhuǎn)移復(fù)合物的形成、T-DNA轉(zhuǎn)入并整合到植物基因組，植物受傷后產(chǎn)生的酚類誘導(dǎo)物 主要為乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，這些物質(zhì)主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不 存在于單子葉植物中，一些中性糖(如L-阿拉伯糖、D-木糖等)對農(nóng)桿菌也有誘導(dǎo)作用。 這些酚類物質(zhì)和糖類物質(zhì)既可以作為根瘤農(nóng)桿菌的趨化物，又可以作為農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒 上Vir區(qū)(毒性區(qū))基因的誘導(dǎo)物，使Vir區(qū)基因活化，促使T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移，從而侵 染植物細(xì)胞。1988年H inchee等首次用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得大豆轉(zhuǎn)基因植株。從100個栽培品 種中篩選到對農(nóng)桿菌敏感的品種Peking，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化其子葉外植體，經(jīng)檢測再生植株中 僅有6%為轉(zhuǎn)基因植株。2001年Clement等也使用了與Hinche等相似的方法，以草甘麟作 為篩選劑，獲得了 196個轉(zhuǎn)基因植株。1996年Di等用農(nóng)桿菌/子葉節(jié)系統(tǒng)以卡那霉素為 篩選劑將BPMV(bean pod mottle virus)外殼蛋白基因轉(zhuǎn)人大豆。2000年Donaldson等 用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化12個短季大豆品種子葉節(jié)，感染率可達(dá)92%，但僅從品種Accolibri得到了 遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株，且轉(zhuǎn)化率極低。2001年P(guān). M. olhoft等發(fā)現(xiàn)在固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基 中加入L-半朧氨酸(L-Cys)能大大提高農(nóng)桿菌對子葉節(jié)區(qū)的感染率。1989年P(guān)arrott等 用14個大豆品種的未成熟子葉為外植體，接種土壤農(nóng)桿菌EHA 101或LBA4404，兩株菌都含 有質(zhì)粒PH5PZ3D，該質(zhì)粒帶有15kD的玉米醇溶蛋白基因(zein)和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (apt II)，得到3株轉(zhuǎn)基因植株。2000年B. Ya η等利用根癌農(nóng)桿菌感染大豆未成熟子葉， 通過體細(xì)胞胚發(fā)生過程得到3株轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化效率為0. 03%。這一系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化效率仍很低。最近，人們又發(fā)現(xiàn)了一些新的轉(zhuǎn)化方法超聲輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(SAAT)、真空抽濾輔 助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化完整植株法、微粒轟擊與農(nóng)桿菌綜合法等，但大豆轉(zhuǎn)化的頻率仍很低，遠(yuǎn)未達(dá) 到模式化水平，還存在著重復(fù)性差，受大豆基因型限制的缺點(diǎn)，因此，尚需深入研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明所述大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法包括種子的消毒及預(yù) 培養(yǎng)處理；種子胚膨大萌動后經(jīng)切割，暴露或損傷萌動胚部位；真空滲透輔助法將含有目 的基因的農(nóng)桿菌侵染萌動胚；共培養(yǎng)；叢生芽再生、篩選及小苗生根、篩選；小苗壯苗及移 栽。具體是(1)種子消毒及預(yù)培養(yǎng)處理將大豆種子用70%乙醇消毒5分鐘，去凈乙醇后用0. 1 % HgCl2消毒10分鐘，無 菌水沖洗5-6遍，在25°C -28°C下無菌水浸種12小時。將浸種后胚膨大萌動的大豆放入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，28°C、光培養(yǎng)1天，其中所述預(yù) 培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS+3. 0-3. 5mg/L 6_BA(6_芐氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂， ρΗ5· 8。(2)種子胚膨大萌動后經(jīng)切割，暴露或損傷萌動胚部位當(dāng)預(yù)培養(yǎng)的大豆胚整體膨大、胚根長至0.5士0. 1mm，未突破種皮時，剝?nèi)シN皮，切 去胚根，保留胚芽、胚軸及1/2的子葉，同時用解剖針在胚芽尖處刺針，使針眼布滿胚芽尖。(3)真空滲透輔助法將含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染萌動胚將4°C保存的帶有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在添加了 50mg/L利福平的YEP固體培 養(yǎng)基上劃線，28°C黑暗培養(yǎng)3天后挑取單菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基， 黑暗下28°C、200r/min振蕩培養(yǎng)24小時后再次轉(zhuǎn)接，相同條件下培養(yǎng)16小時。