專利名稱：真菌的菌落pcr方法和鑒別病原性真菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌的菌落PCR方法和鑒別病原性真菌的方法。
背景技術(shù)：
目前，淺部真菌感染仍在人群中保持著很高的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率，其中頭癬、甲真菌 病、皮膚癬菌肉芽腫、復(fù)發(fā)性念珠菌性陰道炎等還存在著診斷和治療方面的難題。而由于 免疫受損人群的不斷擴(kuò)大，深部真菌感染的發(fā)病率更是逐年快速增加，且往往威脅著所感 染宿主的生命，其救治的成功率取決于能否早期診斷和針對(duì)病原菌的治療。引起各種真菌 感染的病原菌多達(dá)300余種，其中常見(jiàn)的亦多達(dá)50余種。不同的真菌種屬對(duì)不同抗真菌 藥物的敏感性有較大差異，如白念珠菌、煙曲霉雖依然是深部真菌感染的主要病原菌，但隨 著預(yù)防性抗真菌治療的增多和病原菌種的遷移變化，很多對(duì)臨床常規(guī)用藥不敏感甚至耐 藥的病原菌明顯增加，呈現(xiàn)非白念珠菌(如近平滑念珠菌)、非煙曲曲霉(如土曲霉等) 以及非曲霉絲狀真菌(如鐮刀霉等)感染比例逐漸增加的特點(diǎn)[Arendrup MC. Invasive fungal infections :past achievements and challenges ahead. Clin Microbiol Infect, 2009,15 (7) :599_601.]。由于深部真菌感染在臨床早期沒(méi)有特征性的表現(xiàn)，病原 學(xué)診斷存在很大困難，以至深部真菌感染的死亡率高達(dá)70% 90% [McCoy D，Depestel DD, Carver PL. Primary antifungal prophylaxis in adult hematopoietic stem cell transplant recipients -current therapeutic concepts. Pharmacotherapy,2009, 29(11) :1306-1325.]。目前臨床上對(duì)真菌感染的診斷主要依靠病原菌形態(tài)學(xué)、血清學(xué)和組 織病理學(xué)等方法，包括直接鏡檢、真菌培養(yǎng)、小培養(yǎng)、半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)(GM試驗(yàn))等， 有耗時(shí)長(zhǎng)、敏感性低及難以鑒定到菌種等弊端，難以在發(fā)病早期檢測(cè)并鑒別病原菌。現(xiàn)階段分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，鑒別菌種的分子診斷技術(shù)層出不窮，憑借快速、 特異、敏感的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越多地被應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)的各個(gè)領(lǐng)域。但這些技術(shù)都是以菌種模板 DNA的成功提取為基礎(chǔ)的。常規(guī)PCR擴(kuò)增前的真菌DNA制備需要經(jīng)過(guò)破壁、抽提、沉淀、純化 等步驟，常用的方法有CTAB法、液氮法等，DNA提取時(shí)間由2小時(shí)到6小時(shí)不等，操作繁瑣， 有時(shí)需要昂貴的試劑和一些特殊處理，有些試劑本身，如酚、氯仿等不利于操作者的身體健 康，并有可能會(huì)有菌體色素等雜質(zhì)的殘留，會(huì)影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增等分子實(shí)驗(yàn)[Fredricks DN, Smith C, Meier A. Comparison of Six DNA Extraction Methods for Recovery of Fungal DNA as Assessed by Quantitative PCR[J], J Clin Microbiol,2005,43(10) 5122-5128.]。臨床常見(jiàn)的標(biāo)本有血清(漿)、全血、分泌物、膿液、體液、新鮮組織等，在這些標(biāo) 本中有人體細(xì)胞或粘蛋白、雜質(zhì)的混合，提取DNA時(shí)需要預(yù)處理，處理不充分或不恰當(dāng)，不 只會(huì)殘留PCR反應(yīng)抑制物，還會(huì)造成真菌模板DNA的流失，使本來(lái)就含量甚微的DNA更加 少，常規(guī)PCR可能檢測(cè)不到，極易得到假陰性的結(jié)果[Bretagne S, Costa JM. Towards a molecular diagnosis of invasive aspergillosis and disseminated candidosis[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2005,45 (3) :361_318.]