專利名稱：一種厭氧氨氧化菌的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有厭氧氨氧化活性菌的分離方法。
背景技術(shù)：
厭氧氨氧化(Anaerobic ammonia oxidation, ΑΝΑΜΜ0Χ)技術(shù)由于具有高效、低耗 和環(huán)境友好等特性已在廢水處理方面受到研究者們的廣泛關(guān)注。與傳統(tǒng)硝化_反硝化生物 脫氮方法相比，厭氧氨氧化工藝具有以下優(yōu)點(diǎn)厭氧氨氧化菌為自養(yǎng)菌，無(wú)需外加有機(jī)物作 為電子供體，既可節(jié)省費(fèi)用，又可以防止二次污染在厭氧氨氧化反應(yīng)中，只需要將氨厭氧 氨氧化成亞硝酸鹽，相比較傳統(tǒng)硝化_反硝化過(guò)程中需要投加酸堿藥劑，而厭氧氨氧化反 應(yīng)為近中性反應(yīng)，生物產(chǎn)酸量很低，因此可以節(jié)省中和藥劑費(fèi)用；由于厭氧氨氧化菌生長(zhǎng)緩 慢，所以污泥產(chǎn)量極少，可以大大節(jié)約污泥處理處置費(fèi)用。厭氧氨氧化技術(shù)能有效克服傳統(tǒng) 生物脫氮工藝的缺點(diǎn)，因此在廢水生物脫氮領(lǐng)域具有良好的開發(fā)前景。厭氧氨氧化這種生物脫氮技術(shù)的研究歷程雖已有十余年的歷史，但至今仍未廣泛 應(yīng)用于工程實(shí)踐。目前已經(jīng)分離到的厭氧氨氧化菌均是采用密度梯度離心法得到的。密度 梯度離心法是純化病毒常用的方法，并不是菌株常用的分離方法。使用密度梯度離心法分 離菌株，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的等級(jí)要求較高，不宜普及。本發(fā)明涉及一種典型的微生物分離方法，比 現(xiàn)有的密度梯度離心法分離厭氧氨氧化菌簡(jiǎn)單、快速。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，本發(fā)明的目的在于利用一種典型的微生 物分離方法，比現(xiàn)有的密度梯度離心法分離厭氧氨氧化菌相比具有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明通過(guò)以下方案來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明實(shí)施例提供一種厭氧氨氧化菌的分離方法，包括采集原料采集顆粒污泥為原料，將所述顆粒污泥制成菌懸液；初篩富集培養(yǎng)對(duì)制成的所述菌懸液進(jìn)行初篩富集培養(yǎng)得到初篩培養(yǎng)物；復(fù)篩鑒定培養(yǎng)對(duì)所述初篩富集培養(yǎng)得到的初篩培養(yǎng)物進(jìn)行復(fù)篩鑒定培養(yǎng)，對(duì)復(fù) 篩鑒定培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，若檢測(cè)合格則培養(yǎng)物的菌株即為厭氧氨氧化菌。通過(guò)本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明實(shí)施例中以采集的顆粒污泥 為原料，制成菌懸液后，依次經(jīng)初篩富集培養(yǎng)和復(fù)篩鑒定培養(yǎng)后，即可分離得到厭氧氨氧化 菌。該方法步驟簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)從顆粒污泥快速分離厭氧氨氧化菌，具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1本實(shí)施例提供一種厭氧氨氧化菌的分離方法，相比現(xiàn)有通過(guò)密度梯度離心法分離 厭氧氨氧化菌具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，該方法具體如下
采集原料采集顆粒污泥為原料，將所述顆粒污泥制成菌懸液；可采用取自上流 式厭氧污泥床中的顆粒污泥溶液為原料，用超聲波將顆粒污泥溶液中的顆粒污泥破碎后， 制成菌懸液。初篩富集培養(yǎng)對(duì)制成的所述菌懸液進(jìn)行初篩富集培養(yǎng)得到初篩培養(yǎng)物；具體是 將所述菌懸液轉(zhuǎn)入初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基中，采用焦性沒(méi)食子酸法，該焦性沒(méi)食子酸 法具體是在干燥無(wú)菌的玻璃板或培養(yǎng)皿蓋上，鋪設(shè)一層滅菌脫脂棉或紗布，將焦性沒(méi)食子 酸設(shè)置在所述脫脂棉或紗布上；向所述焦性沒(méi)食子酸上滴加氫氧化鈉溶液后，將所述玻璃 板或培養(yǎng)皿蓋覆蓋于裝有已接種所述菌懸液的初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿的皿 底上，使設(shè)有焦性沒(méi)食子酸和氫氧化鈉溶液的所述脫脂棉或紗布全部罩住培養(yǎng)皿的皿口， 以溶化的石蠟或凡士林液密封培養(yǎng)皿的皿底與玻璃或皿蓋的接觸處，使所述菌懸液在密閉 的由焦性沒(méi)食子酸與氫氧化鈉溶液反應(yīng)形成的厭氧環(huán)境下在初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基 中進(jìn)行培養(yǎng)。