將菌液置 于滅菌的離心管中，5000rpm離心5分鐘收集菌體，用侵染液重懸菌體，調(diào)整至0D_值為 0. 6-0. 8，加入30mg/L乙酰丁香酮，備用；其中所述侵染液配方為0. IMS大量元素+0. IMS 微量元素+B 5維生素+0. 5MES+1%葡萄糖+2%蔗糖，pH5. 4。將步驟2)處理后的大豆胚浸在OD6tltl為0. 6-0. 8并加入30mg/L乙酰丁香酮的農(nóng) 桿菌懸液中，抽真空并維持0. 05MPa壓力5-8分鐘，然后置黑暗下28°C、200r/min振蕩培養(yǎng) 15-20分鐘。⑷共培養(yǎng)將步驟(3)的大豆取出，用無菌濾紙吸去多余菌液，切面朝下置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基 上，25°C _28°C下暗培養(yǎng)3-4天；其中所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS+30mg/L乙酰丁香酮 +20g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂，pH5. 8。(5)叢生芽再生、篩選及小苗生根、篩選將步驟4)所述暗培養(yǎng)后的大豆胚用無菌水清洗3-4次，再用無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn) 接至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25°C _28°C、且每日光照14小時條件下，每兩周換至新的 培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)20士2天，分化出叢生芽。其中所述叢生芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基配方為 MS+3. 0-3. 5mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+0. 2-0. 5mg/L IAA(吲哚乙酸)+15mg/L卡那霉素 +200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8。
選篩選后長至1-2厘米的叢生芽，將小芽單獨(dú)剪下，轉(zhuǎn)移到生根篩選培養(yǎng)基上，在 250C _28°C、且每日光照14士 1小時條件下，連續(xù)培養(yǎng)14天。其中所述生根篩選培養(yǎng)基配方 為MS+0. 4-0. 6mg/L IBA (乙哚丁酸)+25mg/L卡那霉素+200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖 +7g/L 瓊脂，pH5. 8。(6)小苗壯苗及移栽選步驟5)所得的根系生長良好的小苗轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基上，在25°C -28°C且每 日光照14-15小時條件下，培養(yǎng)7-10天；其中所述壯苗培養(yǎng)基配方為MS+2. 0-2. 5mg/L KT (激動素)+0. 4-0. 6mg/L NAA( α -萘乙酸)+20g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂，ρΗ5· 8。當(dāng)小苗經(jīng)篩選存活、且根系生長良好后，將其不傷及根部取出，除去殘存培養(yǎng)基移 入土壤，用薄膜覆蓋花盆以提高濕度。上述大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法中所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基配方優(yōu) 選為MS+3. 2mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8。上述大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法中所述叢生芽誘導(dǎo)篩選培 養(yǎng)基配方優(yōu)選為MS+3. 2mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+0. 35mg/L吲哚乙酸+15mg/L卡那霉素 +200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8。上述大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法中生根篩選培養(yǎng)基配方優(yōu)選 為MS+0. 5mg/L乙哚丁酸+25mg/L卡那霉素+200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂， ρΗ5· 8。上述大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法中壯苗培養(yǎng)基配方優(yōu)選為 MS+2. 2mg/L 激動素 +0. 5mg/L α -萘乙酸 +20g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂，pH5. 8。當(dāng)小苗在土壤中長出4-7片新葉，剪取2-3片新葉用CTAB法提取DNA檢測。大豆葉片經(jīng)液氮研磨后迅速轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入600 μ 1 65°C預(yù)熱的 2XCTAB提取緩沖液，顛倒離心管混勻，65°C水浴30分鐘。