專利名稱：用于胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)液以及牛胚胎體外生產(chǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)液以及牛早期 胚胎體外生產(chǎn)的方法。
背景技術(shù)：
動物胚胎移植是指將從一頭受孕母畜(供體)的生殖管道中取出的受精卵或發(fā)育 到一定時期的早期胚胎，移植到與供體母畜同步發(fā)情的母畜(受體)生殖管道的一定部位， 使其繼續(xù)生長、發(fā)育，長成子畜的技術(shù)。利用胚胎移植可以縮短動物繁殖周期，進一步挖掘 動物的繁殖潛力，為優(yōu)良牲畜的大量繁殖，稀有動物的種族延續(xù)提供有效的解決辦法，在畜 牧業(yè)和制藥業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。由于從供體母畜收集受精卵易受動物生殖周期的影響，現(xiàn)在胚胎移植大都采用動 物早期胚胎進行移植，這就使動物早期胚胎的體外培養(yǎng)在胚胎移植中占有重要地位。動物 早期胚胎體外培養(yǎng)是指將采集到的卵母細胞在體外經(jīng)人工培養(yǎng)成熟后，通過體外受精、核 移植和孤雌激活等技術(shù)使卵母細胞受精或被激活，然后移至體外培養(yǎng)基中使其生長發(fā)育至 囊胚期的胚胎工程技術(shù)，該技術(shù)可以不受動物生殖周期的影響，大規(guī)模地進行動物早期胚 胎的體外生產(chǎn)。胚胎的體外培養(yǎng)已有40多年的發(fā)展歷史。目前，胚胎在體外培養(yǎng)條件下能夠存活 并發(fā)育，移植后能夠妊娠產(chǎn)仔，在胚胎工程和生產(chǎn)實踐中有了廣泛的應(yīng)用。目前體外胚胎的 生產(chǎn)效率仍然很低，胚胎的質(zhì)量與體內(nèi)胚胎相比還存在很大的差距。牛胚胎體外主要存在 的問題為受胎率偏低、妊娠期延長、流產(chǎn)率增加、牛犢的生命力強弱不一、性比例偏斜、圍 產(chǎn)期和新生期犢牛的死亡率和畸形率增加等。其主要原因是體外培養(yǎng)體系還不能完全模擬 母畜體內(nèi)環(huán)境，還不夠穩(wěn)定。在體內(nèi)，胚胎通過輸卵管遷移至子宮，胚胎暴露于動態(tài)環(huán)境。而 已經(jīng)發(fā)展起來的絕大多數(shù)胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)都是在一段時間相對平衡穩(wěn)定的環(huán)境，胚胎仍然處 于一個相對靜止的環(huán)境，還無法完全模擬出與雌性生殖道相同的物理或環(huán)境條件，無法適 應(yīng)早期胚胎分化發(fā)育的需求。因此，胚胎的體外培養(yǎng)體系還有待于進一步的優(yōu)化、改進。目前常用的培養(yǎng)方法是體細胞共培養(yǎng)和序貫培養(yǎng)兩種。共培養(yǎng)是輔助細胞或體細 胞與胚胎在體外一起培養(yǎng)，更佳地模擬了胚胎在體內(nèi)的發(fā)育環(huán)境，各種體細胞的混合培養(yǎng) 以及一些生長因子的添加都極大地推動了體外受精技術(shù)的進一步完善。該培養(yǎng)系統(tǒng)可以促 進胚胎的發(fā)育，高胚胎質(zhì)量，使囊胚的形成率得到提高。然而共培養(yǎng)系統(tǒng)中有很多不確定因 子，并且體細胞可能充當病原的傳播載體，產(chǎn)生對胚胎的污染。序貫培養(yǎng)是根據(jù)體外培養(yǎng)的胚胎在不同生長時間里對不同物質(zhì)需求和代謝的不 同，配制一系列不同成分的培養(yǎng)液，進行序列更換，從而延長胚胎在體外的培養(yǎng)時間，增加 體外篩選機會的方法，但該方法需要更換多種培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基需要篩選，操作麻煩，而 且容易污染。各培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)液成分是整個培養(yǎng)過程中最為關(guān)鍵的部分，它決定了動物早期 胚胎生長發(fā)育率。目前TCM-199、CZB、KSOM等單純的基礎(chǔ)培養(yǎng)液不能完全模擬胚胎體內(nèi)發(fā)育的環(huán)境，并且不能完全提供早期胚胎發(fā)育所必須的營養(yǎng)和非營養(yǎng)物質(zhì)，由此極大降低了 胚胎發(fā)育成囊胚的效率。就牛早期胚胎體外生產(chǎn)而言，這些問題尤為突出，極大地制約著畜 牧業(yè)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液 可顯著促進體外胚胎向囊胚的發(fā)育，提高囊胚發(fā)育率從而進一步提高牛體外胚胎生產(chǎn)效率。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明所述用于胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)液為包含5-lOmmol/L HepesU5-26. 2mmol/ L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及 3-5% OCS 的 TCM-199 基礎(chǔ)培養(yǎng)液。BDNF，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor)，主要存在于 大腦和外周組織，對神經(jīng)細胞的分化和神經(jīng)元存活具有重要作用。最近研究表明，這些因子 也表達在一些非神經(jīng)系統(tǒng)中，如心血管、免疫、內(nèi)分泌、生殖系統(tǒng)，并且參與調(diào)節(jié)這些系統(tǒng)的 功能。在本發(fā)明的具體實施方式
