專利名稱：一種用于檢測羅氏沼蝦諾達病毒的試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋生物病原檢測技術(shù)，具體是一種用于羅氏沼蝦諾達病毒(Macrobr achiumrosenbergiiNodavirus,簡稱MrNV)的試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
羅氏沼蝦諾達病毒(MrNV)是一種無囊膜的RNA病毒，大小約26-27nm，呈二十面 體狀，其基因組由兩條單鏈RNA組成；常與羅氏沼蝦諾達病毒伴隨出現(xiàn)的還有一種被稱作 極小病毒(Extra smallvirus，簡稱XSV)的衛(wèi)星病毒，XSV大小約14_16nm，其基因組由一 段RNA組成。該病毒主要感染羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)，侵染部位主要是蝦 的橫紋肌肌肉以及肝胰腺結(jié)締組織，感染蝦的體干呈乳色，不透明，所以又稱被稱為白尾病 (White tail disease，簡稱WTD)、肌肉白濁病(White muscledisease，簡稱WMD)，該病毒感 染可引起高達90%的死亡率。該病毒目前主要分布于法屬西印度群島、泰國、印度。1996年 我國在廣東、廣西一帶發(fā)現(xiàn)該病毒，此后該病毒迅速傳播到江蘇、浙江、上海等地；2001年 起，該病開始在各主要羅氏沼蝦苗種場廣泛流行，已成為羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要威脅。所以 開發(fā)新的技術(shù)快速、準確、靈敏地檢測羅氏沼蝦諾達病毒，加強蝦苗種和成蝦檢疫以及養(yǎng)殖 水體環(huán)境的監(jiān)測，以預(yù)防病毒感染，切斷病毒傳播，保障我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展就 顯得尤為迫切和重要。目前，羅氏沼蝦諾達病毒檢測還主要依賴于病理切片法、電鏡觀察法、抗體雜交法 和RT-PCR檢測法。病理切片法不能直接對病毒進行檢測，只能利用發(fā)病的組織病理征兆進 行檢測，并且還局限于在實驗室內(nèi)進行；電子顯微鏡技術(shù)雖然可以直接觀察到病毒粒子的 存在，但其操作復(fù)雜、耗費時間長、準確性低；用抗體檢測法檢測羅氏沼蝦諾達病毒雖然在 速度上優(yōu)于病理切片法，但其靈敏度較低，在羅氏沼蝦諾達病毒尚未引發(fā)感染或感染的極 早期很難用抗體法檢測出來；羅氏沼蝦諾達病毒的RT-PCR檢測法，雖然克服了前面幾種方 法的缺點，在實驗室條件下能實現(xiàn)對羅氏沼蝦諾達病毒的相對快速、準確檢測，但由于常規(guī) 的RT-PCR檢測需要昂貴的PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)，使得RT-PCR檢測法難以用于現(xiàn)場 的快速檢測，這大大限制了 RT-PCR檢測方法在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。進行羅氏沼蝦諾達病毒早期檢測并采取預(yù)防措施是水產(chǎn)養(yǎng)殖中降低羅氏沼蝦諾 達病毒流行風(fēng)險、減少發(fā)病造成的巨額經(jīng)濟損失的有效手段。所以建立簡單、快速、高靈敏 的檢查方法，并開發(fā)適于現(xiàn)場應(yīng)用的羅氏沼蝦諾達病毒檢測試劑盒就顯得極為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測羅氏沼蝦諾達病毒的試劑盒及檢測方法，以彌 補現(xiàn)有技術(shù)的不足，使之適用于生產(chǎn)現(xiàn)場快速、高靈敏度的檢測羅氏沼蝦諾達病毒。同時將 檢測試劑集中于規(guī)范的試劑盒中，使羅氏沼蝦諾達病毒的檢測更加靈敏準確、快速和方便。本發(fā)明利用針對羅氏沼蝦諾達病毒的衣殼蛋白基因中保守區(qū)段設(shè)計的4條特異 性引物、一種反轉(zhuǎn)錄酶和一種DNA聚合酶，利用等溫擴增方法來完成對目的核酸片段的擴增，省略了反轉(zhuǎn)錄的步驟。并且，同常規(guī)PCR方法相比，等溫擴增所有的步驟都是在60 65°C的某一恒定溫度下進行的。從而可以實現(xiàn)羅氏沼蝦諾達病毒的現(xiàn)場檢測。