?，F(xiàn)在我國(guó)臨床檢驗(yàn)科室極少使用直接從臨床標(biāo)本提取DNA的方法，正是由于該方法較難操作，實(shí)現(xiàn)這個(gè)跨越可能還會(huì)需要 一段時(shí)間。菌落PCR(Colony PCR)技術(shù)最早見(jiàn)于 D. Gussow 和 T. Clackson 的文章[Gussow D, Clackson T.Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction [J]. Nucleic Acids Res，1989，17 (10) :4000.]，是指以培養(yǎng)基 上生長(zhǎng)的菌落為目標(biāo)，經(jīng)簡(jiǎn)單的煮沸和冷凍等物理方法，可不必提取基因組DNA，直接以菌 體熱解后暴露的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，省去了繁瑣的提取DNA過(guò)程，節(jié)省了時(shí)間，通常 利用此方法進(jìn)行重組體的篩選或者DNA測(cè)序分析。但由于本方法只用熱裂解的方式破壞菌 體，以往最常用于細(xì)菌，而真菌細(xì)胞外層有較厚的細(xì)胞壁，由骨架(不溶性多糖晶體組成的 微細(xì)纖維)和基質(zhì)(高分子復(fù)合物)構(gòu)成，結(jié)構(gòu)非常致密，單純用熱力裂解細(xì)胞較難，所以 罕見(jiàn)有用菌落PCR技術(shù)進(jìn)行真菌學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)研究，僅見(jiàn)到有零星的有關(guān)酵母菌方面的應(yīng) 用，未見(jiàn)到用于絲狀真菌的研究報(bào)告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種真菌的菌落PCR方法，擴(kuò)增的陽(yáng)性率高。本發(fā)明還提供了鑒別病原性真菌的方法，采用上述真菌的菌落PCR方法，檢測(cè)時(shí) 間短、結(jié)果可靠。所述真菌的菌落PCR方法為，將真菌培養(yǎng)物接種于培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基上 剛長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落，作為實(shí)驗(yàn)可用菌落，制備DNA模板，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。所述鑒別病原性真菌的方法，將臨床標(biāo)本或病原性真菌培養(yǎng)物接種于培養(yǎng)基上， 進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基上剛長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落，作為實(shí)驗(yàn)可用菌落，制備DNA模板，進(jìn)行菌落 PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度，為公知常識(shí)，一股采用PDA培養(yǎng)基，在28°C下培養(yǎng)。菌落PCR的反應(yīng)體系與普通的PCR體系相同，包含4iil 10X緩沖液，1.5iil MgCl2溶液，2iil dNTP溶液，上、下游引物各0. 5iil，DNA模板(0. 5 2) yl，Taq DNA聚合 酶2U，其中MgCl2溶液、dNTP溶液、引物的濃度分別為10mmol/L、10 u mol/L、10 u mol/L。DNA模板的制備方法為當(dāng)真菌為絲狀真菌時(shí)，制備DNA模板的方法為在20 yl無(wú)菌IX TE緩沖液中加入 高壓滅菌的石英砂，加入實(shí)驗(yàn)可用菌落菌絲體，煮沸5min，然后立即冷凍5 lOmin，反復(fù)2 次，然后渦旋3 5min，12000 14000r/min離心5 lOmin，取上清液作為DNA模板；當(dāng) 真菌為酵母菌時(shí)，制備DNA模板的方法為在20 yl無(wú)菌IX TE緩沖液加入實(shí)驗(yàn)可用菌落菌 體，煮沸3min，然后立即冷凍5 lOmin, 12000 14000r/min離心5 lOmin，取上清液作 為DNA模板。