中，發(fā)現(xiàn)BDNF在不同發(fā)育階段的卵母細胞和胚胎以及 不同方法生產(chǎn)的早期胚胎中均有表達，BDNF對早期胚胎發(fā)育有促進作用。用含BDNF的培養(yǎng) 液培養(yǎng)早期胚胎，當BDNF濃度介于30 50 μ g/L時，顯著提高牛體外胚胎向囊胚的發(fā)育。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)常識將其應(yīng)用于其它哺乳動物如馬、羊等的胚胎體外生產(chǎn)。同樣的， 所述培養(yǎng)液也可以提高顯著促進發(fā)育，提高早期胚胎的囊胚發(fā)育率。作為優(yōu)選，所述用于胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)液中BDNF濃度為40μ g/L。本發(fā)明的另一個目的是提供一種牛胚胎體外生產(chǎn)的方法，包括在含5-lOmmol/L H印es、15-26. 2mmol/L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及 3-5% OCS 的 TCM-199 培養(yǎng)液培 養(yǎng)早期胚胎，定期更換培養(yǎng)液，獲得囊胚期胚胎的步驟。作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)液為含有5mmol/L H印es、26. 2mmol/LNaHCO3、40 μ g/L 的 BDNF 以及3% OCS的TCM-199培養(yǎng)液。所述早期胚胎為通過體外受精、孤雌激活或核移植生產(chǎn)的早期胚胎。體外受精，英文簡稱為IVF，是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中 完成受精過程的技術(shù)。孤雌激活是指是M II期卵母細胞不經(jīng)過精子刺激，而通過化學(xué)或物理等人工刺激 模擬受精過程，恢復(fù)并完成第二次減數(shù)分裂，發(fā)生卵裂并形成早期胚胎。核移植是指將供體細胞核移入去核的卵母細胞中，使后者不經(jīng)精子穿透等有性過 程即可被激活、分裂并發(fā)育成早期胚胎。作為優(yōu)選，所述方法中每隔48h更換為新鮮的本發(fā)明所述培養(yǎng)液。本發(fā)明將BNDF應(yīng)用到胚胎體外培養(yǎng)領(lǐng)域，獲得了更為理想、發(fā)育率更高的胚胎體 外培養(yǎng)液。利用本發(fā)明所述培養(yǎng)液體外培養(yǎng)牛胚胎，可顯著提高早期胚胎的囊胚發(fā)育率，完 善了現(xiàn)有的培養(yǎng)系統(tǒng)，大大提高了體外胚胎生產(chǎn)的質(zhì)量和效率。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)液以及利用該培養(yǎng)液進行牛胚胎體外生產(chǎn)的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的 是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本 發(fā)明。本發(fā)明所述培養(yǎng)液及方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫 離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實 現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。依照本發(fā)明，所述用于胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)液為含有5mmol/Iifepes、26. 2mmol/L NaHCO3>40 μ g/L 的 BDNF 以及 3% OCS 的 TCM-199 培養(yǎng)液。在BDNF對早期胚胎發(fā)育影響的實驗中，以體外受精和孤雌激活方式生產(chǎn)的兩種 早期胚胎，在本發(fā)明所述牛早期胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在BDNF濃度為30 50 μ g/ L時，與未加有BDNF的培養(yǎng)液以及加其它濃度的BDNF的培養(yǎng)液相比，囊胚率顯著提高。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液中BDNF濃度為40 μ g/L時，可使以體外受精方式生產(chǎn)的早期 胚胎的囊胚率提高至51. 