同時，為了 進一步縮短檢測時間、消除檢測過程中可能發(fā)生的污染，使檢測實驗?zāi)軌蛟陴B(yǎng)殖現(xiàn)場開展， 本發(fā)明對羅氏沼蝦諾達病毒的檢測方法進行了優(yōu)化1、縮短了待檢測樣品核酸制備的時間在用FTA卡制備待檢測樣品核酸的標準步驟中，需要將樣品勻漿液潤濕的FTA膜 片在室溫下干燥至少一個小時，然后才能進行漂洗。而本發(fā)明通過在待檢測樣品勻漿液潤 濕的FTA膜片上滴加親水性且易揮發(fā)的醇類物質(zhì)(例如叔醇、伯醇或仲醇)，使?jié)櫇竦腇TA 膜片在室溫條件下僅需幾分鐘即可完成干燥過程，大大縮短了樣品核酸制備的時間。2、優(yōu)化了擴增樣品的檢測步驟在利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法檢測病原時，目前普遍采用擴增反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)管 中添加染料以判斷檢測結(jié)果的方法。由于等溫擴增反應(yīng)的產(chǎn)物量大，這種打開反應(yīng)管再添 加染料的方法極易導(dǎo)致后續(xù)待檢樣品被污染而使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。為了克服這一問 題，已有技術(shù)采用在擴增反應(yīng)試劑中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)的方法消除污染風(fēng) 險，但卻增加了成本。而本發(fā)明通過在用于擴增反應(yīng)的小管內(nèi)預(yù)置染料的方法，可有效消除 污染風(fēng)險，又不增加成本。第一種方法是將金屬離子與鈣黃綠素形成的配合物(即染料) 與擴增反應(yīng)液預(yù)先混合，置于擴增反應(yīng)小管內(nèi)；第二種方法是先將核酸染料粘附到擴增反 應(yīng)管的內(nèi)側(cè)上方或蓋子內(nèi)側(cè)，等擴增反應(yīng)結(jié)束后再通過上下反復(fù)震蕩使擴增反應(yīng)液和核酸 染料混合；這樣擴增反應(yīng)結(jié)束后無須打開擴增反應(yīng)管就能完成擴增產(chǎn)物的染色，消除了打 開擴增反應(yīng)管再添加核酸染料過程中反應(yīng)液可能濺出造成后續(xù)待檢樣品被污染的風(fēng)險。另外，在用FTA卡制備樣品核酸的標準步驟中，需要用Whatman公司(英國)專門 的純化試劑反復(fù)漂洗FTA膜片；而本發(fā)明無需專門的純化試劑，只采用普通的蒸餾水漂洗 即可完成FTA膜片的純化，這不僅簡化了檢測的操作步驟，還降低了實驗成本。為了使該檢 測方法在生產(chǎn)現(xiàn)場具有更強的實用性，本發(fā)明在優(yōu)化檢測方法的基礎(chǔ)上，將檢測羅氏沼蝦 諾達病毒所需的試劑及器材進行了組裝、配套，使之標準化，形成了檢測試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案包括1、用于檢測羅氏沼蝦諾達病毒的試劑盒，包括(1)采樣管，用來盛放、研磨待檢樣品；(2)漂洗管，內(nèi)裝蒸餾水；(3)核酸變性管，內(nèi)裝TE緩沖液；(4)擴增檢測管，內(nèi)裝擴增反應(yīng)液和染料，擴增反應(yīng)液組成成分如下擴增引 物的上游引物1和下游引物1各1 2μΜ，擴增引物的上游引物2和下游引物2各 0. 1 0. 4 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 0. 8 2. OmM, MgCl24 10mM，Betaine (甜菜 堿)0· 6 1. 2M, Tris-HCl 10 40mM，KCl 10 20mM，MgSO4I 4mM，(NH4) 2S046 12mM， TritonX-1000. 05% 1. 0%，反轉(zhuǎn)錄酶1 20U，BstDNA聚合酶2 20U ；染料可以選金屬 離子與鈣黃綠素形成的配合物，也可以選任一種核酸染料，核酸染料為分子生物學(xué)研究中 常用的染料，包括 SYBR Green、GelRed, GelGreen, GoldView 、GeneFinder 等。金屬離子 與鈣黃綠素形成的配合物預(yù)混于擴增反應(yīng)液中，而核酸染料預(yù)先粘附于擴增檢測管管壁內(nèi) 側(cè)上方或擴增檢測管蓋子內(nèi)側(cè)；