混合物冷卻至室溫后加入等體 積的酚氯仿異戊醇(體積比25 24 1)，混勻后12000rpm離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn) 移至新管，加入等體積氯仿異戊醇(體積比24 1)，混勻后12000rpm離心10分鐘，上 清液轉(zhuǎn)移至新管，加入三分之二體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，12000rpm離心10分鐘，棄去上清 液，70%乙醇不打散沉淀洗滌3次，棄去乙醇將沉淀晾干，用30 μ 1雙蒸水溶解后PCR檢測。本發(fā)明所述真空滲透輔助的大豆萌動胚外源基因轉(zhuǎn)化方法的特點(diǎn)和有益效果 是(1)叢生芽再生速度快，轉(zhuǎn)化周期短，從大豆預(yù)處理開始60-70天即可獲得轉(zhuǎn)基因 植株；(2)以萌動胚為外植體誘導(dǎo)叢生芽可以避免愈傷組織培養(yǎng)中引起的不良變異；(3)本發(fā)明的萌動胚叢生芽再生體系再生率高且適用于多種大豆品種(例如冀 豆12號，圣豆9號等)，適用性廣，克服了基因型對大豆遺傳轉(zhuǎn)化的限制；(4)不可育的再生植株少；(5)外植體來源廣，不受時間限制；(6)操作比較簡單，易于掌握，重復(fù)性好；(7)轉(zhuǎn)化頻率高，是一個能夠用于大豆轉(zhuǎn)基因育種的有效的體系。


圖1示PK7WG2D載體圖(含snacl和snac6基因)。圖2示大豆再生苗生根。圖3示pKGWFS7載體圖(含gus基因)。圖4示轉(zhuǎn)gus基因植株P(guān)CR陽性植株的⑶S染色結(jié)果。圖5轉(zhuǎn)snacl基因植株35S引物PCR檢測電泳圖，其中M為Marker (DNA/ HindIII-EcoRI)。圖6示轉(zhuǎn)snacl基因植株snacl基因引物PCR檢測電泳圖，其中M為Marker (DNA/ HindIII-EcoRI)。圖7示示轉(zhuǎn)snacl基因植株snacl基因在大豆中的非重復(fù)序列引物PCR檢測電泳 圖，其中 M 為 Marker (DNA/HindlII-EcoRI)。圖8示轉(zhuǎn)snac6基因植株35S引物PCR檢測電泳圖，其中M為Marker (DNA/ HindIII-EcoRI)。圖9示轉(zhuǎn)snac6基因植株snac6基因引物PCR檢測電泳圖，其中M為Marker (DNA/ HindIII-EcoRI)。圖10示轉(zhuǎn)SnaC6基因植株snaC6基因在大豆中的非重復(fù)序列引物PCR檢測電泳 圖，其中 M 為 Marker (DNA/HindlII-EcoRI)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 以冀豆12 (購買自濰坊農(nóng)科院)為受體材料，轉(zhuǎn)化菌株為攜帶psnacl :K7WG2D載 體的農(nóng)桿菌菌株AGL104 (載體購買自Invitrogen公司)。(1)種子消毒及預(yù)培養(yǎng)處理將大豆種子用70%乙醇消毒5分鐘，去凈乙醇后用0. 1 % HgCl2消毒10分鐘，無 菌水沖洗5-6遍，在25°C -28°C下無菌水浸種12小時。將浸種后胚膨大萌動的大豆放入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，28°C、光培養(yǎng)1天，其中所述預(yù)培 養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS+3. Omg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8。(2)種子胚膨大萌動后經(jīng)切割，暴露或損傷萌動胚部位當(dāng)預(yù)培養(yǎng)的大豆胚整體膨大、胚根長至0. 5士0. Imm,未突破種皮時，剝?nèi)シN皮，切 去胚根，保留胚芽、胚軸及1/2的子葉，同時用解剖針在胚芽尖處刺針，使針眼布滿胚芽尖。(3)真空滲透輔助法將含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染萌動胚將4°C保存的帶有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在添加了 50mg/L利福平的YEP固體培養(yǎng) 基上劃線，28°C黑暗培養(yǎng)3天后挑取單菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基，黑 暗下28°C、200r/min振蕩培養(yǎng)24小時后再次轉(zhuǎn)接，相同條件下培養(yǎng)16小時。將菌液置于 滅菌的離心管中，5000rpm離心5分鐘收集菌體，用侵染液重懸菌體，調(diào)整至0D_值為0. 6， 加入30mg/L乙酰丁香酮備用。其中所述侵染液配方為0. IMS大量+0. IMS微量+B 5維生 素 +0. 5MES+1% 葡萄糖 +2% 蔗糖，ρΗ5· 4。將步驟(2)的大豆浸入農(nóng)桿菌菌液中，抽真空并維持0.05MPa壓力5-8分鐘，黑暗 下28°C、200r/min振蕩培養(yǎng)，侵染15_20min鐘。
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(4)共培養(yǎng)將步驟(3)的大豆取出，用無菌濾紙吸去多余菌液，切面朝下置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基 上，25°C _28°C下暗培養(yǎng)4天。其中所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS+30mg/L乙酰丁香酮+20g/ L 蔗糖 +7g/L 瓊脂，pH5. 8。(5)叢生芽再生、篩選及小苗生根、篩選將共培養(yǎng)后的大豆用無菌水清洗4次，再用無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)接至叢生芽誘導(dǎo)培 養(yǎng)基上，在25°C、且每日光照14小時條件下，每兩周換至新的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)20士2天， 分化出叢生芽。