專利名稱：一種細(xì)胞分選磁珠及合成方法以及其在細(xì)胞分選中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的細(xì)胞分選磁珠，包括該磁珠的合成和修飾方法，以及使用 該新型磁珠進(jìn)行細(xì)胞分選的方法，屬于材料科學(xué)和生物化學(xué)中的納米生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)胞分選是生物學(xué)和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中的常用技術(shù)，應(yīng)用磁珠分選細(xì)胞是這一領(lǐng)域中 常用的手段，在使用磁珠進(jìn)行細(xì)胞分選的方法中，關(guān)鍵技術(shù)為磁珠的合成。目前常用的商品 化微米級(jí)磁珠的蛋白偶聯(lián)量小，而納米級(jí)磁珠由于磁性小，不易被磁鐵分離，操作復(fù)雜，分 離成本高。針對(duì)上述問題，在細(xì)胞分選領(lǐng)域，提供一種蛋白偶聯(lián)量高、超順磁性、易于分離的 納米級(jí)磁珠，從而簡(jiǎn)化操作、降低成本，同時(shí)提供高細(xì)胞分選效率，在這一領(lǐng)域具有很大的
眉、ο

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供一種新型的細(xì)胞分選磁珠用于除去小鼠脾細(xì)胞中的 CD3 T細(xì)胞。本磁珠同時(shí)具有蛋白偶聯(lián)量高和超順磁性的優(yōu)點(diǎn)，分選后CD3 T細(xì)胞在脾細(xì)胞 中的含量由36. 5%降為0. 7%，分選效率極高。本磁珠還具有制備方法簡(jiǎn)單、環(huán)境友好、成 本低的優(yōu)點(diǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用于細(xì)胞陰性分選的磁珠，包括以下3個(gè)部分1、共沉淀法合成15nm Fe3O4納米顆粒，并用羥胺還原HAuCl4的方法，在Fe3O4表面 修飾一層金，合成50-70nm金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒(以下以Fe3O4OAu表示)；2、用16-巰基十六酸將Fe3O4OAu納米顆粒表面羧基化，通過共價(jià)偶聯(lián)的protein A，特異性吸附IgG型小鼠CD3抗體的Fc段，使其定向偶聯(lián)在磁珠上；3、應(yīng)用該磁珠除去小鼠脾細(xì)胞中的⑶3 T細(xì)胞的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案本發(fā)明提供的新型細(xì)胞分選磁珠，為表面上以共價(jià)鍵偶聯(lián)protein A，并通過 protein A與IgG的Fc段的特異性相互作用，定向偶聯(lián)IgG型小鼠⑶3抗體的50-70nm的 金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)。本發(fā)明涉及一種新型細(xì)胞分選磁珠，其特征在于50-70nm的金包裹Fe3O4磁性納 米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)表面上以共價(jià)鍵偶聯(lián)protein A，并進(jìn)一步通過protein A與 IgG的Fc段的特異性相互作用，定向偶聯(lián)IgG型小鼠CD3抗體。該磁珠上CD3抗體偶聯(lián)量 為 55-65 ( μ g CD3 抗體)/ (mg 磁珠)。本發(fā)明還涉及上述新型細(xì)胞分選磁珠的合成方法，該方法包括以下步驟(1)用 共沉淀法制備15nm Fe3O4納米顆粒，(2)用羥胺還原HAuCl4的方法，在前述Fe3O4納米顆粒 表面包裹一層金，制得50-70nm的金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)，(3)用 16-巰基十六酸將前述金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)表面羧基化，⑷將protein A以共價(jià)鍵偶聯(lián)在前述被表面羧基化的顆粒上，(5)使IgG型小鼠⑶3抗體通過Fc 段定向固定在前一步驟制得的偶聯(lián)有protein A的磁珠上。本發(fā)明還涉及新型細(xì)胞分選磁珠的合成方法，包括以下步驟(1)用共沉淀法制 備Fe3O4納米顆粒的步驟，具體為將摩爾比為2 1的FeCl3 · 6H20和FeCl2 · 4H20溶于 40mmol/L HCl水溶液，制成鐵鹽水溶液(Fe3+與Fe2+的濃度分別為0. 8mol/L和0. 4mol/L)， 在機(jī)械攪拌下，將制得的鐵鹽水溶液逐滴滴加至1. 