專利名稱：以柑橘皮渣為原料生產(chǎn)乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種以柑橘皮渣為原料，通過酶水解柑橘皮 渣中的纖維素、半纖維素，然后通過酵母菌發(fā)酵柑橘皮渣水解物生產(chǎn)乙醇的方法，即一種以 柑橘皮渣為原料生產(chǎn)乙醇的方法。
背景技術(shù)：
柑橘植物是指蕓香科柑橘亞科柑橘族柑橘亞族真正柑橘組的六屬植物。真正柑橘 組六屬植物果實為典型的柑果。目前，我國種植的柑橘果樹主要有金柑、枳和柑橘三屬植 物。我國是柑橘生產(chǎn)的大國，在19個省(自治區(qū)、直轄市)有柑橘種植分布，其中以福建、 浙江、湖南、湖北、江西、四川、重慶、廣東、廣西種植較多，柑橘產(chǎn)量居世界第三位。近年來， 由于柑橘產(chǎn)量連年增加，銷售壓力進(jìn)一步增大，出現(xiàn)了果農(nóng)“賣橘難”的現(xiàn)象；而將柑橘進(jìn)行 深加工(如榨汁、加工成罐頭等)是解決“賣橘難”問題的有效途徑。在柑橘的深加工過程 中，會產(chǎn)生大量的加工副產(chǎn)物_柑橘皮渣(包括柑橘皮、種子、橘絡(luò)和殘余果肉等)，柑橘皮 渣重量約占柑橘果重的20% -40% ；在柑橘皮渣中纖維素和半纖維素約占50% -60%。目 前，大部分柑橘皮渣未被利用而直接丟棄，既浪費了資源又污染了環(huán)境；加強對廢棄柑橘皮 渣的利用，對于提高柑橘加工企業(yè)的經(jīng)濟效益和減少污染、保護(hù)環(huán)境都具有重要意義。而另一方面，石油等不可再生資源是當(dāng)前最主要的能源物質(zhì)，大量消耗必將導(dǎo)致 快速枯竭，尋找可再生的替代能源，已成為維持社會可持續(xù)發(fā)展的緊迫任務(wù)。生物燃料乙醇 作為一種可再生的新型能源燃料，它的開發(fā)受到了普遍重視。生物燃料乙醇的生產(chǎn)方法根 據(jù)原料區(qū)分有糖類、谷物淀粉類和纖維素類。以谷物淀粉類和糖類為原料，每生產(chǎn)1噸乙 醇，大約需要消耗糧食3噸左右。由于糧食的價格和來源受到限制，導(dǎo)致燃料乙醇的成本居 高不下，嚴(yán)重限制了燃料乙醇工業(yè)的發(fā)展。如能利用大量低成本的纖維素類原料(如廢棄 柑橘皮渣)生產(chǎn)燃料乙醇，則可擴大燃料乙醇的產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本，對于減少環(huán)境污染， 節(jié)約石油資源具有重要意義，并將產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟與社會效益。纖維素是由葡萄糖分子通過β _1，4糖苷鍵連接而成的鏈狀高分子聚合物，其水 解產(chǎn)物是葡萄糖。半纖維素是由多種多糖分子組成的支鏈聚合物，主要成份是木聚糖，其水 解產(chǎn)物是木糖。本發(fā)明是通過酶水解柑橘皮渣的纖維素和半纖維素，利用酵母菌發(fā)酵水解 物生產(chǎn)乙醇。目前，國內(nèi)已有人采用壓榨柑橘皮渣得到榨出液，接種酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。如 饒志明等發(fā)表的文章，“1.饒志明.微生物發(fā)酵法從柑橘皮渣制取乙醇的研究，果樹科學(xué)， 2000,17(1) :31-34·”、“2·饒志明，李文琦，蔡志防等.從柑橘皮中同時制取乙醇和橙皮甙 的新方法，漳州師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，2000，13 (4) =56-60. ”。這兩篇文章報道的方 法都是通過壓榨柑橘皮渣得到榨出液，榨出液中含有葡萄糖、果糖、蔗糖等可發(fā)酵性糖，接 種酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。其美中不足是，柑橘皮渣中大量的纖維素、半纖維素并未得到利 用，僅僅利用柑橘皮中的少量可發(fā)酵性糖，如1500g柑橘皮，經(jīng)壓榨、發(fā)酵后得到的乙醇產(chǎn) 量僅為20mL，乙醇的產(chǎn)率很低，不具備工業(yè)化生產(chǎn)的價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種能將柑橘皮渣中纖維素、半纖維素水解為 葡萄糖、木糖等，然后利用上述的葡萄糖、木糖等水解產(chǎn)物并采用酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方 法，該方法提高了乙醇的產(chǎn)量和產(chǎn)率，適于工業(yè)化生產(chǎn)，同時更加充分的利用了柑橘皮渣， 減少廢棄物的排放，有利于環(huán)境保護(hù)。