其中所述叢生芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基配方為MS+3.0mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌 呤)+0. 2mg/L IAA (吲哚乙酸)+15mg/L卡那霉素+200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L 瓊脂，pH5. 8。選篩選后長至1-2厘米的叢生芽，將小芽單獨(dú)剪下，轉(zhuǎn)移到生根篩選培養(yǎng)基上，在 25°C°C、且每日光照14士 1小時條件下，連續(xù)培養(yǎng)14天。其中所述生根篩選培養(yǎng)基配方為 MS+0. 4mg/L IBA (乙哚丁酸)+25mg/L卡那霉素+200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L瓊 脂，pH5. 8。(6)小苗壯苗及移栽選根系生長良好的小苗轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基上，在25°C°C且每日光照14小時條件 下，培養(yǎng)7-10天。當(dāng)小苗經(jīng)篩選存活、且根系生長良好后，將其不傷及根部取出，除去殘存 培養(yǎng)基移入土壤，用薄膜覆蓋花盆以提高濕度。其中所述壯苗培養(yǎng)基配方為MS+2.0mg/ LKT(激動素)+0. 4mg/L ΝΑΑ(α-萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，ρΗ5· 8。移栽成活率大 于 90%。當(dāng)小苗在土壤中長出4-7片新葉，剪取2-3片新葉用CTAB法提取DNA檢測。大豆 葉片經(jīng)液氮研磨后迅速轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管中，加入600 μ 1 65°C預(yù)熱的2 X CTAB提取緩沖 液，顛倒離心管混勻，65°C水浴30分鐘?；旌衔锢鋮s至室溫后加入等體積的酚氯仿異 戊醇(體積比25 24 1)，混勻后12000rpm離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新管，加入等體 積氯仿異戊醇(體積比24 1)，混勻后12000rpm離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新管，加入 三分之二體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，12000rpm離心10分鐘，棄去上清液。70%乙醇不打散沉 淀洗滌3次，棄去乙醇將沉淀晾干。用30 μ 1雙蒸水溶解。PCR法檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株抗性植株總DNA分別用35S啟動子引物、snacl基因 引物和snacl基因在大豆中的非重復(fù)序列引物進(jìn)行PCR檢測。
PCR 反應(yīng)條件如下預(yù)變性 94°C 5min，94°C 30sec，52°C -57°C 30min，72°C 2min, 35個循環(huán)，72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用1.0% Agrose電泳鑒定。結(jié)果利用大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法，對冀豆12進(jìn)行了農(nóng)桿 菌轉(zhuǎn)化。三次生物學(xué)重復(fù)(共600顆種子)叢生芽芽再生獲得510植株，抗生素篩選具有 抗性植株37株。轉(zhuǎn)基因陽性植株經(jīng)PCR檢測，證明27株為陽性植株，轉(zhuǎn)化率為5. 3%。實(shí)施例2 以圣豆9號(購買自濰坊農(nóng)科院)為受體材料，轉(zhuǎn)化菌株為攜帶有 psnac6: :K7WG2D 的農(nóng)桿菌 AGL104 (p2K7GW7 載體購買自 Invitrogen 公司)。(1)種子消毒及預(yù)培養(yǎng)處理將大豆種子用70%乙醇消毒5分鐘，去凈乙醇后用0. 1 % HgCl2消毒10分鐘，無 菌水沖洗5-6遍，在25°C -28°C下無菌水浸種12小時。將浸種后胚膨大萌動的大豆放入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，28°C、光培養(yǎng)1天，其中所述預(yù)培 養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS+3. 2mg/L 6_BA(6_芐氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8。(2)種子胚膨大萌動后經(jīng)切割，暴露或損傷萌動胚部位當(dāng)預(yù)培養(yǎng)的大豆胚整體膨大、胚根長至0. 5士0. Imm,未突破種皮時，剝?nèi)シN皮，切 去胚根，保留胚芽、胚軸及1/2的子葉，同時用解剖針在胚芽尖處刺針，使針眼布滿胚芽尖。(3)真空滲透輔助法將含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染萌動胚將4°C保存的帶有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在添加了 50mg/L利福平的YEP固體培養(yǎng) 基上劃線，28°C黑暗培養(yǎng)3天后挑取單菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基，黑 暗下28°C、200r/min振蕩培養(yǎng)24小時后再次轉(zhuǎn)接，相同條件下培養(yǎng)16小時。將菌液置于 滅菌的離心管中，5000rpm離心5分鐘收集菌體，用侵染液重懸菌體，調(diào)整至0D_值為0. 7， 加入30mg/L乙酰丁香酮備用。其中所述侵染液配方為0. IMS大量+0. IMS微量+B5維生 素 +0. 