5mol/L NaOH水溶液中，前述過程中控制 溫度保持在80°C，將制得的Fe3O4磁性納米顆粒用磁鐵分離、收集后用純凈水洗滌4次，再將 Fe3O4磁性納米顆粒分散于純凈水中，制成0. lmol/L的Fe3O4儲(chǔ)備液。本步驟中使用的鐵鹽 水溶液與NaOH水溶液之間的體積比為1 10。(2)用羥胺還原HAuCl4的方法，在前述Fe3O4納米顆粒表面包裹一層金，制得 50-70nm的金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)的步驟，具體為將前述 0. lmol/L的Fe3O4儲(chǔ)備液與0. 2mol/L的NH2OH 'HCl水溶液滴加至0. Olmol/LTMAOH水溶液 中，加熱至80°C，在充分?jǐn)嚢柘?，?. 1% (w/v)HAuCl4水溶液滴加至上述溶液中，然后在2 小時(shí)內(nèi)緩慢滴加15mmol/L檸檬酸鈉水溶液，滴加完成后繼續(xù)加熱攪拌3小時(shí)，該步驟中控 制溶液溫度保持在80°C;生成的金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)經(jīng)磁鐵分 離后，先后分別用純凈水和乙醇各洗滌2次，9，OOOrpm離心15分鐘，棄去洗滌液，在真空干 燥箱中60°C放置1-2小時(shí)烘干，得到金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)，本步 驟中使用的Fe3O4儲(chǔ)存液、NH2OH · HCl水溶液、HAuCl4水溶液、檸檬酸鈉水溶液之間的體積 比為 1 0. 3 15 8 20。(3)用16-巰基十六酸將前述金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)表 面羧基化的步驟具體為按重量(mg)體積(ml)為5 2的比例取Fe3O4OAu納米顆粒超 聲分散于20mmol/L 16-巰基十六酸的乙醇溶液中，超聲反應(yīng)48h ；反應(yīng)完畢后將磁珠溶液 用乙醇洗滌3次，9，OOOrpm離心15分鐘后，再分散至乙醇中，制成2mg/mL羧基化的磁珠分 散液。(4)將protein A以共價(jià)鍵偶聯(lián)在前述被表面羧基化的顆粒上的步驟，具體為 a.活化取前述羧基化的磁珠分散液，磁鐵分離后棄去乙醇，重新分散于含有EDC和NHS 的、濃度分別為20mg/mL和10mg/mL的水溶液中，超聲反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)過程中每隔5分鐘 將反應(yīng)液充分混勻一次，其中使用的磁珠分散液與含有EDC和NHS的水溶液兩者體積比 為1 2，b. protein A偶聯(lián)將活化后的磁珠用磁鐵分離后重新分散于含有150 μ g/mL protein A的PBS溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng)12-14小時(shí)。(5)使IgG型小鼠⑶3抗體的Fc段定向固定在前一步驟制得的偶聯(lián)有proteinA 的磁珠上的步驟，具體為將上一步驟獲得的偶聯(lián)有protein A的磁珠用磁鐵分離后分散 于含有100 μ g/mL小鼠⑶3抗體的PBS溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反 應(yīng)12-14小時(shí)，使⑶3抗體的Fc段定向固定在偶聯(lián)有proteinA的磁珠上。本發(fā)明涉及的細(xì)胞分選磁珠的合成方法還包括將使用前述方法制得的該磁珠上 未反應(yīng)的活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉的步驟。其方法為將固定有CD3抗體的Fc段的磁珠分散于細(xì) 胞分選緩沖溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng)12-14小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案之四，本發(fā)明還涉及上述細(xì)胞分選磁珠的用途，以除去小 鼠脾細(xì)胞中的⑶3 T細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及一種小鼠脾細(xì)胞分選方法，該方法為使用本發(fā)明合成的磁珠進(jìn)行小 鼠脾細(xì)胞分選。