在25 35°C溫度下厭氧培養(yǎng)10 15天，培養(yǎng)后得到初篩培養(yǎng)物。上述初篩富集培養(yǎng)中，所用的初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基由下述各原料按重量 份組成蒸餾水1000000份、碳酸氫鉀400 600份、磷酸氫二鈉25 30份、七水硫酸鎂 200 400份、氯化鈣120 140份、亞硝酸鈉130 150份、硫酸銨130 150份、微量元 素I 0. 5 2份、微量元素II 0. 5 2份和酵母膏或葡萄糖貯備液0. 5 2份。上述初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基中的微量元素I由下述各原料按重量份組成蒸 餾水1000000份、乙二胺四乙酸4000 6000份和硫酸亞鐵4000 6000份。上述初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基中的微量元素II由下述各原料按重量份組成 蒸餾水1000000份、乙二胺四乙酸14000 16000份、七水硫酸鋅200 400份、六水氯化 鈷200 300份、四水氯化錳900 1050份、五水硫酸銅200 300份、二水鉬酸鈉200 250份、六水氯化鎳180 200份、十水硒酸鈉200 220份和硼酸13 15份。上述初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基中的酵母膏或葡萄糖貯備液由下述各原料按重 量份組成蒸餾水1000000份、酵母膏或葡萄糖100 250份。復(fù)篩鑒定培養(yǎng)對(duì)所述初篩富集培養(yǎng)得到的初篩培養(yǎng)物進(jìn)行復(fù)篩鑒定培養(yǎng)，對(duì)復(fù) 篩鑒定培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，若檢測(cè)合格則培養(yǎng)物的菌株即為厭氧氨氧化菌。上述復(fù)篩鑒定培養(yǎng)具體過(guò)程為將初篩富集培養(yǎng)后得到的初篩培養(yǎng)物接入復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基中，采用厭氧滾管培養(yǎng) 法，在30 40°C溫度下厭氧培養(yǎng)3 5天，得到復(fù)篩培養(yǎng)物；檢測(cè)復(fù)篩培養(yǎng)物中菌株在厭氧條件下同時(shí)轉(zhuǎn)化氨和亞硝酸鹽的能力，若達(dá)到相應(yīng) 標(biāo)準(zhǔn)，則確認(rèn)復(fù)篩培養(yǎng)物中的菌株即為厭氧氨氧化菌。上述復(fù)篩鑒定培養(yǎng)中所用的復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基由下述原料按重量份組成蒸餾水 1000份、硫酸銨1 3份、亞硝酸鈉1 3份、牛肉膏2 5份、蛋白胨5 20份和氯化鈉 3 10份；該復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基的pH值為6. 7 8. 3。上述復(fù)篩鑒定培養(yǎng)中采用的厭氧滾管培養(yǎng)法具體為將裝有融化的復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基的試管放置于40 60°C的恒溫水浴中，用無(wú)菌注 射器吸取初篩培養(yǎng)物于所述試管內(nèi)融化的復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基中，而后將試管平放于裝有冰塊 的盤中或滾管機(jī)上進(jìn)行滾動(dòng)，使帶菌的融化的復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基在試管內(nèi)壁凝固形成薄層， 處理后將試管置于30 40°C的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