5MES+1%葡萄糖 +2%蔗糖，ρΗ5· 4。將步驟(2)的大豆浸入農(nóng)桿菌菌液中，抽真空并維持0.05MPa壓力5-8分鐘，黑暗 下28°C、200r/min振蕩培養(yǎng)，侵染15_20min鐘。(4)共培養(yǎng)將步驟(3)的大豆取出，用無菌濾紙吸去多余菌液，切面朝下置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基 上，25°C _28°C下暗培養(yǎng)3天。其中所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS+30mg/L乙酰丁香酮+20g/ L 蔗糖 +7g/L 瓊脂，pH5. 8。(5)叢生芽再生、篩選及小苗生根、篩選將共培養(yǎng)后的大豆用無菌水清洗4次，再用無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)接至叢生芽誘導(dǎo)培 養(yǎng)基上，在28°C、且每日光照14小時條件下，每兩周換至新的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)20士2天， 分化出叢生芽。其中所述叢生芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基配方為MS+3.2mg/L 6_BA(6_芐氨基腺嘌 呤)+0. 35mg/L IAA (吲哚乙酸)+15mg/L卡那霉素+200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L 瓊脂，pH5. 8。選篩選后長至1-2厘米的叢生芽，將小芽單獨(dú)剪下，轉(zhuǎn)移到生根篩選培養(yǎng)基上，在 28°C、且每日光照14士 1小時條件下，連續(xù)培養(yǎng)14天。其中所述生根篩選培養(yǎng)基配方為 MS+0. 5mg/L IBA (乙哚丁酸)+25mg/L卡那霉素+200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L瓊 脂，pH5. 8。(6)小苗壯苗及移栽選根系生長良好的小苗轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基上，在28°C且每日光照14小時條件下， 培養(yǎng)7-10天。當(dāng)小苗經(jīng)篩選存活、且根系生長良好后，將其不傷及根部取出，除去殘存培養(yǎng) 基移入土壤，用薄膜覆蓋花盆以提高濕度。其中所述壯苗培養(yǎng)基配方為MS+2.2mg/LKT(激 動素)+0.5mg/L ΝΑΑ(α-萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。移栽成活率大于90%。當(dāng)小苗在土壤中長出4-7片新葉，剪取2-3片新葉用CTAB法提取DNA檢測。大豆 葉片經(jīng)液氮研磨后迅速轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管中，加入600 μ 1 65°C預(yù)熱的2 X CTAB提取緩沖 液，顛倒離心管混勻，65°C水浴30分鐘?；旌衔锢鋮s至室溫后加入等體積的酚氯仿異 戊醇(體積比25 24 1)，混勻后12000rpm離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新管，加入等體 積氯仿異戊醇(體積比24 1)，混勻后12000rpm離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新管，加入 三分之二體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，12000rpm離心10分鐘，棄去上清液。70%乙醇不打散沉 淀洗滌3次，棄去乙醇將沉淀晾干。用30 μ 1雙蒸水溶解。PCR法檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株抗性植株總DNA分別用35S啟動子引物、snac6基因 引物和snace基因在大豆中的非重復(fù)序列引物進(jìn)行PCR檢測。
PCR 反應(yīng)條件如下預(yù)變性 94°C 5min，94°C 30sec,50°C -55°C 30min,72°C 2min, 35個循環(huán)，72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用1.0% Agrose電泳鑒定。結(jié)果利用大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法，對圣豆9號了農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化。三次生物學(xué)重復(fù)(共600顆種子)，叢生芽再生獲得591株，抗生素篩選具有抗性植 株46株。轉(zhuǎn)基因陽性植株經(jīng)PCR檢測，證明31株為陽性植株，轉(zhuǎn)化率為5. 2%。本發(fā)明中所述MS培養(yǎng)基配方如下
權(quán)利要求
大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法，步驟包括1)種子的消毒及預(yù)培養(yǎng)處理；2)種子胚膨大萌動后經(jīng)切割，暴露或損傷萌動胚部位；3)真空滲透輔助法將含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染萌動胚；4)共培養(yǎng)；5)叢生芽再生、篩選及小苗生根、篩選；6)小苗壯苗及移栽；其特征在于步驟1)所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS+3.0-3.5mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8；步驟2)所述種子胚膨大萌動后經(jīng)切割，暴露或損傷萌動胚部位是的方法是當(dāng)預(yù)培養(yǎng