(5)陰性對照管，裝有無羅氏沼蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，裝有吸附了羅氏沼蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，為親水性且易揮發(fā)的醇類物質(zhì)；
(8)分別封裝于無菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙簽和吸管。上述的擴增引物是根據(jù)羅氏沼蝦諾達病毒衣殼蛋白保守區(qū)序列設(shè)計的，其核苷酸 序列如下上游引物1 :5' -AGCCTGCCTAAGTAACTGATCAATTTTGATACAAATCCACTAGATGACC-3，下游引物1 :5' -CGCGGCAGTGGAATTTCTCTTTTTGATCATCACGCCTGACAA-3，上游引物2:5, -GCTTGCCAACTTATTGGTT-3，下游引物2 5 ‘ -ACGTTCTCTTTATCTTGACCA-3，。使用上述的引物，并采用試劑盒中的擴增反應(yīng)液對諾達病毒的核酸樣品進行擴 增，擴增產(chǎn)物電泳檢測后測序，測序結(jié)果表明擴增得到的產(chǎn)物為羅氏沼蝦諾達病毒的對應(yīng) 片段；而用不含諾達病毒的核酸樣品進行擴增，結(jié)果擴增反應(yīng)不能發(fā)生。2、本發(fā)明的試劑盒的檢測方法，按下列步驟進行(1)取樣品組織約0. 02 1. Og置于采樣管中，用研磨棒將樣品組織磨碎至漿狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品組織將FTA膜片充分潤濕；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，靜置1 20min ；(4)用牙簽將上述FTA膜片轉(zhuǎn)移到漂洗管內(nèi)，震蕩漂洗管3 5min以洗滌FTA膜 片；(5)再用牙簽將上述核酸變性管內(nèi)的FTA膜片轉(zhuǎn)移到擴增檢測管內(nèi)，將擴增檢測 管置于55 65°C條件下保溫40 70min ；(6)將擴增檢測管上下反復(fù)甩動l-3min ；(7)用力向下甩動擴增檢測管，使管內(nèi)混有染料的擴增反應(yīng)液集聚于擴增檢測管 底部，用眼睛觀察反應(yīng)液，如果反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色則表示該樣品的羅氏沼蝦諾達病毒檢測結(jié) 果為陽性，如果反應(yīng)液呈現(xiàn)橙黃色則表示該樣品的羅氏沼蝦諾達病毒檢測結(jié)果為陰性。在上述步驟中，從第(4)步開始應(yīng)將作為陰性對照的無羅氏沼蝦諾達病毒核酸的 FTA膜片從陰性對照管中取出、作為陽性對照的吸附了羅氏沼蝦諾達病毒核酸的FTA膜片 從陽性對照管中取出，同吸附了樣品核酸的FTA膜片一起分別處理，直至完成檢測。本發(fā)明的試劑盒中匯集羅氏沼蝦諾達病毒現(xiàn)場快速檢測所需的FTA膜片、TE緩沖 液、擴增反應(yīng)液、染料等試劑和研磨棒、牙簽、吸管等器材，使得羅氏沼蝦諾達病毒的檢測能 夠快速有序地進行，實現(xiàn)了檢測過程的程序化和標準化。而依據(jù)羅氏沼蝦諾達病毒衣殼蛋 白保守區(qū)序列所設(shè)計的擴增引物能有效檢測羅氏沼蝦諾達病毒的所有毒株，而與其他病毒 的衣殼蛋白又無同源性，使檢測特異性高。采用醇類物質(zhì)對取樣后的FTA膜片進行快速干 燥處理，使得樣品核酸的制備時間大大縮短；采用內(nèi)置染料的方法，在反應(yīng)結(jié)束后不用打開 反應(yīng)管即可直接對反應(yīng)液進行染色，避免了打開反應(yīng)管再添加染料使后續(xù)待檢樣品被擴增 產(chǎn)物污染而造成假陽性的結(jié)果，從而大大提高了該方法在檢測中應(yīng)用的可靠性。本發(fā)明將 目的核酸的反轉(zhuǎn)錄和擴增結(jié)合起來同步進行，節(jié)省了時間，僅需1.5 2小時就可完成羅氏 沼蝦諾達病毒的檢測；并且檢測過程無需昂貴的儀器設(shè)備如離心機、PCR儀和凝膠成像系 統(tǒng)，僅需水浴鍋或金屬浴甚至更簡單的保溫裝置即可；而且檢測結(jié)果非常容易判別。