作為本領(lǐng)域公知常識(shí)，冷凍溫度為-15 -20°C。作為優(yōu)選方案，當(dāng)真菌為絲狀真菌時(shí)，制備DNA模板的方法為在20 yl無(wú)菌 1 X TE緩沖液中加入高壓滅菌的石英砂，加入少量實(shí)驗(yàn)可用菌落菌絲體，煮沸5min，然后立 即置于_20°C下冷凍5min，反復(fù)2次，然后渦旋5min，14000r/min離心5min，取上清液作為 DNA模板；當(dāng)真菌為酵母菌時(shí)，制備DNA模板的方法為在20iU無(wú)菌IX TE緩沖液加入少 量實(shí)驗(yàn)可用菌落菌體，煮沸3min，然后立即置于-20°C下冷凍5min，14000r/min離心5min，取上清液作為DNA模板。具體的操作步驟如下絲狀真菌準(zhǔn)備0. 2ml的無(wú)菌PCR管，加入少量高壓滅菌的 石英砂，加入20 yl無(wú)菌IX TE緩沖液，備用。用取菌針刮取少量菌絲體，加入準(zhǔn)備好的PCR 管中，標(biāo)記，蓋緊，煮沸，然后立即置于冰箱中進(jìn)行冷凍，反復(fù)2次，放于渦旋器渦旋。然后離 心，取上清液作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。其中，石英砂的用量一股為40-60 yg。酵母樣 菌準(zhǔn)備0. 2ml的無(wú)菌PCR管，加入20 yl無(wú)菌1 X TE緩沖液，備用。用取菌環(huán)刮取少量菌 體，加入準(zhǔn)備好的PCR管中，標(biāo)記，蓋緊。煮沸，然后立即置于冰箱中冷凍，離心后，取上清液 llil作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。真菌細(xì)胞外層有較厚的細(xì)胞壁，有保護(hù)菌體的作用。細(xì)胞壁的主要成分是多糖，組 成細(xì)胞壁的骨架(不溶性多糖晶體組成的微細(xì)纖維)和基質(zhì)(高分子復(fù)合物)，結(jié)構(gòu)非常 致密。而組成微細(xì)纖維的骨架中，絲狀真菌以幾丁質(zhì)為主，酵母菌以葡聚糖為主。一種真菌 的細(xì)胞壁組分并不是固定的，在其不同生長(zhǎng)階段，細(xì)胞壁的成分有明顯不同[Griffin Dff, Kellogg CA, Peak KK, et al. A rapid and efficient assay for extracting DNA from fungi [J], Lett Appl Microbiol, 2002, 34(3) :210_214.]。在菌種生長(zhǎng)早期，真菌細(xì)胞壁主 要由幾丁質(zhì)層和蛋白質(zhì)層兩層構(gòu)成，在菌種生長(zhǎng)成熟期則由幾丁質(zhì)層、蛋白質(zhì)層、葡聚糖蛋 白層和質(zhì)層葡聚糖層四層構(gòu)成。申請(qǐng)人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在絲狀真菌生長(zhǎng)早期進(jìn)行DNA模板制 備，能夠成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用生長(zhǎng)成熟的菌落制備模板則不能，所以選擇生長(zhǎng)早期的菌落 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)是本發(fā)明菌落PCR實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵所在。選擇早期菌落有如下優(yōu)點(diǎn)制備的DNA與成熟菌落提取的DNA完全一致，且減少了 黑色素等雜質(zhì)的混合，提高了 PCR擴(kuò)增的陽(yáng)性率，最重要的是臨床應(yīng)用時(shí)縮短診斷時(shí)間，為 臨床治療贏得時(shí)間。在所有的菌落PCR反應(yīng)中，申請(qǐng)人都設(shè)置了陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，由于菌落PCR的 特異性較普通PCR差，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照非常有必要，可以減少假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果， 以免混淆檢測(cè)者對(duì)結(jié)果的分析。另外，經(jīng)過(guò)煮沸、凍解后暴露出來(lái)的DNA要及時(shí)地進(jìn)行PCR 反應(yīng)，不能放置太久，否則擴(kuò)增的效果變差。