)的大豆胚整體膨大、胚根長至0.5±0.1mm，未突破種皮時，剝?nèi)シN皮，切去胚根，保留胚芽、胚軸及1/2的子葉，同時用解剖針在胚芽尖處刺針，使針眼布滿胚芽尖；步驟3)所述真空滲透輔助法將含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染萌動胚的方法是將步驟2)處理后的大豆胚浸在OD600為0.6-0.8并加入30mg/L乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌懸液中，抽真空并維持0.05MPa壓力5-8分鐘，然后置黑暗下28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)15-20分鐘；步驟4)所述共培養(yǎng)的方法是將步驟3)處理后的大豆胚切面朝下置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃-28℃下暗培養(yǎng)3-4天，其中所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS+30mg/L乙酰丁香酮+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8；步驟5)所述叢生芽再生、篩選及小苗生根、篩選的方法是將步驟4)所述暗培養(yǎng)后的大豆胚用無菌水清洗3-4次，再用無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)接至叢生芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基上，在25℃-28℃、且每日光照14-15小時條件下，連續(xù)培養(yǎng)20±2天，分化出叢生芽；選長至1-2cm的叢生芽，將小芽單獨(dú)剪下，轉(zhuǎn)移到生根篩選培養(yǎng)基上，在25℃-28℃、且每日光照14-15小時條件下，培養(yǎng)14±1天，進(jìn)行生根及篩選，其中所述叢生芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基配方為MS+3.0-3.5mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+0.2-0.5mg/L吲哚乙酸+15mg/L卡那霉素+200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8，所述生根篩選培養(yǎng)基配方為MS+0.4-0.6mg/L乙哚丁酸+25mg/L卡那霉素+200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8；步驟6)所述小苗壯苗的方法是選步驟5)所述生根的小苗轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基上，在25℃-28℃、且每日光照14-15小時條件下，培養(yǎng)7-10天，其中所述壯苗培養(yǎng)基配方為MS+2.0-2.5mg/L激動素+0.4-0.6mg/L α-萘乙酸+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。
2.如權(quán)利要求1所述大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所 述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS+3. 2mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8。
3.如權(quán)利要求1所述大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于 所述叢生芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基配方為MS+3.2mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+0. 35mg/L吲哚乙酸 +15mg/L卡那霉素+200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8。
4.如權(quán)利要求1所述大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所 述生根篩選培養(yǎng)基配方為MS+0. 5mg/L乙哚丁酸+25mg/L卡那霉素+200mg/L頭孢噻肟鈉 +20g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂，pH5. 8。
5.如權(quán)利要求1所述大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所 述壯苗培養(yǎng)基配方為MS+2. 2mg/L激動素+0. 5mg/La -萘乙酸+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂， ρΗ5· 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法，所述方法包括以下步驟(1)種子的消毒及預(yù)培養(yǎng)處理(2)種子胚膨大萌動后經(jīng)切割，暴露或損傷萌動胚部位(3)含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染萌動胚(4)共培養(yǎng)(5)叢生芽再生、篩選及小苗生根、篩選(6)叢生芽再生、篩選及小苗生根、篩選。本發(fā)明方法適用于多種基因型，且再生速度快，是一個能夠用于大豆轉(zhuǎn)基因育種的可靠體系。
文檔編號C12N15/82GK101880686SQ20101022326
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月12日
發(fā)明者向鳳寧, 姬丹丹, 王鵬 申請人:山東大學(xué)