與羅氏沼蝦諾達病毒已有檢測技術(shù)相比，本發(fā)明的檢測方法成本非常低，整個過程不涉及有毒試 劑，對操作人員和環(huán)境都非常安全，并且檢測靈敏度極高，可以替代羅氏沼蝦諾達病毒之前 的相關(guān)檢測方法如病理切片法、電鏡觀察法、抗體檢測法和RT-PCR檢測法；本發(fā)明的檢測 試劑盒不僅可在實驗室內(nèi)使用，也可在野外的生產(chǎn)現(xiàn)場使用，對加強羅氏沼蝦諾達病毒的 流行病學(xué)監(jiān)測和疾病防控意義重大，具有很高的推廣應(yīng)用價值。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明的檢測試劑盒由以下部件組成(可檢測4個樣品的包裝)(1)采樣管，4個，用來盛放、研磨待檢樣品；(2)漂洗管，6個，每個管內(nèi)裝有1ml的蒸餾水；(3)核酸變性管，6個，分別裝有20 ii L的TE緩沖液(含10mMTris-HCl和ImMEDTA， pH8. 0)；(4)擴增檢測管，6個，每個管內(nèi)裝有24 PL擴增反應(yīng)液和lyL的染料，擴增反應(yīng) 液組成成分如下擴增引物的上游引物1和下游引物1各1.6 yM，擴增引物的上游引物2和 下游引物 2 各 0. 2 ii M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 1. 4mM, MgCl28mM, Betaine (甜菜堿)1. 2M， Tris-HCl 20mM, KC1 lOmM, MgS042mM, (NH4) 2S0410mM, Triton X-1000. 1 %，反轉(zhuǎn)錄酶 5U，Bst DNA聚合酶8U ；染料為50 y M鈣黃綠素和氯化錳形成的配合物；(5)陰性對照管，1個，內(nèi)裝無羅氏沼蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，1個，內(nèi)裝吸附了羅氏沼蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，1管，內(nèi)裝500 u L無水乙醇；(8)FTA膜片(4片)、研磨棒(4個)、牙簽(6個)和吸管(1個)分別封裝于無菌 袋中；包裝盒內(nèi)裝一塊有4X6個小孔的海綿塊，各個管插在小孔中，同時有使用說明書 1份。實施例2本發(fā)明的檢測試劑盒也可由以下部件組成(可檢測4個樣品的包裝)(1)采樣管，4個，用來盛放、研磨待檢樣品；(2)漂洗管，6個，每個管內(nèi)裝有1ml的蒸餾水；(3)核酸變性管，6個，分別裝有20 ii L的TE緩沖液(含10mMTris-HCl和ImMEDTA， pH8. 0)(4)擴增檢測管，6個，每個管內(nèi)裝有25 PL擴增反應(yīng)液和lyL的核酸染料，擴增 反應(yīng)液組成成分如下擴增引物的上游引物1和下游引物1各1. 6 yM，擴增引物的上游引 物 2 和下游引物 2 各 0. 2 ii M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 1. 4mM, MgCl28mM, Betaine (甜菜 堿)1. 2M, Tris-HC120mM, KCllOmM, MgS042mM, (NH4)2S0410mM, TritonX-1000. 1%，反轉(zhuǎn)錄酶 5U，BstDNA聚合酶8U ；核酸染料1 P L，成份為稀釋10倍的GeneFinder ，且核酸染料已粘 附固定于擴增檢測管的管蓋內(nèi)側(cè)。(5)陰性對照管，1個，內(nèi)裝無羅氏沼蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，1個，內(nèi)裝吸附了羅氏沼蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；
(7)快速干燥液，1管，內(nèi)裝500 u L無水乙醇；(8)FTA膜片(4片)、研磨棒(4個)、牙簽(6個)和吸管(1個)分別封裝于無菌 袋中；包裝盒內(nèi)裝一塊有4X6個小孔的海綿塊，各個管插在小孔中，同時有使用說明書 1份。