本發(fā)明提高了真菌菌落PCR擴(kuò)增的陽(yáng)性率，解決了真菌基因組DNA提取步驟繁 瑣、破壁難、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，并在病原菌生長(zhǎng)最初期即可進(jìn)行菌種鑒定，較常規(guī)真菌表型 鑒定時(shí)間明顯縮短，且結(jié)果可靠，其臨床意義和價(jià)值在于明顯縮短了確認(rèn)菌種、確認(rèn)診斷 的時(shí)間，而有研究顯示深部真菌感染，治療時(shí)間相差48小時(shí)就會(huì)導(dǎo)致死亡率的顯著差異 [Nolla-Salas J, Sitges-Serra A, Leon-Gil C, et al. Candidemia in non-neutropenic critically ill patients analysis of prognostic factors and assessment of systemic antifungal therapy. Study Group of Fungal Infection in the ICU[J]. Intensive Care Med,1997,23(1) :23_30.]。


圖1為16株菌種菌落PCR電泳結(jié)果M :100bp Ladder ；1 陰性對(duì)照；2 陽(yáng)性對(duì)照 (煙曲霉)3 煙曲霉；4 黃曲霉；5 土曲霉；6 黑曲霉；7 雜色曲霉；8 尖端賽多孢；9 串 珠鐮刀菌；10 尖孢鐮刀菌；11 藍(lán)色犁頭霉；12 多變根毛霉；13 傘枝犁頭霉；14 凍土毛 霉；15 微小毛霉；16 指狀青霉；17 擴(kuò)展青霉；18 繩狀青霉。
圖2為菌落PCR與常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖M :100bp Ladder ；1 陰性對(duì)照；2 陽(yáng) 性對(duì)照(煙曲霉)3、5、7、9、11、13、15為常規(guī)PCR結(jié)果；4、6、8、10、12、14、16為菌落PCR結(jié) 果；3、4為煙曲霉；5、6為黃曲霉；7、8為土曲霉；9,10為黑曲霉；11、12為雜色曲霉；13,14 為尖端賽多孢；15、16為串珠鐮刀菌。圖3為應(yīng)用實(shí)施例1的菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果M :50bp標(biāo)準(zhǔn)參照物；1 陰性對(duì)照；2 陽(yáng) 性對(duì)照(煙曲霉)；3 酵母菌落；4 絲狀菌落。圖4為應(yīng)用實(shí)施例2標(biāo)準(zhǔn)菌株多重PCR電泳圖M :50bp標(biāo)準(zhǔn)參照物；1 陰性對(duì)照； 2 煙曲霉；3 紅色毛癬菌；4 近平滑念珠菌。圖5為應(yīng)用實(shí)施例2的臨床株多重PCR電泳圖M :50bp標(biāo)準(zhǔn)參照物；1 陰性對(duì)照； 2:陽(yáng)性對(duì)照(煙曲霉)；3 13分別為臨床株1 11。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.菌落培養(yǎng)將實(shí)驗(yàn)所用絲狀真菌在無(wú)菌條件下接種于制備好的PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)7 14d，待菌落生長(zhǎng)成熟后，用無(wú)菌取菌針刮取少量菌絲或孢子到100 yl無(wú)菌生理鹽水中，振 蕩渦旋，盡量使菌絲團(tuán)分散，取少量做好的菌溶液接種于PDA平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)20 40h左右(具體視菌落生長(zhǎng)情況而定)，培養(yǎng)基上長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落，視為實(shí)驗(yàn)可用菌落。2.菌落PCR的DNA模板制備方法取0.2ml的無(wú)菌PCR管，加入少量高壓滅菌的石英砂，加入20 ill無(wú)菌IX TE緩沖 液，備用。用取菌針刮取少量上述菌絲體，加入準(zhǔn)備好的PCR管中，標(biāo)記，蓋緊，100°C煮沸 5min,然后立即置于-20°C冰箱中5min，反復(fù)2次，放于渦旋器渦旋5min。14000r/min離心 5min，取上清液1 y 1作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。3.PCR 擴(kuò)增用真菌通用引物ITS 1和ITS 4，PCR反應(yīng)體系25 iil，含4 ill 10X緩沖液， 1. 5u 1 MgCl2(10mmol/L) ,2u 1 dNTPmix(10umol/L)，引物(lOumol/L)各0. 