本發(fā)明實(shí)施例中通過(guò)，在初篩富集培養(yǎng)中，采用焦性沒(méi)食子酸法，通過(guò)焦性沒(méi)食子 酸和氫氧化鈉溶液反應(yīng)，可提高良好的厭氧環(huán)境，使裝有已接種菌懸液的初篩初篩厭氧氨 氧化富集培養(yǎng)基在密封的厭氧化環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)；而微量元素I和微量元素II的可提供厭 氧氨氧化菌必需的微量元素，利于厭氧氨氧化菌的生長(zhǎng)，并且能抑制其他厭氧菌的生長(zhǎng)。酵 母膏或葡萄糖貯備液提供厭氧氨氧化菌生長(zhǎng)所必需的碳源。該方法操作簡(jiǎn)單，成本低，對(duì)厭 氧氨氧化菌分離效果好。實(shí)施例2本實(shí)施例提供一種厭氧氨氧化菌的分離方法，相比現(xiàn)有通過(guò)密度梯度離心法分離 厭氧氨氧化菌具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，該方法具體如下步驟1，采集顆粒污泥為原料選取上流式厭氧污泥床(UASB)中的顆粒污泥溶液 作為分離源；步驟2，對(duì)采集的顆粒污泥原料進(jìn)行處理，用超聲波破碎顆粒污泥溶液，制成菌懸 液；步驟3，初篩富集培養(yǎng)將步驟2中制成的菌懸液轉(zhuǎn)入初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng) 基，可用涂布方式涂布在初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基上，酵母膏或葡萄糖貯備液0. 5mg/L 中，采用焦性沒(méi)食子酸法，在25 35°C溫度下厭氧培養(yǎng)10 15天，培養(yǎng)后得到初篩培養(yǎng) 物；上述步驟3中的初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基由下述原料組成蒸餾水，其它各 原料按每升蒸餾水的量進(jìn)行加入，包括KHCO3(碳酸氫鉀)400mg/L、KH2PO4(磷酸氫二 鈉)25mg/L、MgSO4 · 7H20 (七水硫酸鎂)200mg/L、CaCl2 (氯化鈣)120mg/L、NaNO2 (亞硝酸 鈉)130mg/L、(NH4)2S04(硫酸銨)130mg/L、微量元素 I 0. 5mg/L 和微量元素 II 0. 5mg/L ；上述初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基中的微量元素I由蒸餾水、EDTA(乙二胺四乙酸) 和FeSO4 (硫酸亞鐵)組成，其中，EDTA的用量為對(duì)應(yīng)每升蒸餾水加入4000mg、FeSO4的用 量為對(duì)應(yīng)每升蒸餾水加入4000mg ；微量元素II由蒸餾水、EDTA 14000mg/L、ZnSO4 · 7H20 200mg/L、CoCl2 · 6H20 200mg/L、MnCl2 · 4H20 900mg/L、CuSO4 · 5H20 200mg/L、Na2MoO4 · 2H20 200mg/L、NiCl2 · 6H20 180mg/L、Na2SeO4 · IOH2O 200mg/L 和 H3BO413mg/L 組成，其中各原料 的單位mg/L表示每升蒸餾水中加入該原料的量。上述步驟3的初篩富集培養(yǎng)中，采用的焦性沒(méi)食子酸法具體如下取一塊玻璃板或培養(yǎng)皿蓋，洗凈，干燥后滅菌，鋪上一薄層滅菌脫脂棉或紗布，將 Ig的焦性沒(méi)食子酸放在脫脂棉或紗布上；焦性沒(méi)食子酸(Pyrogallic Acid)，購(gòu)買自國(guó)藥 集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；滴加濃度為10%的NaOH溶液1. 5 2. 5ml于脫脂棉或紗布上的焦性沒(méi)食子酸上， 將溶液控制在脫脂棉或紗布內(nèi)，將玻璃板或培養(yǎng)皿蓋覆蓋于裝有已接種菌懸液的初篩厭氧 氨氧化富集培養(yǎng)基的玻璃平板或培養(yǎng)皿皿底覆蓋于上，并將脫脂棉或紗布全部罩住玻璃平 板或培養(yǎng)皿的皿口，并保證焦性沒(méi)食子酸反應(yīng)物不能與培養(yǎng)基表面接觸，用溶化的石蠟凡 士林液密封皿底與玻璃或皿蓋的接觸處，使已接種菌懸液的初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基在 密封的由焦性沒(méi)食子酸與NaOH溶液反應(yīng)形成的厭氧環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。步驟4，復(fù)篩鑒定培養(yǎng)將上述步驟3的初篩富集培養(yǎng)后得到的初篩培養(yǎng)物，接入 復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基，采用厭氧滾管培養(yǎng)法，在30 40°C溫度下厭氧培養(yǎng)3 5天；利用國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)培養(yǎng)物中氨和亞硝酸鹽的消失情況，檢測(cè)結(jié)果為氨消失了 90. 6%，亞硝酸鹽消失 了 89.7%，因此認(rèn)為該菌株為合格的厭氧氨氧化菌。上述步驟4中，所用的復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基由下述原料組成(NH4)2SO4 1. 4g、NaNO2 1. 4g、牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaC15g和蒸餾水1000ml，該復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基的pH值為6. 7