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種以柑橘皮渣為原料生產(chǎn)乙醇 的方法，其制備步驟如下(1)將柑橘皮渣烘干至水分含量< 5%，然后粉碎，再將粉碎后的柑橘皮渣過100 目篩得到柑橘皮渣粉；(2)將柑橘皮渣粉放入發(fā)酵罐中，加入水，水柑橘皮渣粉的質(zhì)量比為10 30 1，攪拌均勻，調(diào)pH至4.0 6.5 ；以柑橘皮渣粉的質(zhì)量計，添加1.0% 10.0%的水 解用酶，然后將發(fā)酵罐內(nèi)溫度升溫至45 65°C，攪拌水解12 24h ；(3)攪拌水解結(jié)束后，升溫至90 98°C，保持15 25分鐘滅酶；(4)將上述步驟(3)滅酶后的水解液取出離心，離心轉(zhuǎn)速3500 4000r/min，離心 15 20分鐘，然后取上清液；(5)將上述上清液加入發(fā)酵罐中，然后再加入以下物質(zhì)配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，并使得 以下物質(zhì)在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為酵母提取物1. 5 3. 5g/L、蛋白胨2 4g/L、KH2PO4 3 5g/L、(NH4)2SO4 1. 5 3g/L、MgSO4 0. 2 1. 2g/L、CaCl2 0. 1 0. 5g/L ；加入后升溫 至121 125°C，保持15 25分鐘滅菌；(6)將保藏的酵母菌種，接種到種子培養(yǎng)基中，在25 35°C，攪拌速率100 200r/min，培養(yǎng)12 48h，得到酵母菌的種子液；將上述得到酵母菌的種子液按5% 20% (體積比)的比例接入步驟(5)滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后調(diào)pH至4.0 6.0，在培養(yǎng)溫 度25 35°C、攪拌速率0 200r/min的條件下發(fā)酵12 48h ；(7)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液取出離心，離心轉(zhuǎn)速3500 4000r/min，離心15 20
分鐘，取上清液；將上清液進(jìn)行蒸餾、精餾，得到乙醇產(chǎn)品。在本發(fā)明上述步驟(2)的酶解過程中，首先，根據(jù)添加的纖維素酶或木聚糖酶的 最適溫度和最適PH (溫度45 65°C，pH 4. 0 6. 5)，通過溫度探頭、pH探頭和相關(guān)的控制 儀器，用控制加熱裝置的開關(guān)和適當(dāng)?shù)渭铀峄驂A的方法，自動控制溫度和PH保持在纖維素 酶或木聚糖酶的最適值；類似地，在步驟(6)的發(fā)酵過程中，通過同樣的方法自動控制溫度 和PH保持在酵母菌的最適值。本發(fā)明步驟(6)所述的酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克 魯維酵母(Kluyveromyces sp.)、嗜鞋管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、休哈塔 假絲酵母(Candida shehatae)、樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)、季也蒙畢赤酵母 (Pichiaguilliermondii)、酒香酵母(Brettanomyces anomalus)禾口產(chǎn)阮fi絲酵母(Candida Utilis)中的一種或者一種以上。本發(fā)明上述的水解用酶為纖維素酶或木聚糖酶或者上述兩種酶的混合。本發(fā)明步驟(1)將柑橘皮渣烘干至水分含量<5%，采用在60 80°C下烘干16 32h來實現(xiàn)。
本發(fā)明以柑橘皮渣為原料生產(chǎn)乙醇的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和有益 效果1.由于本發(fā)明使用纖維素酶或木聚糖酶水解柑橘皮渣的纖維素或半纖維素，得到 的水解產(chǎn)物中含有大量的葡萄糖或木糖，可被釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或嗜 鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)等酵母菌發(fā)酵利用，生產(chǎn)乙醇，從而克服了現(xiàn)有的 技術(shù)僅僅是壓榨柑橘皮渣得到的榨出液中含有少量的可發(fā)酵性糖，導(dǎo)致最終的乙醇產(chǎn)率很 低的不足。2.由于本發(fā)明在整個酶水解過程和酵母菌發(fā)酵過程中，根據(jù)添加的纖維素酶或木 聚糖酶的最適溫度和最適PH，通過溫度探頭、pH探頭和相關(guān)的控制儀器，用控制加熱裝置 的開關(guān)和適當(dāng)?shù)渭铀峄驂A的方法，自動控制溫度、PH保持在最適值，最大限度發(fā)揮了酶的活 性，提高了纖維素、半纖維素的水解效率；使得水解液中含有大量的葡萄糖或木糖，為酵母 菌進(jìn)行乙醇發(fā)酵提供了充足的底物。采用同樣的方法，可使酵母菌保持在最適發(fā)酵溫度和 最適PH的條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵，有利于提高乙醇的產(chǎn)率，乙醇的產(chǎn)率最佳可達(dá)14. 6g/L。3.本發(fā)明工藝簡便，生產(chǎn)周期短，乙醇產(chǎn)率高，為柑橘皮渣的深加工生產(chǎn)高附加值 產(chǎn)品提供了一條新的途徑。