圖1 (a)為在Fe3O4納米顆粒上包裹金形成Fe3O4OAu納米顆粒的流程；圖1 (b) Fe3O4OAu納米顆粒被在磁場(chǎng)中被分離；圖2為透射電子顯微鏡結(jié)果(a) Fe3O4納米顆粒；(b) Fe3O4OAu納米顆粒。圖3為X射線衍射圖譜(a) Fe3O4納米顆粒；(b) Fe3O4OAu納米顆粒。圖4為聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果1.純化后的⑶3抗體；2. BSA ；3. Marker.圖5為純化后的⑶3抗體刺激小鼠T淋巴細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6為小鼠⑶3抗體在磁珠上的定向偶聯(lián)流程圖。圖7為小鼠脾細(xì)胞經(jīng)磁珠分選前和分選后的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明使用的實(shí)驗(yàn)試劑與原料為16-巰基十六酸(16-Mercaptohexadecanoic acid 90 %, 448303) > proteinA(P3838)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。1_乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽 酸鹽(EDC HCl 98+%，5002E19M)、N-羥基琥玻酰亞胺(NHS 98+%，10130571)購(gòu)自 Alfa Aesar公司。FeCl3 6H20購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。FeCl2 4H20購(gòu)自廣東.汕頭市 西隴化工廠。鹽酸羥胺(NH2OH HCl)購(gòu)自北京化工廠。檸檬酸鈉.2H20、四甲基氫氧化胺 (TMAOH) 10% (w/v)水溶液購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。HAuCl4 4H20購(gòu)自沈陽有色金屬研究院。 抗小鼠CD3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。若無特 別說明，在實(shí)驗(yàn)過程中使用的純凈水均由Milli-Q水純化系統(tǒng)(Millipore公司，Molsheim 市，法國(guó))制備而成。其余未提到的試劑均為分析純，并且使用前無需進(jìn)一步的純化。IOmM磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7. 4)的配制方法將8. Og NaCl,2. 9gNa2HP04 · 12H20、 0. 2g KH2PO4和0. 2g KCl溶于IL純凈水。細(xì)胞分選緩沖溶液為含有0. 1 % (w/v)BSA和 0. 05% (ν/ν)吐溫 20 的 PBS 溶液。本發(fā)明采用的實(shí)驗(yàn)儀器為Avanti J-25離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。JEM-200CX型透射電子顯 微鏡(TEM)購(gòu)自日本JEOL公司。D/MAX-2400型X射線衍射儀(XRD)購(gòu)自日本理學(xué)株式會(huì) 社。NU-5500E型細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)NUAIR公司。凝膠電泳儀(Mini PROTEAN 3 Cell型 電泳槽、Power Pac Universal 500V/2. 5A/500W 電源)購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司。CARYlE 型 紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自澳大利亞Varian公司。FACS Calibur 101型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美 國(guó)BD公司。QB-206型多用途旋轉(zhuǎn)搖床購(gòu)自海門市其林貝爾儀器制造有限公司。透析袋由 華美科技有限公司提供(北京，中國(guó))。釹鐵硼強(qiáng)磁鐵的大小為40*15*5mm。TomTec公司 96孔細(xì)胞收集儀。EG&G公司β-counter。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所 用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1 :Fe304@Au納米顆粒的制備與表征