8.3 。上述步驟4中，采用的厭氧滾管培養(yǎng)法具體如下 將裝有融化的復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基的試管放置于40 60°C的恒溫水浴中，用Iml無(wú)菌 注射器吸取初篩培養(yǎng)物(菌懸液)0. Iml于融化的復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基試管中，而后將試管平放 于裝有冰塊的盤中或滾管機(jī)上迅速滾動(dòng)，使帶菌的融化培養(yǎng)基在試管內(nèi)壁立即凝固成一薄 層，處理后將試管置于30 40°C的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。為保證復(fù)篩效果，可在處理重 復(fù)上述處理進(jìn)行3次或5次，制成多個(gè)內(nèi)壁凝固成一薄層試管同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。本實(shí)施例的分離方法中以采集的顆粒污泥為原料，制成菌懸液后，依次經(jīng)初篩富 集培養(yǎng)和復(fù)篩鑒定培養(yǎng)后，即可分離得到厭氧氨氧化菌。該方法步驟簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)從顆粒污 泥快速分離厭氧氨氧化菌，具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例3本實(shí)施例提供一種厭氧氨氧化菌的分離方法，相比現(xiàn)有通過(guò)密度梯度離心法分離 厭氧氨氧化菌具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，該方法具體如下步驟1，采集顆粒污泥為原料選取上流式厭氧污泥床(UASB)中的顆粒污泥溶液 作為分離源；步驟2，對(duì)采集的原料進(jìn)行處理，用超聲波破碎顆粒污泥溶液，制成菌懸液；步驟3，初篩富集培養(yǎng)將步驟2中制成的菌懸液轉(zhuǎn)入初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng) 基、酵母膏或葡萄糖貯備液(酵母膏或葡萄糖200mg/L) lmg/L中，采用焦性沒(méi)食子酸法，在 25 35°C溫度下厭氧培養(yǎng)10 15天，培養(yǎng)后得到培養(yǎng)物；上述步驟3中的初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基由下述原料組成蒸餾水、KHCO3 500mg/L、KH2PO4 27mg/L、MgSO4 · 7H20 300mg/L、CaCl2 130mg/L、NaNO2 140mg/L、(NH4)2SO4 140mg/L、微量元素I lmg/L、微量元素II lmg/L，其中各原料的單位mg/L表示每升蒸餾水 中加入該原料的量；上述初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基中的微量元素I由蒸餾水、EDTA 5000mg/L和 FeSO4 5000mg/L 組成；微量元素 II 由蒸餾水、EDTA 15000mg/L、ZnSO4 · 7H20300mg/L、 CoCl2 · 6H20 250mg/L、MnCl2 · 4H20 1000mg/L、CuSO4 · 5H20250mg/L、Na2MoO4 · 2H20 220mg/ L、NiCl2 · 6H20 190mg/L、Na2SeO4 · 10H20210mg/L 和 H3BO4 14mg/L 組成，其中各原料的單位 mg/L表示每升蒸餾水中加入該原料的量。上述步驟3中采用的焦性沒(méi)食子酸法與實(shí)施例1或2的步驟3中采用的焦性沒(méi)食 子酸法基本相同在此不再重復(fù)說(shuō)明。步驟4、將上述步驟3的初篩富集培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)物接入復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基，采用 厭氧滾管培養(yǎng)法，在30 40°C溫度下厭氧培養(yǎng)3 5在，利用國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)培養(yǎng)后得到培 養(yǎng)物中氨和亞硝酸鹽的消失情況，結(jié)果為氨消失了 91.7%，亞硝酸鹽消失了 90.4%，因此 認(rèn)為該培養(yǎng)物的菌株為厭氧氨氧化菌。