具體實施例方式下面給出3個優(yōu)選實施例，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實施例。實施例1 將柑橘皮渣在60°C下烘干32h，粉碎機粉碎，過100目篩得柑橘皮渣粉；稱取柑橘 皮渣粉150g，加入2. 85kg水，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH至4. 0,然后加入7. 5g纖維素酶，在溫度 55°C，攪拌水解時間14h，水解結(jié)束后，升溫至95°C，保持25分鐘滅酶；將上述反應(yīng)完畢的 水解液離心，在4000r/min離心分離15分鐘，取上清液；經(jīng)DNS法測定，水解液中葡萄糖濃 度為14.38g/L。將上述上清液加入發(fā)酵罐中，并加入酵母提取物2. 5g/L、蛋白胨3. Og/L、 KH2PO4 5g/L、(NH4)2SO4 2g/L、MgSO4 0. 4g/L、CaCl2 0. 25g/L 配制成發(fā)酵培養(yǎng)基(加入的酵 母提取物、蛋白胨、KH2P04、(NH4)2SO4^MgSO4XaCl2等物質(zhì)的上述含量是指它們在發(fā)酵培養(yǎng)基 中的最終含量，實施例2-3亦同)，然后升溫至121°C，保持20分鐘滅菌；將保藏的釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)接種到種子培養(yǎng)基(YPD)，種子培養(yǎng)基的組成如下葡萄糖 20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L ；然后在25 35°C，攪拌速率100 200r/min，培 養(yǎng)12 48h，得到釀酒酵母的種子液；然后將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的種 子液按5%的比例接入到上述滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后調(diào)pH至5. 0，在培養(yǎng)溫度32°C， 攪拌速率150r/min的條件下發(fā)酵24h ；發(fā)酵完成后，經(jīng)氣相色譜法測定發(fā)酵液中的乙醇濃 度為8. 16g/L。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液取出離心，在離心轉(zhuǎn)速4000r/min下離心15min，取 上清液；將上清液進(jìn)行蒸餾、精餾(蒸餾、精餾為常規(guī)技術(shù))，得到乙醇產(chǎn)品。實施例2 將柑橘皮渣在70°C下烘干24h，粉碎機粉碎，過100目篩得柑橘皮渣粉；稱取柑橘 皮渣粉200g，加入2. 8kg水，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH至5. 0，然后加入IOg木聚糖酶，溫度50°C， 酶解時間20h，水解結(jié)束后，升溫至97°C，保持20分鐘滅酶；將上述反應(yīng)完畢的水解液離 心，4000r/min，20分鐘，取上清液；經(jīng)DNS法測定，水解液中木糖濃度為15. 39g/L。將上述上清液裝入發(fā)酵罐中，并加入酵母提取物2. Og/L、蛋白胨3. Og/L、KH2PO4 4. Og/L、(NH4) S042. 5g/L、MgS040. 8g/L、CaCl20. 4g/L，升溫至121°C，保持22分鐘滅菌；將保藏的嗜鞣管囊 酵母(Pachysolen tannophilus)接種到種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基組成為木糖20g/L，蛋白 胨20g/L，酵母提取物10g/L ；然后在25 35°C，攪拌速率100 200r/min，培養(yǎng)12 48h， 得到嗜鞣管囊酵母的種子液；將嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)的種子液按8 %的比例接入發(fā)酵培 養(yǎng)基，然后調(diào)PH至5. 5，培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速率lOOr/min條件下發(fā)酵16h ；經(jīng)氣相色譜法 測定發(fā)酵液中的乙醇濃度為10. lg/L。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液取出離心，4000r/min，離心 18min，取上清液；將上清液進(jìn)行蒸餾、精餾，得到乙醇產(chǎn)品。