1、Fe3O4 (15nm)納米顆粒的制備a. 5. 2g FeCl3 6H20，2. Og FeCl2 4H20 溶于 40mmol/L HCl 水溶液，制成鐵鹽溶液；b.在充分的機(jī)械攪拌下，將制得的鐵鹽溶液逐滴滴加至250mL 1. 5mol/L NaOH水 溶液中，整個(gè)過程中溫度保持在80°C ；c.制得的Fe3O4納米顆粒被磁鐵分離，收集后用200mL純凈水洗滌4次，分散于 IOOmL純凈水中，制成0. lmol/L的Fe3O4儲(chǔ)存液。2、Fe3O4OAu (50_70nm)納米顆粒的制備(圖 1)a. 5mL 0. lmol/L 的 Fe3O4 儲(chǔ)存液與 1. 5mL 0. 2mol/L 的 NH2OH HCl 水溶液滴加至 75mL 0. 01mol/L TMAOH 水溶液中，加熱至 80°C ；b.在充分?jǐn)嚢柘拢?0mL 0. 1% (w/v) HAuCl4水溶液滴加至上述溶液中，然后在2h 內(nèi)緩慢滴加IOOmL 15mmol/L檸檬酸鈉水溶液，滴加完成后繼續(xù)加熱攪拌3h。該步驟中溶液 溫度保持在80°C ；c.生成的Fe3O4OAu經(jīng)磁鐵分離后，用50mL純凈水洗滌2次，50mL乙醇洗滌2次， 9，OOOrpm離心15min，棄去洗滌液，在真空干燥箱中60°C放置l_2h烘干。3、Fe3O4OAu (50_70nm)納米顆粒的表征Fe3O4與Fe3O4OAu納米顆粒的TEM表征如圖2所示，F(xiàn)e3O4納米顆粒約為15nm，經(jīng)金 包裹后，F(xiàn)e3O4OAu納米顆粒約為50-70nm。Fe3O4與Fe3O4OAu納米顆粒的XRD表征如圖3所 示，在金包裹后b圖中出現(xiàn)了 Au的三個(gè)特征衍射峰(111)、(200)和(220)，證明Au在Fe3O4 外的包裹成功。實(shí)施例2 小鼠CD3單克隆抗體的制備與純化1、小鼠⑶3單克隆抗體的制備a.將抗小鼠CD3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件37°C和 5% CO2，每隔2天換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞濃度大于IO5個(gè)/孔時(shí)停止換液；b.在抗體大量制備前幾天，向健康Balb/c小鼠腹腔中注入石蠟油。將一定數(shù)量的 單克隆細(xì)胞用無菌PBS溶液吹下，1，OOOrpm以下離心3_5min，細(xì)胞沉淀重懸于0. 5mL PBS 中，注入小鼠腹腔內(nèi)；c.單克隆細(xì)胞注入小鼠7-10天后，小鼠腹部可見明顯脹大，取其腹水。用左手固 定小鼠，用75%酒精消毒其腹部，再于小鼠下方放置一支試管，將滅菌的16號(hào)注射針頭刺 入小鼠下腹部，讓腹水滴入試管內(nèi)，當(dāng)腹水停滴時(shí)，輕輕移動(dòng)針頭，并輕柔其腹部，使腹水繼 續(xù)滴出。一次可得到約l_3mL腹水。1，OOOrpm離心5min，吸取上層透明清液，凍于_20°C。2、小鼠⑶3單克隆抗體的純化a.制得的腹水從-20°C冰箱中取出后置于4°C冰箱使其融化，用等體積的IOmMpH 7. 4PBS溶液稀釋。向腹水稀釋液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨(50%飽和度)，置于4°C 冰箱中過夜。將腹水稀釋液11，OOOrpm離心，棄上清，用等體積的PBS溶液溶解沉淀；b.將硫酸銨飽和度變?yōu)?3%重復(fù)上述沉淀-溶解步驟2次，11，OOOrpm離心，棄去 上清。沉淀用適量PBS溶解，置于PBS溶液中透析過夜；c.純化得到的抗體經(jīng)SDS-PAGE分析，抗體純度在85%以上(圖4)。3、⑶3抗體對(duì)T淋巴細(xì)胞的刺激活性測(cè)試a.將Balb/c小鼠脾細(xì)胞中分選出T淋巴細(xì)胞，以4X IO5/孔的細(xì)胞數(shù)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)96小時(shí)，同時(shí)加入lyg/ml的⑶3抗體，設(shè)置不加抗 體的孔作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各設(shè)三個(gè)平行孔。b.終止培養(yǎng)前8小時(shí)每孔加入0. 2 μ Ci 3H-TdR0用96孔板細(xì)胞收集儀將細(xì)胞收 集于玻璃纖維素濾紙上，測(cè)定放射活度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。實(shí)施例3 小鼠⑶3抗體在磁珠上的定向偶聯(lián)(圖6)1、Fe3O4OAu納米顆粒的表面羧基化a.稱取25mg Fe3O4OAu納米顆粒超聲分散于IOmL含有20mmol/L 16-巰基十六酸 的乙醇溶液中，超聲反應(yīng)48h ；b.反應(yīng)完畢后將磁珠溶液用乙醇洗滌3次，9，OOOrpm離心15min，重新分散至 12. 5mL乙醇中，制成2mg/mL羧基化的磁珠分散液。2、⑶3抗體在磁珠上的偶聯(lián)a.取500 μ L 2mg/mL羧基化的磁珠分散液，磁鐵分離后棄去乙醇，重新分散于ImL 含有20mg/mL EDC和10mg/mL NHS的水溶液中，超聲反應(yīng)lh，反應(yīng)過程中每隔5min將反應(yīng) 液充分混勻一次；b.將活化后的磁珠用磁鐵分離后重新分散于ImL含有150 μ g/mL protein A的 PBS溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng)過夜。