上述步驟4中的復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基由下述原料組成(NH4)2SO4 1. 4g、NaN02 1. 4g、牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaC15g和水1000ml，該復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基的pH值為6. 7 8. 3。上述步驟4中采用的厭氧滾管培養(yǎng)法與實(shí)施例1或2的步驟4中采用的厭氧滾管 培養(yǎng)法基本相同在此不再重復(fù)說(shuō)明。實(shí)施例4本實(shí)施例提供一種厭氧氨氧化菌的分離方法，相比現(xiàn)有通過(guò)密度梯度離心法分離 厭氧氨氧化菌具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，該方法具體如下步驟1，采集顆粒污泥為原料選取上流式厭氧污泥床(UASB)中的顆粒污泥溶液 作為分離源；步驟2，對(duì)采集的原料進(jìn)行處理，用超聲波破碎顆粒污泥溶液，制成菌懸液；步驟3，初篩富集培養(yǎng)將步驟2中制成的菌懸液轉(zhuǎn)入初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng) 基、酵母膏或葡萄糖貯備液(酵母膏或葡萄糖250mg/L)2mg/L)中，采用焦性沒(méi)食子酸法，在 25 35°C溫度下厭氧培養(yǎng)10 15天，培養(yǎng)后得到培養(yǎng)物；上述步驟3中的初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基由下述原料組成蒸餾水、KHCO3 600mg/L、KH2PO4 30mg/L、MgSO4 · 7H20 400mg/L、CaCl2 140mg/L、NaNO2 150mg/L、(NH4)2SO4 150mg/L、微量元素I 2mg/L、微量元素II 2mg/L，其中各原料的單位mg/L表示每升蒸餾水 中加入該原料的量；上述初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基中的微量元素I由蒸餾水、EDTA 6000mg/L和 FeSO4 6000mg/L組成，其中各原料的單位mg/L表示每升蒸餾水中加入該原料的量；微量元 素 II 由蒸餾水、EDTA 16000mg/L、ZnSO4 · 7H20 400mg/L、CoCl2 · 6H20300mg/L、MnCl2 · 4H20 1050mg/L、CuSO4 ·5Η20 300mg/L、Na2MoO4 ^H^SOmg/L,NiCl2 ·6Η20 200mg/L,Na2SeO4 ·IOH2O 220mg/L、H3B0415mg/L組成，其中各原料的單位mg/L表示每升蒸餾水中加入該原料的量。上述步驟3中采用的焦性沒(méi)食子酸法與實(shí)施例1或2的步驟3中采用的焦性沒(méi)食 子酸法基本相同在此不再重復(fù)說(shuō)明。步驟4，復(fù)篩鑒定培養(yǎng)將上述步驟3的初篩富集培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)物接入復(fù)篩鑒 定培養(yǎng)基，采用厭氧滾管培養(yǎng)法，在30 40°C溫度下厭氧培養(yǎng)3 5天，培養(yǎng)后利用國(guó)標(biāo)方 法檢測(cè)得到的培養(yǎng)物中氨和亞硝酸鹽的消失情況，結(jié)果為氨消失了 92. 5%，亞硝酸鹽消失 了 91.7%，因此認(rèn)為該培養(yǎng)物的菌株為厭氧氨氧化菌。上述步驟4中的復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基由下述原料組成(NH4)2SO4 1. 4g、NaN02 1. 4g、牛 肉膏3g、蛋白胨10g、NaC15g和水1000ml，該復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基的pH值為6. 7 8. 3。上述步驟4中采用的厭氧滾管培養(yǎng)法與實(shí)施例1或2的步驟4中采用的厭氧滾管 培養(yǎng)法基本相同在此不再重復(fù)說(shuō)明。對(duì)比實(shí)施例5本實(shí)施例為對(duì)比實(shí)施例，是通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)的密度梯度離心的方法分離得到厭氧氨 氧化菌，密度梯度離心分離法分離得到厭氧氨氧化菌的步驟如下(1)選取生物脫氮流化床反應(yīng)器中的活性污泥作為厭氧氨氧化菌的分離源；(2)以基本無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基作為富集基質(zhì)，采用分批培養(yǎng)的方式，培育厭氧氨氧化絮 體；(3)取厭氧氨氧化絮體，用超聲波破碎，離心去除細(xì)胞碎片，制成細(xì)胞懸液；(4)將細(xì)胞懸液與Percoll液混合，進(jìn)行密度梯度離心；離心后，出現(xiàn)紅色細(xì)胞帶并處于離心管的特定位置。