實施例3使用本發(fā)明的檢測試劑盒檢測羅氏沼蝦諾達病毒的方法如下(1)取樣品組織約0. lg置于采樣管中，用研磨棒快速將樣品磨碎至漿狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品將FTA膜片充分潤濕；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，將FTA膜片室溫靜置lOmin ；(4)用牙簽將上述FTA膜片轉(zhuǎn)移到漂洗管內(nèi)，將漂洗管劇烈震蕩3min ；(5)再用牙簽將上述核酸變性管內(nèi)的FTA膜片轉(zhuǎn)移到擴增檢測管內(nèi)，57°C保溫 60min ；(6)將擴增檢測管上下反復(fù)甩動2min ；(7)然后用力向下甩動擴增檢測管，用眼睛觀察擴增反應(yīng)液，如果呈現(xiàn)綠色則表示 該樣品的羅氏沼蝦諾達病毒檢測結(jié)果為陽性，如果呈現(xiàn)橙黃色則表示該樣品的羅氏沼蝦諾 達病毒檢測結(jié)果為陰性；即顏色變化作為檢測的樣品是否存在諾達病毒的定性數(shù)據(jù)。在上述步驟中從第4步開始，應(yīng)將無羅氏沼蝦諾達病毒核酸的FTA膜片、吸附了羅 氏沼蝦諾達病毒核酸的FTA膜片和吸附了樣品核酸的FTA膜片一起處理，直至完成檢測反 應(yīng)，分別用作檢測的陰性和陽性對照。陰性對照的擴增檢測管應(yīng)為橙黃色，而陽性對照的擴 增檢測管應(yīng)為綠色。實施例4使用本發(fā)明試劑盒檢測餌料中病毒存在情況使用實施例1或?qū)嵤├?中的檢測試劑盒，按下列步驟進行(1)取羅氏沼蝦鮮活餌料約0. lg置于采樣管中，用研磨棒快速將樣品磨碎至漿 狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品將FTA膜片充分潤濕；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，將FTA膜片室溫靜置lOmin ；(4)用牙簽將上述FTA膜片轉(zhuǎn)移到漂洗管內(nèi)，將漂洗管劇烈震蕩3min ；(5)再用牙簽將上述核酸變性管內(nèi)的FTA膜片轉(zhuǎn)移到擴增檢測管內(nèi)，57°C保溫 60min ；(6)將擴增檢測管上下反復(fù)甩動2min ；(7)然后用力向下甩動擴增檢測管，用眼睛觀察擴增反應(yīng)液，如果呈現(xiàn)綠色則表示 該樣品的羅氏沼蝦諾達病毒檢測結(jié)果為陽性，如果呈現(xiàn)橙黃色則表示該樣品的羅氏沼蝦諾 達病毒檢測結(jié)果為陰性。在上述步驟中從第4步開始，應(yīng)將無羅氏沼蝦諾達病毒核酸的FTA膜片、吸附了羅 氏沼蝦諾達病毒核酸的FTA膜片和吸附了樣品核酸的FTA膜片一起處理，直至完成檢測反 應(yīng)，分別用作檢測的陰性和陽性對照。實施例5
為了驗證本發(fā)明中快速核酸制備方法制備核酸的效果，分別利用現(xiàn)有的 Whatman-FTA卡標準核酸制備方法和本發(fā)明試劑盒從感染諾達病毒的蝦中制備病毒核酸樣 首先利用Whatman-FTA卡標準核酸制備方法制備病毒核酸樣品(1)取約10-20毫克的蝦附肢放入1. 5mL離心管中，加入100 μ L份PBS緩沖液，用 研磨棒將附肢研磨成漿狀；(2)用吸液管將研磨的組織勻漿液加到FTA卡的樣品圓圈內(nèi)，大約每個圓圈加 25μ L ；(3)將加好樣品的FTA卡室溫放置干燥至少一個小時；(4)用一個鉆取工具從所上述干燥后的FTA卡上取下直徑約2. Omm的圓片，放進 1. 5mL離心管中；(5)在上述離心管中加入200 μ LFTA純化試劑(Whatman產(chǎn)品編號WG120204)，靜 置5分鐘；(6)用吸液管將離心管內(nèi)的FTA純化試劑全部吸出；(7)重復(fù)步驟(5)——(6)兩次；(8)在上述離心管中加入 200 μ LTE 緩沖液(lOmMTris-HCl，0. ImMEDTA，ρΗ8· 0)，靜 置5分鐘；(9)用吸液管將離心管內(nèi)的TE緩沖液全部吸出；(10)重復(fù)步驟⑶——(9)兩次；(11)將上述離心管內(nèi)的圓片在室溫下干燥大約一個小時，圓片即可用于核酸的擴 增了。利用本發(fā)明試劑盒按下面的步驟制備蝦病毒核酸(1)取約10-20毫克的蝦附肢放入1. 5mL離心管中，用研磨棒將蝦附肢研磨成漿 狀；(2)用吸液管將研磨的組織勻漿液加到3個FTA卡的樣品圓圈內(nèi)，大約每個圓圈加 5 μ L ；(3)將3個FTA卡上分別滴加100 μ L甲醇、無水乙醇和異丙醇，室溫放置3 5分 鐘；(4)用一個鉆取工具從所上述3個FTA卡上分別取下直徑約2. Omm的圓片放進 1. 5mL離心管中；(5)在上述離心管中加入800 μ L滅菌水，劇烈震蕩3分鐘；(6)取出離心管內(nèi)的圓片即可用于核酸的擴增了。從上述過程中可以看出，采用Whatman-FTA卡標準核酸制備方法大約需要2個多 小時才能完成核酸制備，而采樣本發(fā)明試劑盒大約只需要6 10分鐘就可以完成核酸制 備；所以與Whatman-FTA卡標準核酸制備方法相比，本發(fā)明的快速核酸制備方法具有操作 簡單、快速的優(yōu)點。實施例6Whatman-FTA卡標準核酸制備方法制備的核酸樣品和本發(fā)明試劑盒制備的核酸樣 品得效果對比。
