專利名稱：水稻rr17啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種水稻RR17啟動子及其應用，尤其涉及一種具有特異表達啟動子 功能的DNA片段及其應用。
背景技術：
植物的根有兩個主要的基本功能從土壤中吸收水份、營養(yǎng)和固定作用。通過對擬 南芥模式植物的研究，人們對調控擬南芥等雙子葉植物根的遺傳因子有了深入的了解。但 水稻等單子葉植物的根系與擬南芥有著本質的區(qū)別。雙子葉植物的生命中起主要作用的是 由胚胎發(fā)育來的主根。而對于水稻，胚胎發(fā)育來的主根只在早期起到重要的作用，種子發(fā)芽 后的幾個星期，莖生根將代替胚胎發(fā)育來的主根起主要作用。從起始的機制來講，莖生根是 胚胎后發(fā)育來的，因此不能通過同源比對的方式從擬南芥中找到莖生根起始需要的基因。細胞分裂素是植物的五大經典激素之一，它調控了植物生長發(fā)育的各個方面。 主要通過對模式植物擬南芥的研究，對細胞分裂素信號轉導途徑已有了部分了解。細 胞分裂素的信號轉導是由一種類似于細菌和酵母中的雙元組份系統(tǒng)(two-component system)介導的，這個系統(tǒng)包括組氨酸激酶(Histidine Kinases, HKs)，磷酸轉運蛋白 (Histidine-Phosphotransfer proteins, HPs)禾口反應調節(jié)因子(Response Regulators, RRs)。在模式植物擬南芥中，ARR(Arabidopsis Response Regulators)是雙元組分系統(tǒng) 的最下游因子，也是其主要功能行使元件?，F(xiàn)在已知的擬南芥ARR基因共有24個。根據 它們序列的相似程度，功能結構域以及對細胞分裂素的反應，可以將ARR大致分為三類即 A 型(10 個，包括 ARR3-ARR9, ARR15-ARR17)、B 型(12 個，包括 ARRl，ARR2, ARR10-ARR14， ARR18-ARR21 和 ARR23)以及非典型的 ARR22 和 ARR24。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種具有特異表達啟動子功能的DNA片段及其應用。本發(fā)明提供的DNA片段(OsRRl7基因啟動子OsRRl7p)，來源于水稻(Oryza sativaL. japonica. cv Nipponbare)，為如下 1)-3)中任一所述的 DNA 分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)所述DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。序 列1由2455個核苷酸組成。上述嚴格條件可為在6 X SSC, 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。含有以上任一所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于 本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體具體為將0SRR17P插入在pC1300-GUS_N0S的PstI和SalI識別位 點間獲得的重組載體，所述PC1300-GUS-N0S為將pBI121經SmaI和EcoRI酶切后得到的小片段插入PCAMBIA1300雙元載體的SmaI和EcoRI識別位點得到的載體。擴增以上任一所述DNA片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述引物對中的一條引物的序列為序列2，另一條引物的序列為序列3。上述DNA片段在使目的基因在植物莖基部節(jié)中的表達中的應用也是本發(fā)明保護 的范圍。上述應用中，所述植物莖基部節(jié)為莖生根的起始部位。上述應用中，所述植物為單子葉植物。上述應用中，所述單子葉植物為水稻。上述DNA片段在植物的遺傳育種中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。所述植物為單子葉植物；所述單子葉植物優(yōu)選為水稻。本發(fā)明的實驗證明，0sRR17基因啟動子0sRR17p可以在水稻莖生根起始特異性表 達，可以用來研究及改善植物根系的發(fā)育和對不同土壤環(huán)境的適應，最終達到提高產量的 目的。對于一些易倒伏的水稻品種，也可以用莖生根特異性表達的啟動子來調控抗倒伏基 因的表達，增加水稻的抗倒伏能力，然而對水稻的葉片和種子品質沒有影響。啟動子的發(fā)現(xiàn) 和其表達模式及功能的闡明，在植物發(fā)育調控和生物技術育種中均具有重要意義，為今后 在植物莖基部節(jié)中特異性表達外源基因提供了新型有效的啟動子或順式元件。本實驗的研究結果表明細胞分裂素抑制了莖生根的起始，由于A型ARR基因家族 的功能特異性可能決定了細胞分裂素調控植物生長發(fā)育信號途徑的專一性，因此通過檢測 水稻細胞分裂素反應調節(jié)因子OsRR的時空表達模式，發(fā)現(xiàn)0sRR17是水稻莖基部節(jié)特異表 達的基因，因此從水稻中克隆出0sRR17基因的啟動子，并通過⑶S報告基因檢測了該啟動 子的時空表達模式，發(fā)現(xiàn)該啟動子在水稻莖生根起始的部位(即莖基部節(jié))特異性表達，因 此該啟動子將為植物代謝的精細調控和生物工程提供強有力的工具，具有重要的理論及現(xiàn)