該紅色細(xì)胞帶即為厭氧氨氧化菌；(5)用無(wú)菌吸管小心吸出離心管內(nèi)的紅色細(xì)胞帶，所分離的菌株純度可達(dá)每 200 800個(gè)細(xì)胞中只含一個(gè)污染細(xì)胞；(6)將分離菌株制成高細(xì)胞密度(高于IOw個(gè)/mL)的懸液，添加到厭氧氨氧化鑒 定培養(yǎng)基中，30 40°C厭氧培養(yǎng)3 5d ；利用國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)氨和亞硝酸鹽的消失情況，結(jié) 果為氨消失了 92.7%，亞硝酸鹽消失了 91.6%，因此認(rèn)為該菌株為厭氧氨氧化菌。通過(guò)將上述實(shí)施例1、2、3與實(shí)施例4對(duì)照相比可知，所得到的厭氧氨氧化菌株的 氨和亞硝酸鹽的消失情況相差不大，即認(rèn)為所得到的菌都是厭氧氨氧化菌。利用本發(fā)明實(shí) 施例分離厭氧氨氧化菌的優(yōu)點(diǎn)是(1)可以獲得厭氧氨氧化菌的純培養(yǎng)物，為微生物學(xué)理 論研究和工業(yè)化應(yīng)用提供幫助；(2)所得到的菌株便于保藏和運(yùn)輸。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換， 都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護(hù)范 圍為準(zhǔn)。
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權(quán)利要求
一種厭氧氨氧化菌的分離方法，其特征在于，包括采集原料采集顆粒污泥為原料，將所述顆粒污泥制成菌懸液；初篩富集培養(yǎng)對(duì)制成的所述菌懸液進(jìn)行初篩富集培養(yǎng)得到初篩培養(yǎng)物；復(fù)篩鑒定培養(yǎng)對(duì)所述初篩富集培養(yǎng)得到的初篩培養(yǎng)物進(jìn)行復(fù)篩鑒定培養(yǎng)，對(duì)復(fù)篩鑒定培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，若檢測(cè)合格則培養(yǎng)物的菌株即為厭氧氨氧化菌。
2.如權(quán)利要求1所述的厭氧氨氧化菌的分離方法，其特征在于，所述采集原料步驟中 采集顆粒污泥為原料中的顆粒污泥取自上流式厭氧污泥床中的顆粒污泥溶液；所述將所述 顆粒污泥制成菌懸液為用超聲波將顆粒污泥溶液中的顆粒污泥破碎后，制成菌懸液。
3.如權(quán)利要求1所述的厭氧氨氧化菌的分離方法，其特征在于，所述初篩富集培養(yǎng)步 驟中對(duì)制成的所述菌懸液進(jìn)行初篩富集培養(yǎng)得到初篩培養(yǎng)物包括將所述菌懸液轉(zhuǎn)入初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基中，采用焦性沒(méi)食子酸法，在25 35°C 溫度下厭氧培養(yǎng)10 15天，培養(yǎng)后得到初篩培養(yǎng)物。
4.如權(quán)利要求3所述的厭氧氨氧化菌的分離方法，其特征在于，所述初篩厭氧氨氧化 富集培養(yǎng)基由下述各原料按重量份組成蒸餾水1000000份、碳酸氫鉀400 600份、磷酸 氫二鈉25 30份、七水硫酸鎂200 400份、氯化鈣120 140份、亞硝酸鈉130 150 份、硫酸銨130 150份、微量元素I 0. 5 2份、微量元素II 0. 5 2份和酵母膏或葡萄 糖貯備液0.5 2份。
5.如權(quán)利要求4所述的厭氧氨氧化菌的分離方法，其特征在于，所述初篩厭氧氨氧化 富集培養(yǎng)基中的微量元素I由下述各原料按重量份組成蒸餾水1000000份、乙二胺四乙酸 4000 6000份和硫酸亞鐵4000 6000份。
6.如權(quán)利要求4所述的厭氧氨氧化菌的分離方法，其特征在于，所述初篩厭氧氨氧化 富集培養(yǎng)基中的微量元素II由下述各原料按重量份組成蒸餾水1000000份、乙二胺四 乙酸14000 16000份、七水硫酸鋅200 400份、六水氯化鈷200 300份、四水氯化錳 900 1050份、五水硫酸銅200 300份、二水鉬酸鈉200 250份、六水氯化鎳180 200 份、十水硒酸鈉200 220份和硼酸13 15份。
7.如權(quán)利要求3所述的厭氧氨氧化菌的分離方法，其特征在于，所述初篩厭氧氨氧化 富集培養(yǎng)基中的酵母膏或葡萄糖貯備液由下述各原料按重量份組成蒸餾水1000000份、 酵母膏或葡萄糖100 250份。