5ii 1，DNA模板 2u l,Taq DNA聚合酶2U。反應(yīng)條件為 95°C 5min預(yù)變性后.95°C lmin，52°C lmin，72°C lmin, 共進(jìn)行30個(gè)循環(huán).最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1. 5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，每個(gè) 加樣孔點(diǎn)樣4iU，電泳緩沖液為1XTAE，恒壓80V，電泳約30min。電泳結(jié)束后，取瓊脂糖凝 膠在凝膠成像儀上紫外線透射下觀察結(jié)果并攝片。反應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照 用去離子水代替DNA模板，陽(yáng)性對(duì)照用常規(guī)方法提取并檢測(cè)過(guò)的煙曲霉的DNA基因組。結(jié)果顯示，在所有實(shí)驗(yàn)所用的7屬16種菌種中，均成功擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，PCR產(chǎn)物 電泳具體結(jié)果見(jiàn)圖1。4. ITS區(qū)基因序列分析PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行堿基序列測(cè)定，并與網(wǎng)上已知菌種 ITS區(qū)片段序列對(duì)比。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表1。表1:16株菌測(cè)序結(jié)果 5.菌落PCR與常規(guī)PCR的比較為了鑒別菌落PCR反應(yīng)結(jié)果的可靠性，在相同條件下，用前期實(shí)驗(yàn)所提的7種絲狀 真菌(煙曲霉、黃曲霉、土曲霉、黑曲霉、雜色曲霉、串珠鐮刀菌和尖端賽多孢)的基因組模 板進(jìn)行的常規(guī)PCR反應(yīng)進(jìn)行對(duì)比。菌落PCR結(jié)果與常規(guī)PCR電泳圖結(jié)果一致，但條帶稍暗， 見(jiàn)圖2。在國(guó)內(nèi)將菌落PCR應(yīng)用于真菌的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，國(guó)外應(yīng)用于酵母菌的報(bào)道稍 多，用于絲狀真菌的研究?jī)H見(jiàn)于兩位日本學(xué)者，但都不是單純的直接菌落PCR，而是借助特 殊的試劑或緩沖液。以學(xué)者Alshahni匪等在2009年的研究為例，在所用的3屬20種35 株絲狀真菌中，直接菌落PCR實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌株只有11例，陽(yáng)性率為31.4%。他們實(shí)驗(yàn)中所用的 煙曲霉、土曲霉、黃曲霉、黑曲霉、雜色曲霉、擴(kuò)展青霉和串珠鐮刀菌都沒(méi)有成功擴(kuò)增，而本 發(fā)明均成功進(jìn)行了菌落PCR并獲得陽(yáng)性結(jié)果。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果差別較大的原因在于，Alshahni MM等所用菌絲體為生長(zhǎng)7 10d的成熟菌落，而本發(fā)明中所用菌落為生長(zhǎng)最初期的菌落。應(yīng)用實(shí)施例1 在皮下真菌感染病原菌鑒定中的應(yīng)用1. 1臨床資料患者男，7月嬰兒，4個(gè)月前無(wú)明顯原因于右側(cè)眼角處發(fā)生紅色丘疹，頂端有膿皰， 繼而破潰，在皮損周圍發(fā)生多個(gè)類似皮損，逐漸增多蔓延至眼周皮膚、右側(cè)面頰、鼻部、額部 等處，皮損為浸潤(rùn)性紅斑結(jié)節(jié)，含有較多膿液，在當(dāng)?shù)亻T診及醫(yī)院多次用針頭抽膿處理，并 給予青霉素、慶大霉素等抗生素靜滴，皮損仍繼續(xù)擴(kuò)展。2010年3月29日來(lái)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院門診就診。皮膚科檢查右側(cè)面部、額部、鼻梁及左側(cè)內(nèi)眼角可見(jiàn)大片浸潤(rùn)性 紅斑結(jié)節(jié)，中央皮損融合成片，上覆較厚黃棕色痂皮，右眼瞼上方皮損明顯凹陷，大小約為 lcmX 3cm，右眼睜眼受限。皮損邊緣為多個(gè)隆起的紅色結(jié)節(jié)，部分融合，約0. 5cmX lcm lcmX 1. 5cm大小，結(jié)節(jié)表面光滑，部分可見(jiàn)膿頭，質(zhì)軟，右耳下有一個(gè)lcmX 3cm紅色結(jié)節(jié)， 壓之有波動(dòng)感。