proteinA上的氨基與磁珠 上活化的羧基反應(yīng)生成肽鍵，使protein A以共價(jià)鍵偶聯(lián)在磁珠上；c.將偶聯(lián)有protein A的磁珠用磁鐵分離后重新分散于ImL含有100 μ g/mL⑶3 抗體的PBS溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng)過夜，使⑶3抗體的Fc段 定向固定在偶聯(lián)有protein A的磁珠上；d.將定向偶聯(lián)有CD3抗體的磁珠用磁鐵分離，取清液用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋 白濃度，測(cè)得CD3抗體的偶聯(lián)量為60 士 5(yg CD3抗體)/ (mg磁珠)。將分離出的磁珠重新 分散于ImL細(xì)胞分選緩沖溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng)過夜，封閉 磁珠上未反應(yīng)的活性位點(diǎn)；e.反應(yīng)完畢后用ImL細(xì)胞分選緩沖溶液，洗滌磁珠兩次，分散于ImL細(xì)胞分選緩沖 溶液中，分裝后置于-20°C冰箱中保存。實(shí)施例4 小鼠脾細(xì)胞的磁性分選1、將2 X IO6個(gè)小鼠脾細(xì)胞收集于EP管中，3，OOOrpm離心3min，用細(xì)胞分選緩沖 溶液洗滌一次。加入400 μ L的⑶3磁珠，將細(xì)胞重懸，室溫孵育30min ；2、將EP管置于磁場(chǎng)中l(wèi)Omin，吸出不含磁珠的細(xì)胞清液。將分選后的細(xì)胞溶液離 心，棄去上清，加入100 μ L⑶3-ΡΕ抗體染色，室溫孵育15min，同時(shí)設(shè)置未分選的脾細(xì)胞作 為對(duì)照；3、用細(xì)胞分選緩沖溶液洗滌細(xì)胞2次，由流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞組成，結(jié)果如圖7所 示，分選后⑶3 T細(xì)胞在脾細(xì)胞中的含量由36. 5%降為0.7%。盡管上面的描述及圖1-7以及公開了本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例，但是，可以設(shè)想，本領(lǐng) 域的技術(shù)人員可在所附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)設(shè)計(jì)對(duì)本發(fā)明的各種修改，上述內(nèi)容均應(yīng) 落入本專利保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種用于細(xì)胞陰性分選的磁珠，其特征在于該磁珠為表面上以共價(jià)鍵偶聯(lián)protein A，并通過protein A與IgG的Fc段的特異性相互作用，定向偶聯(lián)IgG型小鼠CD3抗體的50 70nm的金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4@Au納米顆粒)。
2.如權(quán)利要求1所述的磁珠，其特征在于CD3抗體在該磁珠上的偶聯(lián)方式為定向偶聯(lián)， 且偶聯(lián)量為(55-65 μ gCD3抗體)/ (mg磁珠)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用于細(xì)胞陰性分選的磁珠的合成方法，其特征在于包括以 下步驟(1)用共沉淀法制備15nmFe3O4納米顆粒；(2)用羥胺還原HAuCl4的方法，在前述Fe3O4納米顆粒表面包裹一層金，制得50-70nm 的金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)；(3)用16-巰基十六酸將前述金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)表面羧 基化；(4)將proteinA以共價(jià)鍵偶聯(lián)在前述被表面羧基化的顆粒上；(5)使IgG型小鼠⑶3抗體通過Fc段定向固定在前一步驟制得的偶聯(lián)有proteinA的 磁珠上；(6)將使用前述方法制得的磁珠上未反應(yīng)的活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)為將摩爾比為2 1的FeCl3 ·6Η20和FeCl2 ·4Η20溶于40mmol/LHCl 水溶液，制成鐵鹽水溶液，在機(jī)械攪拌下，將制得的鐵鹽溶液逐滴滴加至1. 5mol/L NaOH水 溶液中，前述過程中控制溫度保持在80°C，將制得的Fe3O4磁性納米顆粒用磁鐵分離、收集 后用純凈水洗滌4次，再將Fe3O4磁性納米顆粒分散于純凈水中，制成0. lmol/L的Fe3O4儲(chǔ) 備液，本步驟中使用的Fe3+、Fe2+與NaOH之間的摩爾比為2 1 37. 5 ；所述的步驟⑵為將前一步驟中制得的0. lmol/L的Fe3O4儲(chǔ)備液與0. 