8.如權(quán)利要求3所述的厭氧氨氧化菌的分離方法，其特征在于，所述初篩富集培養(yǎng)步 驟中采用的焦性沒(méi)食子酸法為在干燥無(wú)菌的玻璃板或培養(yǎng)皿蓋上，鋪設(shè)一層滅菌脫脂棉或紗布，將焦性沒(méi)食子酸設(shè) 置在所述脫脂棉或紗布上；向所述焦性沒(méi)食子酸上滴加氫氧化鈉溶液后，將所述玻璃板或培養(yǎng)皿蓋覆蓋于裝有已 接種所述菌懸液的初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿的皿底上，使設(shè)有焦性沒(méi)食子酸和 氫氧化鈉溶液的所述脫脂棉或紗布全部罩住培養(yǎng)皿的皿口，以溶化的石蠟或凡士林液密封 培養(yǎng)皿的皿底與玻璃或皿蓋的接觸處，使所述菌懸液在密閉的由焦性沒(méi)食子酸與氫氧化鈉 溶液反應(yīng)形成的厭氧環(huán)境下在初篩厭氧氨氧化富集培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
9.如權(quán)利要求1所述的厭氧氨氧化菌的分離方法，其特征在于，所述復(fù)篩鑒定培養(yǎng)步 驟中對(duì)所述初篩富集培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物進(jìn)行復(fù)篩鑒定培養(yǎng)，對(duì)復(fù)篩鑒定培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，若檢測(cè)合格則培養(yǎng)物的菌株即為厭氧氨氧化菌包括將初篩富集培養(yǎng)后得到的初篩培養(yǎng)物接入復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基中，采用厭氧滾管培養(yǎng)法， 在30 40°C溫度下厭氧培養(yǎng)3 5天，得到復(fù)篩培養(yǎng)物；檢測(cè)復(fù)篩培養(yǎng)物中菌株在厭氧條件下同時(shí)轉(zhuǎn)化氨和亞硝酸鹽的能力，若達(dá)到相應(yīng)標(biāo) 準(zhǔn)，則確認(rèn)復(fù)篩培養(yǎng)物中的菌株即為厭氧氨氧化菌。
10.如權(quán)利要求9所述的厭氧氨氧化菌的分離方法，其特征在于，所述復(fù)篩鑒定培養(yǎng)步 驟中的復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基由下述原料按重量份組成蒸餾水1000份、硫酸銨1 3份、亞硝酸 鈉1 3份、牛肉膏2 5份、蛋白胨5 20份和氯化鈉3 10份；該復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基的 PH值為6. 7 8. 3。
11.如權(quán)利要求9所述的厭氧氨氧化菌的分離方法，其特征在于，所述復(fù)篩鑒定培養(yǎng)步 驟中采用的厭氧滾管培養(yǎng)法為將裝有融化的復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基的試管放置于40 60°C的恒溫水浴中，用無(wú)菌注射器 吸取初篩培養(yǎng)物于所述試管內(nèi)融化的復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基中，而后將試管平放于裝有冰塊的盤 中或滾管機(jī)上進(jìn)行滾動(dòng)，使帶菌的融化的復(fù)篩鑒定培養(yǎng)基在試管內(nèi)壁凝固形成薄層，處理 后將試管置于30 40°C的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種厭氧氨氧化菌的分離方法，該方法包括采集原料采集顆粒污泥為原料，將所述顆粒污泥制成菌懸液；初篩富集培養(yǎng)對(duì)制成的所述菌懸液進(jìn)行初篩富集培養(yǎng)得到初篩培養(yǎng)物；復(fù)篩鑒定培養(yǎng)對(duì)所述初篩富集培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物進(jìn)行復(fù)篩鑒定培養(yǎng)，對(duì)復(fù)篩鑒定培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，若檢測(cè)合格則培養(yǎng)物的菌株即為厭氧氨氧化菌。該分離方法不但具有簡(jiǎn)單、快速分離厭氧氨氧化菌的優(yōu)點(diǎn)，且可以獲得厭氧氨氧化菌的純培養(yǎng)物，為微生物學(xué)理論研究和工業(yè)化應(yīng)用提供幫助。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101886056SQ20101022473
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
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