專利名稱：棘孢曲霉的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種具有廣譜的高抗菌活性的微生物菌 株。
背景技術(shù)：
印楝(Azadirachta indica A. Juss)為一種熱帶樹種，原產(chǎn)于印度和緬甸，不僅 具有昆蟲拒食和殺蟲活性，還有抑制致病真菌和細(xì)菌生長、消炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等生理 活性，具有較高的生物農(nóng)藥和醫(yī)藥價值。大多數(shù)活性物質(zhì)為四降三萜類化合物，此外還包 括一些二萜、三萜、五降三萜及少量的非萜類化合物。印度研究人員曾經(jīng)從生長在印度的印 楝植物中分離和鑒定了內(nèi)生真菌(Rajagopal K et al，Current Science, 2000，78，1375 ； Mahesh B et al, Current Science,2005,88, 218 ；Verma VC et al, Microbial Ecology, 2007，54，119)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種分離自中國云南省元江縣印楝(Azadirachtaindica A. Juss)植物活體中具有廣譜的高抗菌活性的微生物菌株_棘孢曲霉。本發(fā)明所述的棘孢曲霉系從中國云南省元江縣印楝植物活體中分離獲得。現(xiàn)在 國家知識產(chǎn)權(quán)局認(rèn)可的保藏單位保藏，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱 CCTCC，保藏單位地址中國，武漢大學(xué)，郵政編碼430072。保藏日期為2010年3月25日， 保藏編號為 CCTCC NO :M2010062o本發(fā)明所述的棘孢曲霉命名為棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus) YM311498，現(xiàn) 保藏在國家知識產(chǎn)權(quán)局認(rèn)可的保藏單位，保藏編號為CCTCC NO :M2010062。該微生物屬于內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征以及分子生物學(xué)ITS rDNA基因序 列分析，確定其分類學(xué)地位屬于半知菌類(Deuteromycotina)曲霉屬(Aspergillus)的棘 孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，菌株編號為 YM311498。棘孢曲霉Aspergillus aculeatus YM 311498在察氏培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)7d后， 菌落直徑達(dá)4. 4cm，質(zhì)地致密，菌落平坦，中央部分土黃色，周圍顏色白黃色背面顏色黃色， 形狀呈不規(guī)則圓形，有溝深陷培養(yǎng)基中。分生孢子結(jié)構(gòu)較多，初為微黃色，老后變深呈土黃 褐色。在PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)7d后，菌落直徑達(dá)4. 7cm, IOd達(dá)4. 8cm,質(zhì)地較薄，中央為 土黃色，四周近白黃色，老后菌落呈土褐色，氣生菌絲較多，背面淡黃色至黃褐色。在麥芽汁 培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)7d，菌落長滿整個培養(yǎng)皿，質(zhì)地致密略呈絮狀，中央部分黃色略帶紅色， 有溝和放射紋出現(xiàn)。以ITS rDNA基因序列同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建形成包括菌株YM 311498在內(nèi)的19株 相關(guān)真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，可知棘孢曲霉YM311498堿基序列相似性為100%，與本屬菌種 Aspergillus aculeatus 無差異。菌株YM 311498的培養(yǎng)基培養(yǎng)特征
①察氏培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)7d，菌落直徑達(dá)4. 4cm,質(zhì)地致密，菌落平坦，中央部分土 黃色，周圍顏色白黃色背面顏色黃色，形狀呈不規(guī)則圓形，有溝深陷培養(yǎng)基中。分生孢子結(jié) 構(gòu)較多，初為微黃色，老后變深呈土黃褐色。②PDA培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)7d，菌落直徑達(dá)4. 7cm, IOd達(dá)4. 8cm,質(zhì)地較薄，中央為土 黃色，四周近白黃色，老后菌落呈土褐色，氣生菌絲較多，背面淡黃色至黃褐色。③麥芽汁培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)7d，菌落長滿整個培養(yǎng)皿，質(zhì)地致密略呈絮狀，中央部 分黃色略帶紅色，有溝和放射紋出現(xiàn)。菌株YM 311498的形態(tài)特征(見