用實施例5中Whatman-FTA卡標準核酸制備方法和本發(fā)明試劑盒制備的蝦病毒 核酸樣品分別作為模板，進行等溫擴增反應(yīng)，每個擴增反應(yīng)中含25 y L擴增反應(yīng)液，擴增反 應(yīng)液組成成分如下擴增引物的上游引物1和下游引物1各1. 5 yM，擴增引物的上游引物 2 禾口下游引物 2 各 0. 3iiM，dATP、dTTP、dGTP 禾口 dCTP 各 1. 5mM, MgCl27mM, Betaine (甜菜 堿)1. 3M, Tris-HC120mM, KC1 lOmM, MgS042mM, (NH4) 2S0410mM, TritonX-10. 1 %，反轉(zhuǎn)錄酶 2U， BstDNA聚合酶8U ；等溫擴增反應(yīng)條件為58°C保溫60分鐘，然后90°C保持5分鐘；最后將 每個反應(yīng)管中的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明試劑盒(制備 核酸過程中采用了甲醇、無水乙醇和異丙醇等揮發(fā)性醇類作為快速干燥液)制備的核酸均 可以有效用作等溫擴增反應(yīng)的模板，并且擴增效果略好于采用Whatman-FTA卡標準核酸制 備方法制備的核酸的擴增效果。綜上所述，本發(fā)明檢測試劑盒及其檢測方法不僅可以應(yīng)用于蝦樣品中羅氏沼蝦諾 達病毒的檢測，還可應(yīng)用于蝦餌料中羅氏沼蝦諾達病毒的檢測。本發(fā)明中所述的FTA膜片是英國Whatman公司用來制備核酸的FTA卡片；將FTA 卡片裁切成尺度為長X寬不小于1毫米XI毫米的紙片或打孔成直徑不小于1毫米的紙 片即可制成FTA膜片。本發(fā)明的試劑盒所使用的試劑和材料引物由上海生物工程有限責任公司合成； 乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、dNTP、甜菜堿(Betaine)、dATP、dGTP、dCTP和dTTP、 KC1、MgS04、(NH4)2S04、MgCl2、TritonX-100購自上海生物工程有限責任公司；無水乙醇、甲 醇、異丙醇、鈣黃綠素、氯化錳等購自國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司；等溫擴增用的Bst DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶等購自NEB公司；核酸染料GeneFinddr 購自廈門百維信生物科技有 限公司。
權(quán)利要求
一種用于檢測羅氏沼蝦諾達病毒的試劑盒，其特征是該檢測試劑盒包括(1)采樣管，用來盛放、研磨待檢樣品；(2)漂洗管，內(nèi)裝蒸餾水；(3)核酸變性管，內(nèi)裝TE緩沖液；(4)擴增檢測管，內(nèi)裝擴增反應(yīng)液和染料；(5)陰性對照管，內(nèi)裝無羅氏沼蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，內(nèi)裝吸附了羅氏沼蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液；內(nèi)裝親水性且易揮發(fā)的醇類物質(zhì)；(8)分別封裝于無菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙簽和吸管。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其中所述的染料為鈣黃綠素或分子生物學(xué)中 應(yīng)用的核酸染料，核酸染料包括但不限于SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldView 或 GeneFinder 。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于上述的鈣黃綠素染料與擴增檢測管內(nèi) 的擴增反應(yīng)液混合。