眉、ο


圖1為細胞分裂素抑制莖生根的起始圖 2 為 OsRRl7 的 RT-PCR 結果圖 3 為 pC1300_0SRR17p: GUS-NOS 質粒圖譜圖4為0sRR17p: :GUS轉基因植物的GUS活性
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。在本發(fā)明的實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Escherichia coli)株系 DH5a ；農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株 EAH105 ；克隆載體 pGEM-T Easy 和連接 酶(Promega)；限制性內切酶(NEW ENGLAND BioLabs)；質粒 pBI121 (Clontech)，雙元載體 pCAMBIA 1300 (Cambia,在T-DNA左右邊界區(qū)內帶有可供植物選擇用潮霉素抗性基因)；水 fSnnft H^Hh (Oryza sativa L. japonica. cv Nipponbare)。實施例1、轉0sRR17p水稻的構建
1、細胞分裂素抑制水稻莖生根的起始/K禾S 品禾中日本晴(Oryza sativa L. japonica. cv Nipponbare ；Fang J. , Chai C. , Qian Q. , Li C. , Tang J. , Sun L. , Huang Ζ. , Guo Χ. , Sun C. , Liu Μ. , Zhang Y. , Lu Q. , Wang Y. , Lu, C, Han B. , Chen F. , Cheng Ζ. , Chu C. (2008)Mutations of genes in synthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to preharvest sprouting and photo-oxidation in rice,Plant Journal, 54 177-189.公眾可從中國科院遺傳與發(fā)育生 物學研究所獲得。)用20%漂白水滅菌20分鐘后，用無菌水沖洗3遍。然后在含有蔗 糖的V2MS培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich公司，Cat# :M5524)上發(fā)芽，植物生長條件為28°C，連 續(xù)光照，光照強度為80-120陽ol ·πΓ2. sec—1。4天后觀察莖生根的生長(圖1A)。通過解剖 發(fā)現(xiàn)莖生根起始于莖基部的節(jié)(Basal node)(圖IB)。當外源施加1 μ M的6-ΒΑ (—種常用 的人工合成細胞分裂素)，可見的莖生根明顯減少(圖1C)，在含有5μΜ 6-ΒΑ的V2MS培 養(yǎng)基上，完全觀察不到莖生根(圖1D)。為了檢測細胞分裂素是否抑制了莖生根的起始，對 莖基部做了半薄切片。在沒有細胞分裂素處理的水稻中，能夠清晰可見莖生根的起始(圖 IF和G中的紅色箭頭)，然而5 μ M細胞分裂素處理后，完全沒有莖生根的起始(圖1Η、I和 J)。圖1為細胞分裂素抑制莖生根的起始，其中解剖圖片中的標尺為0. 5mm，半薄切片中的 標尺為100 μ m。半薄切片水稻的莖基部固定在含有4%戊二醛的PBS過夜，用Leica historesin 包埋后，使用Leica RM6625切片機得到4 μ m的半薄切片，然后通過甲苯胺蘭(0. 1% w/v) 染色，在光學顯微鏡(Olympus BX51)下觀察。2、篩選在莖基部節(jié)中特異表達的細胞分裂素反應調節(jié)因子OsRR引物序列NameIDPrimer sequenceOsRRl7-F L0C_0s04g28120 AGTTCCTCGAAGCTGCAAGAGTGAOsRRl7-RL0C_0s04g28120 AGGCACTACATGACCATCACCACTRNA 提取TRIzol法參照廠商(Invitrogen)提供的使用說明進行。首先預冷研缽、研杵、 1. 5ml離心管和TRIzoI試劑。分別取水稻品種日本晴葉子、主根、側根和莖基部節(jié)組織各 lOOmg，用液氮快速粉碎，轉移至預冷的離心管。加入Iml TRIzol試劑，振蕩混勻。室溫放置 5分鐘，4°C 12000g離心10分鐘。取上清移入新離心管，加入200μ 1氯仿，輕搖混勻。室溫 放置3分鐘，4°C 12000g離心10分鐘。取上層水相移入新管，加入250 μ 1異丙醇和250 μ 1 高鹽沉淀劑(0. 8Μ檸檬酸鈉，1. 2Μ氯化鈉)，室溫放置3分鐘，4°C 12000g離心10分鐘，去除 上清。沉淀用Iml 75%乙醇洗滌，4°C 7500g離心5分鐘，去除上清。