圖1、圖2、圖3、圖4)①無性世代分生孢子梗長，具有足細(xì)胞；分生孢子梗頂端膨大成近球形，頂囊稍 大，半球形，約2/3表面可育，直徑10 14 μ m ；孢囊上生小梗，?；? 2μπιΧ2 3μπι， 分生孢子頭致密直柱狀，顏色顯橙褐色，直徑90 110 μ mX 25 50 μ m ；分生孢子球形，大 小約2. 5 μ m，壁周圍長滿刺，刺長0. 4 0. 5 μ m。分生孢子梗壁在光學(xué)顯微鏡及電鏡下近平滑。②有性世代未發(fā)現(xiàn)。菌株YM 311498的分子生物學(xué)特征采用分子生物學(xué)PCR技術(shù)，DNA序列測定分析，YM 311498菌株ITS rDNA基因組 由543個堿基(bp)組成。以ITS rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，該菌與Aspergillus aculeatus的進(jìn)化距離最近(圖4)。菌株YM 311498的發(fā)酵培養(yǎng)特征①培養(yǎng)基PDB培養(yǎng)基。②培養(yǎng)溫度28 士 2 °C。③發(fā)酵時間5-7天。④發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)第1天，有零星的淡黃色菌絲點(diǎn)出現(xiàn)；培養(yǎng)第3天，發(fā)酵液 中出現(xiàn)黃色的小菌絲球；培養(yǎng)第5天，黃色菌絲球增多且體積增大，有少量菌絲帖壁，發(fā)酵 液顏色變?yōu)辄S色；培養(yǎng)第7天，出現(xiàn)大量的菌絲球，體積也繼續(xù)增大，發(fā)酵液顏色為黃色。菌株YM 311498的發(fā)酵工藝如下菌種一活化一一級種子(PDA培養(yǎng)基)一培養(yǎng)(28士2°C，4-5天)一接種一二級種 子(PDB培養(yǎng)基，搖床200r/min，28士2°C，3-4天)一接種(按5%接種量)一發(fā)酵(PDB培 養(yǎng)基，搖床200r/min，28 士 2 °C，6-7天)一發(fā)酵物。上述發(fā)酵工藝中的發(fā)酵條件如下①發(fā)酵方式液體發(fā)酵。②種子培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的制備取新鮮馬鈴薯200克，去皮切成小塊，加水1升 煮沸30分鐘，過濾，濾液加水補(bǔ)足至1升，加入葡萄糖20克，pH自然。上述培養(yǎng)基中加入15克瓊脂，即為PDA培養(yǎng)基。③發(fā)酵培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)。④培養(yǎng)時間菌種活化培養(yǎng)4-5天，種子搖床培養(yǎng)3-4天，發(fā)酵搖床培養(yǎng)6-7天。⑤培養(yǎng)溫度種子和發(fā)酵培養(yǎng)溫度均為28士2°C。⑥發(fā)酵完畢，加入等體積95%乙醇浸提48小時，過濾，將濾液濃縮至干，加入無菌水制得抗菌發(fā)酵液制品。本發(fā)明所述的菌株YM311498的抗菌活性試驗(yàn)1.病原指示菌見表1。表1抗菌試驗(yàn)指示菌
權(quán)利要求
一種棘孢曲霉，其特征在于命名為棘孢曲霉Aspergillus aculeatusYM311498，現(xiàn)保藏在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCC M2010062。
2.按照權(quán)利要求1所述的棘孢曲霉，其特征是其ITSrDNA基因組由543個堿基組成， 序列如下1CtgggtccttcggggcccaacctcccacccgtgcttaccgtaccctgttgCttCggCggg61cccgccttcgggcggcccggggcctgcccccgggaccgcgcccgccggagaccccaatgg121aacactgtctgaaagcgtgcagtctgagtcgattgataccaatcagtcaaaactttcaac181aatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactaatgtga241attgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccg301gggggcatgcctgtccgagcgtcatttctcccctccagccCCgCtggttgttgggccgcg361CCCCCCCgggggcgggcctcgagagaaacggcggcaccgtccggtcctcgagcgtatggg421gctctgtcacccgctctatgggcccggccggggcttgcctcgacccccaatcttctcaga481ttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggatt5413-CC ο
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種具有廣譜的高抗菌活性的微生物菌株。本發(fā)明所述的棘孢曲霉命名為棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)YM311498，現(xiàn)保藏在國家知識產(chǎn)權(quán)局認(rèn)可的保藏單位，保藏編號為CCTCC NOM2010062。本發(fā)明首次從印楝植物(Azadirachta indica)中分離獲得棘孢曲霉類型的內(nèi)生真菌，在明確具有廣譜抗菌活性的棘孢曲霉YM311498的微生物學(xué)地位的同時，發(fā)現(xiàn)該菌對5種植物病原真菌、3種人體致病真菌、2種革蘭氏陰性細(xì)菌和1種革蘭氏陽性細(xì)菌，共11種病原微生物具有比較明顯的抑制生長作用。本發(fā)明利用植物內(nèi)生真菌資源，通過發(fā)酵獲得農(nóng)用或醫(yī)用新型天然抗菌藥物活性成分。
文檔編號C12N1/14GK101942395SQ20101022850
公開日2011年1月12日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者吳少華, 苗翠蘋, 陳有為 申請人:云南省微生物研究所