22%，以孤雌激活方式生產(chǎn)的早期胚胎的囊胚率提高至58. 41%。本發(fā)明另一方面還提供了一種牛早期胚胎體外生產(chǎn)的方法，包括在含5-lOmmol/L H印es、15-26. 2mmol/L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及 3-5% OCS 的 TCM-199 培養(yǎng)液培 養(yǎng)早期胚胎，每隔48h更換培養(yǎng)液，獲得囊胚期胚胎的步驟。所述早期胚胎的生產(chǎn)方式包括體外受精、孤雌激活或核移植。卵母細胞正常受精時，精子與卵子質(zhì)膜直接融合或通過表面上的受體蛋白引起卵 內(nèi)Ca2+濃度的瞬時升高，由此引起包括皮質(zhì)顆粒(CG)釋放、細胞質(zhì)內(nèi)pH的改變、母源mRNA 的補充等一系列激活反應(yīng)，最終導(dǎo)致原核的形成、DNA合成的起始和卵裂。核移植、卵母細胞體外受精和孤雌激活是胚胎工程研究領(lǐng)域獲得胚胎的重要途 徑。卵母細胞孤雌激活是一種人工激活卵的方式，通過電脈沖、Ionomycin、乙醇、鈣離子載 體、放線菌酮和1，4，5_三磷酸肌醇(IP3)等都可以引起卵母細胞的激活，使MII期卵母細 胞不經(jīng)過受精過程完成早期胚胎發(fā)育，獲得孤雌胚胎。孤雌激活與體外受精都是以MII期卵母細胞為起點，都能獲得早期胚胎，但孤雌 激活與體外受精存在本質(zhì)的區(qū)別；前者是人工活化卵母細胞，后者是活化卵母細胞；孤雌 激活胚是通過抑制第二極體排放，使其與原來的卵母細胞核融合構(gòu)成二倍體的胚胎，而體 外受精胚胎是由雌雄配子融合所獲得的胚胎，孤雌激活和體外受精是兩項相對獨立的技術(shù) 但又有密切的聯(lián)系。核移植是指將供體細胞核移入去核的卵母細胞中，使后者不經(jīng)精子穿透等有性過 程即可被激活、分裂并發(fā)育成早期胚胎。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明。實施例1 早期胚胎BDNF mRNA表達水平的檢測用熒光定量PCR技術(shù)檢測BDNF在不同發(fā)育階段卵母細胞和胚胎以及不同方法生 產(chǎn)早期胚胎(體外受精胚胎、孤雌激活、核移植胚胎)中的表達水平，結(jié)果見表1和表2。表1不同發(fā)育階段牛卵母細胞和體外受精胚胎BDNF mRNA表達水平 注不同大寫字母表示差異極顯著(P < 0. 01)表2 牛不同類型胚胎中BDNF mRNA表達水平 注不同大寫字母表示差異極顯著(P < 0. 01)以上結(jié)果表明，BDNF在不同發(fā)育階段的卵母細胞和胚胎以及不同方法生產(chǎn)的早期 胚胎中均有表達，BDNF對早期胚胎發(fā)育有促進作用。實施例2 用免疫熒光技術(shù)檢測BDNF蛋白在胚胎中的表達用免疫熒光技術(shù)檢測BDNF蛋白在胚胎中的表達，顯示BDNF蛋白信號主要集中在 囊胚的外胚層。實施例3 卵母細胞的收集及體外成熟將屠宰場收集的牛卵巢，置于含有K+、Ca2+和Mg2+的35 37°C生理鹽水保溫瓶 內(nèi)，4h內(nèi)送到實驗室，用37°C的生理鹽水洗凈。然后用帶有12號針頭的IOmL注射器抽取 直徑為2 6mm卵泡中的卵母細胞。在實體顯微鏡下挑選出細胞質(zhì)均勻、并有完整或部 分致密卵丘細胞的卵母細胞，用洗卵液清洗兩遍后，放入含1.5mL成熟培養(yǎng)液的玻璃平皿 (30X IOmm)中，在38. 5°C、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 24h，獲得成熟的卵母 細胞。實施例4 體外受精生產(chǎn)早期胚胎將凍精在37 0C水浴中解凍后，取0. 25mL精液小心置于含有1. 5mL改良的 Tyrode' s受精液的圓底試管底部，15min懸浮后，活精子上游，然后將上層液吸出，離心洗 滌及濃縮一次去上清，留約30 μ L備用。在培養(yǎng)皿中做30μ1的受精微滴，覆蓋以石蠟油， 放入38. 5°C,5% CO2和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中至少平衡lh。用細管機械去除包繞在實 施例1制備的成熟卵母細胞周圍的卵丘細胞，用新鮮洗卵液洗滌卵母細胞2 3次。將洗 滌后的卵母細胞放入微滴中，每滴加15 25個卵母細胞，再加2 5 μ L的精子懸液，使得 精子濃度為1. OX IO6 1.5 X IO6個/mL。將含精卵的培養(yǎng)皿放回38. 5°C，5 % CO2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)24h，獲得早期胚胎。實施例5 孤雌激活生產(chǎn)早期胚胎取實施例3制備的體外成熟培養(yǎng)20 22h后的卵母細胞，用吸管反復(fù)吹打去掉卵 母細胞周圍的卵丘細胞。將卵母細胞在含5 μ mol/L離子霉素的培養(yǎng)液內(nèi)處理5min，之后用 培養(yǎng)液洗3次，再移入含2mmol/L 6- 二甲氨基嘌呤培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)3h，得到早期胚胎。