2mol/L的 NH2OH -HCl水溶液滴加至0. Olmol/L TMAOH水溶液中，加熱至80°C，在充分?jǐn)嚢柘?，?. 1 % (w/v)HAuCl4水溶液滴加至上述溶液中，然后在2小時(shí)內(nèi)緩慢滴加15mmol/L檸檬酸鈉水溶 液，滴加完成后繼續(xù)加熱攪拌3小時(shí)，該步驟中控制溶液溫度保持在80°C ；生成的金包裹 Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)經(jīng)磁鐵分離后，先后分別用純凈水和乙醇各洗滌 2次，9，OOOrpm離心15分鐘，棄去洗滌液，在真空干燥箱中60°C放置1_2小時(shí)烘干，得到金 包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)，本步驟中使用的Fe3O4儲(chǔ)備液、NH2OH · HCl 水溶液、HAuCl4水溶液、檸檬酸鈉水溶液之間的體積比為1 0. 3 15 8 20, Fe3O4, NH2OH · HCl、TMA0H、HAuCl4 和檸檬酸鈉之間的摩爾比為 5 3 7. 5 1. 2 15 ；所述的步驟(3)為按重量(mg)體積(ml)為5 2的比例取Fe3O4OAu納米顆粒超 聲分散于20mmol/L 16-巰基十六酸的乙醇溶液中，超聲反應(yīng)48h ；反應(yīng)完畢后將磁珠溶液 用乙醇洗滌3次，9，OOOrpm離心15分鐘后，再分散至乙醇中，制成2mg/mL羧基化的磁珠分 散液；所述的步驟(4)為，a.活化取前述羧基化的磁珠分散液，磁鐵分離后棄去乙醇，重新 分散于含有EDC和NHS的、濃度分別為20mg/mL和10mg/mL的水溶液中，超聲反應(yīng)1小時(shí)， 反應(yīng)過程中每隔5分鐘將反應(yīng)液充分混勻一次，其中使用的磁珠分散液與含有EDC和NHS 的水溶液兩者體積比為1 2，b.proteinA偶聯(lián)將活化后的磁珠用磁鐵分離后重新分散于含有150yg/mL protein A的PBS溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng) 12-14小時(shí)；所述的步驟(5)為，將上一步驟獲得的偶聯(lián)有protein A的磁珠用磁鐵分離后分散于 含有100μ g/mL小鼠⑶3抗體的PBS溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng) 12-14小時(shí)，使⑶3抗體通過Fc段定向固定在偶聯(lián)有protein A的磁珠上。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中還包括將制得的該磁珠上未反應(yīng)的活性位點(diǎn)進(jìn)行封 閉的步驟。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的封閉步驟為將固定有CD3抗體的Fc段的磁珠 分散于細(xì)胞分選緩沖溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng)12-14小時(shí)。
7.如權(quán)利要求1-2所述的磁珠在分選小鼠脾細(xì)胞中的用途。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的分選為除去小鼠脾細(xì)胞中的CD3T細(xì)胞。
9.一種小鼠脾細(xì)胞分選方法，其特征在于使用權(quán)利要求1或2所述的磁珠進(jìn)行分選。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型細(xì)胞分選磁珠，該磁珠為表面上以共價(jià)鍵偶聯(lián)proteinA，并通過protein A與IgG的Fc段的特異性相互作用，定向偶聯(lián)IgG型小鼠CD3抗體的50-70nm金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4@Au納米顆粒)。本發(fā)明涉及該磁珠的合成和修飾方法，以及使用該磁珠進(jìn)行細(xì)胞分選的方法。本發(fā)明磁珠用于除去小鼠脾細(xì)胞中的CD3 T細(xì)胞，使CD3 T細(xì)胞在脾細(xì)胞中的含量由36.5％降為0.7％，分選效率極高。本磁珠還同時(shí)具有蛋白偶聯(lián)量高和超順磁性的優(yōu)點(diǎn)，而且制備方法簡(jiǎn)單，環(huán)境友好，成本較低，具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N5/078GK101892196SQ201010226278
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者崔毅然, 張新祥, 洪超, 高曉明 申請(qǐng)人:北京大學(xué)