4.如權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于上述的核酸染料粘附于擴增檢測管內(nèi)。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的FTA膜片是由英國Whatman公 司用來制備核酸的FTA卡片裁切成的尺度不小于1平方毫米的紙片。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于上述的擴增反應(yīng)液由以下組份組成 擴增引物的上游引物1和下游引物1各1 2 yM，擴增引物的上游引物2和下游引物2各0.1 0. 4 ii M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 0. 8 2. OmM, MgCl2 4 10mM，甜菜堿 0. 6 1.2M, Tris-HCl 10 40mM，KC1 10 20mM，MgS04 1 4mM，(NH4) 2S04 6 12mM，Triton X-1000. 05% 1. 0%，反轉(zhuǎn)錄酶1 20U，具有鏈置換活性的DNA聚合酶2 20U。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于上述擴增反應(yīng)液中的擴增引物的核酸 序列是上游引物1:5 ‘ -AGCCTGCCTAAGTAACTGATCAATTTTGATACAAATCCACTAGATGACC-3’ 下游引物1:5 ‘ -CGCGGCAGTGGAATTTCTCTTTTTGATCATCACGCCTGACAA-3’ 上游引物 2 5 ‘ -GCTTGCCAACTTATTGGTT-3 ’ 下游引物 2 5 ‘ -ACGTTCTCTTTATCTTGACCA-3 ’。
8.權(quán)利要求1所述檢測試劑盒應(yīng)用于檢測羅氏沼蝦諾達病毒。
9.使用權(quán)利要求1所述檢測試劑盒檢測羅氏沼蝦諾達病毒的方法，其特征在于該方法 包括下列步驟(1)取樣品0.02 1. 0g置于采樣管中，用研磨棒將樣品磨碎至漿狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品將FTA膜片充分潤濕；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，靜置1 20min；(4)用牙簽將上述FTA膜片轉(zhuǎn)移到漂洗管內(nèi)，震蕩漂洗管3 5min以洗滌FTA膜片；(5)再用牙簽將上述核酸變性管內(nèi)的FTA膜片轉(zhuǎn)移到擴增檢測管內(nèi)，將擴增檢測管置于55 65 °C條件下保溫40 70min ；(6)將擴增檢測管上下反復(fù)甩動l-3min(7)向下甩動擴增檢測管，直接觀察擴增反應(yīng)液顏色，如果擴增反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色則表示 該樣品的羅氏沼蝦諾達病毒檢測結(jié)果為陽性，如果擴增反應(yīng)液呈現(xiàn)橙黃色則表示該樣品的 羅氏沼蝦諾達病毒檢測結(jié)果為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測羅氏沼蝦諾達病毒的試劑盒及檢測方法。本發(fā)明的試劑盒包括采樣管、內(nèi)裝蒸餾水的漂洗管、內(nèi)裝TE緩沖液的核酸變性管、內(nèi)裝擴增反應(yīng)液和染料的擴增檢測管、陰性對照管、陽性對照管、FTA膜片及縮短待檢測樣品核酸制備時間的快速干燥液等。本發(fā)明的試劑盒結(jié)合了等溫擴增和染料快速檢測的優(yōu)點，檢測過程無需昂貴的儀器設(shè)備；同時采用內(nèi)置染料的方法進行顯色，提高了檢測的可靠性。本試劑盒檢測成本低，使用方便，且對人和環(huán)境都非常安全，可以替代已有的相關(guān)檢測方法。本發(fā)明的試劑盒可在野外的生產(chǎn)現(xiàn)場使用，對于加強羅氏沼蝦諾達病毒監(jiān)測、防止其大規(guī)模爆發(fā)流行，具有重大的推廣應(yīng)用價值。
文檔編號C12Q1/70GK101875980SQ201010227880
公開日2010年11月3日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者張慶利, 楊冰, 王勤濤, 黃倢 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所