1. 2 方法真菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢查菌落PCR基因組DNA模板制備真菌培養(yǎng)出2種菌落，分別為絲狀菌落和酵母菌 落，絲狀菌落基因組DNA模板制備方法同實(shí)施例1，酵母菌落基因組DNA模板制備方法為 在20iU無(wú)菌1XTE緩沖液加入少量菌體，100°C煮沸3min，然后立即置于-20°C冰箱中冷 凍5min，14000r/min離心5min，取上清液作為DNA模板。PCR 擴(kuò)增對(duì)制備的每一菌落PCR基因組DNA模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體方法同實(shí)施例1。ITS區(qū)基因序列分析1.3菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果結(jié)果見(jiàn)圖3。1. 4產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果測(cè)序片段如上圖所示，為ITS1和ITS4之間的ITS區(qū)序列，酵母菌落測(cè)序結(jié)果顯示 為489bp，絲狀菌落測(cè)序結(jié)果顯示為557bp，經(jīng)BLAST(網(wǎng)址http //blast, ncbi. nlm. nih. Rov/Blast. cRi)比對(duì)后，酵母菌落為近平滑念珠菌，絲狀菌落為細(xì)極鏈格孢。測(cè)序診斷與形 態(tài)學(xué)診斷一致。1. 5 討論本實(shí)驗(yàn)中收集1例皮下真菌感染患者，該患者為7月大嬰兒，發(fā)病部位在面部，病 理取材受到限制，無(wú)法得到組織病理及特殊染色結(jié)果，在這種情況下，真菌學(xué)的證據(jù)顯得尤 為重要。該患者皮損表面及痂下多次真菌鏡檢和培養(yǎng)均為陽(yáng)性，在真菌培養(yǎng)后的第3天，長(zhǎng) 出肉眼可見(jiàn)的兩種菌落，挑取進(jìn)行菌落PCR的檢測(cè)，從處理標(biāo)本到PCR擴(kuò)增結(jié)束共需要3h 時(shí)間，然后送測(cè)序，第2天可以得到測(cè)序結(jié)果，從取材到得到測(cè)序結(jié)果共需要5天時(shí)間。傳統(tǒng) 形態(tài)學(xué)方法鑒定酵母菌落為近平滑念珠菌約耗時(shí)7d，鑒定絲狀真菌為鏈格孢約耗時(shí)10d。 菌落PCR測(cè)序結(jié)果與后來(lái)的絲狀真菌小培養(yǎng)和念珠菌的柯瑪嘉顯色培養(yǎng)鑒定結(jié)果一致，驗(yàn) 證了菌落PCR的正確性。實(shí)施例21.菌落培養(yǎng)真菌采用標(biāo)準(zhǔn)菌菌株煙曲霉，培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。2.菌落PCR的DNA模板制備方法同實(shí)施例1。3.PCR 擴(kuò)增多重PCR體系引物用真菌通用引物NS，皮膚癬菌特異性引物和酵母菌特異性引 物(見(jiàn)表 2)。PCR 反應(yīng)體系 25 iil，含 4 ill 10X 緩沖液，1.5iU MgCl2 (10mmol/L), 2 u 1 dNTPmix(10umol/L)，引物(10 u mol/L)各 0. 5 ii 1，DNA 模板 2u 1, Taq DNA 聚合酶 2U。反應(yīng)條件為95°C 5min預(yù)變性后.95 V lmin，52°C lmin，72°C lmin，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán).最后 72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1. 5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，每個(gè)加樣孔點(diǎn)樣4 yl，電泳緩 沖液為1XTAE，恒壓80V，電泳約30min。電泳結(jié)束后，取瓊脂糖凝膠在凝膠成像儀上紫外線 透射下觀察結(jié)果并攝片。反應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照，陰性對(duì)照用去離子水代替DNA模板。實(shí)施例3除真菌采用標(biāo)準(zhǔn)菌菌株紅色毛癬菌，其余同實(shí)施例2。實(shí)施例41.菌落培養(yǎng)真菌采用標(biāo)準(zhǔn)菌菌株近平滑念珠菌，培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。2.