沉淀于室溫干燥5_10 分鐘，加入適量(50 μ 1左右)DEPC水溶解(為了有利于RNA溶解，可置于50°C水浴10-30 分鐘)獲得RNA。cDNA 反轉錄cDNA第一鏈的合成(1)取上述提取的RNA 1-2 μ g,加DEPC水至10 μ 1 ；(2)加入 1 μ 1 (0. 5g) Oligo (dT) 15 禾口 1 μ 1 IOmM dNTP,混勻；(3)65 °C，5分鐘，然后放在冰上，快速加入5Xbuffer 4 μ 1，RNAseinhibitor 1 μ 1,0. IM DTT 2μ l,5U/y 1 反轉錄酶 H 0. 5 μ 1 ；(4)反轉錄反應(cDNA第一鏈合成)在PCR儀上進行，使用如下程序先42°C，50 分鐘；再 45°C，10 分鐘；再 50°C，10 分鐘；再 70°C，15 分鐘；(5)反應結束之后快速取出，冰上加入10mg/ml 1μ 1 RNase，然后在37°C放置 30-60分鐘，獲得cDNA。PCR 擴增PCR 反應體系(20μ 1)模板 DNA 1 μ 1 ； 10Xbuffer 2μ 1 ；2. 5mM dNTP 2μ 1 ； 10 μ M primers 2 μ 1 ；超純水 12. 8μ 1 ； 5U/y 1 Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ 1。PCR擴增程序為先94°C預變性2min ；再94°C變性30s，58 °C退火30s，72 °C延長 lmin，循環(huán)數從22到34不等；然后再72°C延長IOmin ；4°C保存。所用PCR 儀型號為 Whatman Biometra T Gradient 96 禾口 MJ PTC-200。結果見圖2，可以看出0SRR17p特異的在莖基部節(jié)中表達。3、轉0SRR17p水稻的獲得提取水稻日本晴幼苗的基因組DNA作為模板，用引物OsRRl7p_F (ctgcagGTGA ATCTCCATCCGTAGTTG,小寫字母為 PstI 酶切位點，序列 2)和 0sRR17p-R (gtcgacGTGTCC TACCCTTTGAGCCA，小寫字母為SalI酶切位點，序列3)PCR擴增，得到的PCR產物連接到 中間載體PGEM-T Easy上，獲得pT_0sRRl7p，經測序，結果為該PCR產物具有序列表中 序列1的核苷酸，大小為2455bp，該PCR產物的基因命名為0sRR17p。同時，用SmaI和 EcoRI對pBI121 (Clontech)雙酶切得到的小片段插入pCAMBIA1300 (Cambia)雙元載體 的SmaI和EcoRI識別位點間得到pC1300-GUS_N0S。然后用PstI和SalI雙酶切上述獲 得的pT-0SRR17p得到的小片段插入pC1300-GUS-N0S的PstI和SalI識別位點間，得到 pC1300-0SRR17p: :GUS_N0S，其質粒結構模式如圖3所示，其中35S_pro指35S CaMV啟動子； Nos-ter為NOS終止子；Hygromycin為潮霉素篩選抗性基因；⑶S為E. coli β -葡萄糖苷酸 酶報告基因。將質粒pC1300-0SRR17p ⑶S-N0S 導入農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) 菌株EAH105 (上海鼎國生物)中，再進行PCR鑒定，引物OsRRl7p_F和OsRRl7p-R，得到 大小為2455bp的片段為含有質粒pC1300-0SRR17p: GUS-NOS的農桿菌，命名為EAH105/ pC1300-0SRR17p: GUS-NOS ；再將 EAH105/pC1300_0SRR17p GUS-NOS 與野生型日本晴的愈 傷組織在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上28°C共培養(yǎng)2天后，愈傷組織轉移到含有50mg/l的潮霉素抗性篩 選培養(yǎng)基中，28°C暗培養(yǎng)14天后，轉到新鮮配制的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選14天。經兩輪篩 選后長出的抗性愈傷組織轉至含有50mg/l潮霉素的分化培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)3天，然后轉 至15h光照條件下培養(yǎng)，30-40天后分化出小苗。將小苗移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周左右移 土繼續(xù)生長，此轉化共獲得5株TO代轉0SRR17p:⑶S水稻。以上涉及的培養(yǎng)基配方如下(I)NB基本培養(yǎng)基 (2)水稻愈傷誘導及繼代培養(yǎng)基 (3)共培養(yǎng)培養(yǎng)基 (4)抗性篩選培養(yǎng)基 (5)水稻分化培養(yǎng)基