實施例6 本發(fā)明所述培養(yǎng)液對體外受精生產(chǎn)的早期胚胎發(fā)育影響以 TCM-199+5mmol/L Hepes+26. 2mmol/L NaHC0s+3% OCS 為胚胎基礎(chǔ)液，向其中添加不同濃度的BDNF，在38. 5°C,5% CO2條件下對實施例4體外受精生產(chǎn)的早期胚胎進行培 養(yǎng)，培養(yǎng)液每隔48h更換一次，培養(yǎng)48h后檢查分裂率，7d后記錄發(fā)育的囊胚率，結(jié)果見表 3。(卵裂數(shù)百分比=卵裂數(shù)/卵母細胞數(shù)％ ；囊胚數(shù)數(shù)百分比=囊胚數(shù)/卵裂數(shù)％ ；孵化 數(shù)百分比=孵化數(shù)/卵裂數(shù)％)表3不同濃度BDNF對牛體外受精胚胎的影響 注上標表示與不加BDNF組相比，差異顯著a =P < 0. 05，b =P < 0. 01由表 3 得知，含 5-10mmol/L H印es、15-26. 2mmol/L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及3-5% OCS的TCM-199培養(yǎng)液能顯著提高體外受精胚胎的囊胚率，優(yōu)選地培養(yǎng)液中 BDNF 濃度為 40 μ g/L。實施例7 本發(fā)明所述培養(yǎng)液對孤雌激活生產(chǎn)的早期胚胎發(fā)育影響參照實施例6中方法，對實施例5孤雌激活生產(chǎn)的早期胚胎進行培養(yǎng)，結(jié)果見表4。表4不同濃度BDNF對牛孤雌激活胚胎的影響
7. 注上標表示與不加BDNF組相比，差異顯著a =P < 0. 05由表 4 得知，含 5-10mmol/L H印es、15-26. 2mmol/L NaHCO3、30 50 μ g/L 的 BDNF 以及3-5% OCS的TCM-199培養(yǎng)液能顯著提高孤雌激活胚胎的囊胚率，優(yōu)選地培養(yǎng)液中 BDNF 濃度為 40 μ g/L。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種用于胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液為含5-10mmol/L Hepes、15-26.2mmol/L NaHCO3、30～50μg/L的BDNF以及3-5％OCS的TCM-199培養(yǎng)液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液為含有5mm0l/LHepes、 26. 2mmol/L NaHCO3>40 μ g/L 的 BDNF 以及 3% OCS 的 TCM-199 培養(yǎng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述培養(yǎng)液，其特征在于，所述胚胎為牛早期胚胎。
4.一種牛胚胎體外生產(chǎn)的方法，其特征在于，包括在含5-lOmmol/Iifepes、 15-26. 2mmol/L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及 3-5% OCS 的 TCM-199 培養(yǎng)液中培養(yǎng)牛 早期胚胎，定期更換培養(yǎng)液，獲得囊胚期胚胎的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，所述培養(yǎng)液為含有5mm0l/LHepes、 26. 2mmol/L NaHCO3>40 μ g/L 的 BDNF 以及 3% OCS 的 TCM-199 培養(yǎng)液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述方法，其特征在于，所述早期胚胎為通過體外受精生產(chǎn)的早 期胚胎。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述方法，其特征在于，所述早期胚胎為通過孤雌激活生產(chǎn)的早 期胚胎。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述方法，其特征在于，所述早期胚胎為通過核移植生產(chǎn)的早期 胚胎。全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種用于胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液為含5-10mmol/L Hepes、15-26.2mmol/L NaHCO3、30～50μg/L的BDNF以及3-5％OCS的TCM-199培養(yǎng)液，其中優(yōu)選地所述培養(yǎng)液中BDNF濃度為40μg/L。本發(fā)明所述培養(yǎng)液能顯著提高牛體外胚胎發(fā)育成囊胚的比率。本發(fā)明還提供了利用所述培養(yǎng)液進行牛胚胎體外生產(chǎn)的方法。
文檔編號C12N5/073GK101886059SQ201010224589
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月6日
發(fā)明者周虛, 易康樂, 李純錦 申請人:周虛