菌落PCR的DNA模板制備方法在20iU無(wú)菌1XTE緩沖液加入少量菌體，100°C煮沸3min，然后立即置于_20°C 冰箱中冷凍5min，14000r/min離心5min，取上清液作為DNA模板。3. PCR 擴(kuò)增同實(shí)施例2。結(jié)果如圖4所示，實(shí)施例2-4能分別擴(kuò)增出310bp、450bp和271bp大小的片段。應(yīng)用實(shí)施例22. 1臨床資料收集的臨床標(biāo)本對(duì)象為醫(yī)科院皮研所真菌檢驗(yàn)室的淺部真菌病患 者，均為真菌鏡檢陽(yáng)性標(biāo)本，其中股癬6例，手癬2例，甲真菌病3例。2. 2 方法真菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢查菌落PCR基因組DNA模板制備同臨床實(shí)施例1。PCR擴(kuò)增對(duì)制備的每一菌落PCR基因組DNA模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體方法 同實(shí)施例2。表2 多重PCR所用特異性引物情況 2. 3多重PCR反應(yīng)結(jié)果11株臨床株用上述多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行鑒定，結(jié)果電泳圖見(jiàn)圖5，根據(jù)50bp Ladder對(duì)比并與標(biāo)準(zhǔn)株圖譜比較可以鑒別真菌到種屬。臨床株1 7及11均為皮膚癬菌， 臨床株8和10首先考慮為絲狀真菌屬。淺部真菌病是最常見(jiàn)的真菌感染性疾病，世界范圍內(nèi)人群患病率為20% 25%， 淺部真菌病的主要病原菌為皮膚癬菌，但酵母菌所占的比例較以前有大幅增多。將病原菌 快速鑒定至種屬水平對(duì)臨床指導(dǎo)用藥有重大意義。現(xiàn)真菌培養(yǎng)鑒定菌種需要14天，得到藥
9敏結(jié)果需要21天，個(gè)別菌種生長(zhǎng)較慢，需要時(shí)間更長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)所用的多重PCR體系為本發(fā)明研究者前期工作中所建立，在同一體系中能 夠鑒別3個(gè)種屬的菌種，即皮膚癬菌、酵母菌和絲狀真菌。若3對(duì)引物擴(kuò)增均為陽(yáng)性，則提 示可能為皮膚癬菌、酵母和霉菌，或皮膚癬菌和酵母的混合感染；若前2對(duì)引物擴(kuò)增陽(yáng)性， 則提示可能為皮膚癬菌和霉菌的混合感染或皮膚癬菌的單純感染；若第1對(duì)和第3對(duì)引物 擴(kuò)增陽(yáng)性，則提示可能為酵母和霉菌的混合感染或酵母的單純感染；若僅有第1對(duì)引物擴(kuò) 增陽(yáng)性，則可能為霉菌的單純感染。這樣，在較短時(shí)間內(nèi)，為臨床醫(yī)生提供了病原菌的參考 信息，醫(yī)生結(jié)合臨床表現(xiàn)可以選擇針對(duì)某一患者的最適藥物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，該反應(yīng)體系比較穩(wěn)定，能擴(kuò)增出清晰的目的片段，未見(jiàn)明顯非特 異性條帶的干擾，同時(shí)用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行了真菌培養(yǎng)，培養(yǎng)鑒定結(jié)果同菌落多重PCR結(jié)果一 致。說(shuō)明菌落PCR技術(shù)能夠用于淺部真菌感染的臨床檢測(cè)，初步鑒定到種屬需要3-5天的 時(shí)間。由于時(shí)間倉(cāng)促，本發(fā)明研究者只收集了十余例標(biāo)本，旨在驗(yàn)證菌落PCR的可行性，沒(méi) 有進(jìn)行大規(guī)模的臨床資料與菌種資料的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)的成功為以后的研究奠定了一定 的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，該方法操作簡(jiǎn)單，所用試劑較少，省時(shí)省力，特別適合大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)研究，明顯 縮短實(shí)驗(yàn)研究周期。
權(quán)利要求
一種真菌的菌落PCR方法，其特征在于，將真菌培養(yǎng)物接種于培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基上剛長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落，作為實(shí)驗(yàn)可用菌落，制備DNA模板，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。