(6)水稻生根培養(yǎng)基 5、鑒定經過抗性篩選，鑒定了 5株陽性TO代轉0SRR17p:⑶S水稻。然后對上述獲得的5 株陽性 TO 代轉 0SRR17p: :GUS 水稻進行 PCR 鑒定，引物為 pl300F (5 ‘ATCGGTGCGGGCCTCTTC) 和 0sRR17p-R(5 ‘gtcgacGTGTCCTACCCTTTGAGCCA)，模板為 5 株陽性 TO 代轉 0SRR17p: :GUS 水稻的葉的基因組DNA，得到PCR產物大小為2575bp為陽性植株，又將PCR產物測序分析， 具有序列表中序列1的核苷酸，因此進一步確認獲得5株陽性TO代轉0SRR17p:⑶S水稻。從陽性TO代轉0SRR17p:⑶S水稻收獲種子，播種后獲得Tl代轉0SRR17p:⑶S 水稻，從Tl代轉0SRR17P:⑶S水稻上收獲種子，播種后獲得T2代轉0SRR17p:⑶S水稻純 合系，從T2代轉0SRR17p:⑶S水稻上收獲種子，播種后獲得T3代轉0SRR17p:⑶S水稻純 合系。采用同樣的方法將空載體pC1300-GUS-N0S導入野生型日本晴中，獲得TO代轉空 載體水稻，用上述同樣的方法獲得T3代轉pC1300-GUS-N0S水稻。實施例2、轉OSRRl7p:⑶S水稻⑶S染色分析⑶S染色把10天大小的日本晴和編號為5的T3代轉0SRR17p:⑶S水稻純合株 系的整個幼苗浸泡在⑶S染色液中37°C放置6-12小時，70%乙醇脫色后用體視鏡(Olympus SZX12)進行拍照。以T3代轉pC1300-GUS-N0S水稻水稻和野生型日本晴為對照。GUS 染色液IOOmM 磷酸緩沖液(pH 7. 0)，IOmM EDTA, ImM K4Fe6, ImM K3 (FeCN)6, 0. 1% (v/v) Triton X-100, ImM X-gluc。
結果如圖4所示，通過對10天大小的T3代轉0SRR17p:⑶S水稻的⑶S染色發(fā)現(xiàn)， 只有莖基部節(jié)能被GUS染色(圖4A和B)；進一步徒手解剖發(fā)現(xiàn)GUS染色主要在節(jié)的下部， 即莖生根起始的部位(圖4C)；當從節(jié)上分離一個莖生根時，分離下來莖生根起始部位是能 被⑶S染色的(圖4D)。圖4為轉0sRR17p: :GUS植物的⑶S活性，其中箭頭表示有⑶S活 性的部位。圖中白色標尺為1mm。對野生型日本晴⑶S染色發(fā)現(xiàn)，植株各個組織器官均不能被⑶S染色。綜合以上的結果，說明0sRR17的啟動子能特異的在莖生根起始的部位中表達，并 調控了根的發(fā)育。實施例3、0sRR17啟動子順式作用元件的分析為了更好的了解OsRRl7的啟動子功能，將OsRRl7的啟動子OsRRl7p在PLACE (aDatabase of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements) ±JJ ζ#fflW析。表2 :0sRR17啟動子順式作用元件。

權利要求
DNA片段，為如下1) 3)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)所述DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)中所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。
2.含有權利要求1中所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
3.擴增權利要求1中所述DNA片段的引物對。
4.根據權利要求3所述的引物對，其特征在于所述引物對中的一條引物的序列為序 列2，另一條引物的序列為序列3。
5.權利要求1所述DNA片段在使目的基因在植物莖基部節(jié)中的表達中的應用。
6.根據權利要求5中所述的應用，其特征在于所述植物莖基部節(jié)為莖生根的起始部位。
7.根據權利要求5或6中所述的應用，其特征在于所述植物為單子葉植物。
8.根據權利要求5-7中任一所述的應用，其特征在于所述單子葉植物為水稻。
9.權利要求1中所述DNA片段在植物的遺傳育種中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于所述植物為單子葉植物；所述單子葉植 物優(yōu)選為水稻。全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻RR17啟動子及其應用。本發(fā)明提供的DNA片段，為如下1)-3)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)所述DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。本發(fā)明的實驗證明，OsRR17基因啟動子OsRR17p可以在水稻莖生根起始特異性表達可以用來研究及改善植物根系的發(fā)育和對不同土壤環(huán)境的適應，最終達到提高產量的目的。
文檔編號C12N15/63GK101899442SQ20101023015
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月13日 優(yōu)先權日2010年7月13日
發(fā)明者左建儒, 張健, 梁巖, 謝慶軍 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所