2.如權(quán)利要求1所述的真菌的菌落PCR方法，其特征在于，當(dāng)真菌為絲狀真菌時(shí)，制備 DNA模板的方法為在20 μ 1無(wú)菌1 XTE緩沖液中加入高壓滅菌的石英砂，加入實(shí)驗(yàn)可用 菌落菌絲體，煮沸5min，然后立即冷凍5 lOmin，反復(fù)2次，然后渦旋3 5min，12000 14000r/min離心5 lOmin，取上清液作為DNA模板。
3.如權(quán)利要求1所述的真菌的菌落PCR方法，其特征在于，當(dāng)真菌為酵母菌時(shí)，制備 DNA模板的方法為在20 μ 1無(wú)菌1 X TE緩沖液加入實(shí)驗(yàn)可用菌落菌體，煮沸3min，然后立 即冷凍5 IOmin, 12000 14000r/min離心5 lOmin，取上清液作為DNA模板。
4.如權(quán)利要求2或3所述的真菌的菌落PCR方法，其特征在于，冷凍溫度 為-15 -20°C。
5.一種鑒別病原性真菌的方法，其特征在于，將臨床標(biāo)本或病原性真菌培養(yǎng)物接種于 培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基上剛長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落，視為實(shí)驗(yàn)可用菌落，制備DNA模板， 進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
6.如權(quán)利要求5所述的鑒別病原性真菌的方法，其特征在于，當(dāng)病原性真菌為絲狀真 菌時(shí)，制備DNA模板的方法為在20 μ 1無(wú)菌1 X TE緩沖液中加入高壓滅菌的石英砂，加入 少量菌絲體，煮沸5min，然后立即冷凍5 lOmin，反復(fù)2次，然后渦旋3 5min，12000 14000r/min離心5 lOmin，取上清液作為DNA模板。
7.如權(quán)利要求5所述的鑒別病原性真菌的方法，其特征在于，當(dāng)病原性真菌為酵母菌 時(shí)，制備DNA模板的方法為在20 μ 1無(wú)菌1 X TE緩沖液加入少量菌體，煮沸3min，然后立 即冷凍5 lOmin，12000 14000r/min離心5 lOmin，取上清液作為DNA模板。
8.如權(quán)利要求6或7所述的鑒別病原性真菌的方法，其特征在于，冷凍溫度 為-15 -20°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及真菌的菌落PCR方法，擴(kuò)增的陽(yáng)性率高。本發(fā)明還涉及鑒別病原性真菌的方法，檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果可靠。所述真菌的菌落PCR方法為，將真菌培養(yǎng)物接種于培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基上剛長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落，作為實(shí)驗(yàn)可用菌落，制備DNA模板，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。所述鑒別病原性真菌的方法，將臨床標(biāo)本或病原性真菌培養(yǎng)物接種于培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基上剛長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落，作為實(shí)驗(yàn)可用菌落，制備DNA模板，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明提高了真菌菌落PCR擴(kuò)增的陽(yáng)性率，解決了真菌基因組DNA提取步驟繁瑣、破壁難、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，并在病原菌生長(zhǎng)最初期即可進(jìn)行菌種鑒定，較常規(guī)真菌表型鑒定時(shí)間明顯縮短，且結(jié)果可靠。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101851684SQ20101022757
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者劉維達(dá), 呂桂霞, 張曉利, 沈永年, 王淼淼, 葛一平, 鮑偉 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所