實施例3 將柑橘皮渣在80°C下烘干20h，粉碎機粉碎，過100目篩得柑橘皮渣粉；稱取柑橘 皮渣粉300g，加入7. 2kg水，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH至4. 5，然后加入12g纖維素酶和15g木聚 糖酶，溫度50°C，酶解時間24h，水解結(jié)束后，升溫至98°C，保持23分鐘滅酶；將上述反應(yīng)完 畢的水解液離心，4000r/min，18分鐘，取上清液；經(jīng)DNS法測定，水解液中還原糖(包括葡 萄糖和木糖)濃度為25. 2g/L。將上述上清液裝入發(fā)酵罐中，并加入酵母提取物2. 5g/L、蛋 白胨 3. 0g/L、KH2PO4 4. 5g/L、(NH4) S042. 5g/L、MgSO4L 0g/L、CaCl2 0. 3g/L，升溫至 121 °C， 保持25分鐘滅菌；將保藏的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)接種到種子培養(yǎng)基 (YPD)，培養(yǎng)基組成葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L ；然后在25 35°C，攪 拌速率100 200r/min，培養(yǎng)12 48h，得到釀酒酵母的種子液；將保藏的嗜鞣管囊酵母 (Pachysolen tannophilus)接種到種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為木糖20g/L，蛋白胨20g/L， 酵母提取物10g/L ；然后在25 35°C，攪拌速率100 200r/min，培養(yǎng)12 48h，得到嗜鞣 管囊酵母的種子液；將上述的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和嗜鞣管囊酵母 (Pachysolentannophilus)的種子液按10%的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基(兩種酵母種子液的體 積比為1:1)，然后調(diào)pH至5. 0，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速率lOOr/min，發(fā)酵時間48h ；經(jīng)氣相 色譜法測定發(fā)酵液中的乙醇濃度為14. 6g/L。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液取出離心，4000r/min， 離心20min，取上清液；將上清液進(jìn)行蒸餾、精餾，得到乙醇產(chǎn)品。
權(quán)利要求
一種以柑橘皮渣為原料生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，制備步驟如下(1)將柑橘皮渣烘干至水分含量＜5％，然后粉碎，再將粉碎后的柑橘皮渣過100目篩得到柑橘皮渣粉；(2)將柑橘皮渣粉放入發(fā)酵罐中，加入水，水∶柑橘皮渣粉的質(zhì)量比為10～30∶1，攪拌均勻，調(diào)pH至4.0～6.5；以柑橘皮渣粉的質(zhì)量計，添加1.0％～10.0％的水解用酶，然后將發(fā)酵罐內(nèi)溫度升溫至45～65℃，攪拌水解12～24h；(3)攪拌水解結(jié)束后，升溫至90～98℃，保持15～25分鐘滅酶；(4)將上述步驟(3)滅酶后的水解液取出離心，離心轉(zhuǎn)速3500～4000r/min，離心15～20分鐘，然后取上清液；(5)將上述上清液加入發(fā)酵罐中，然后再加入以下物質(zhì)配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，并使得以下物質(zhì)在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為酵母提取物1.5～3.5g/L、蛋白胨2～4g/L、KH2PO4 3～5g/L、(NH4)2SO4 1.5～3g/L、MgSO4 0.2～1.2g/L、CaCl2 0.1～0.5g/L；加入后升溫至121～125℃，保持15～25分鐘滅菌；(6)將保藏的酵母菌種，接種到種子培養(yǎng)基中，在25～35℃，攪拌速率100～200r/min，培養(yǎng)12～48h，得到酵母菌的種子液；將上述得到酵母菌的種子液按5％～20％的比例接入步驟(5)滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后調(diào)pH至4.0～6.0，在培養(yǎng)溫度25～35℃、攪拌速率0～200r/min的條件下發(fā)酵12～48h；(7)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液取出離心，離心轉(zhuǎn)速3500～4000r/min，離心15～20分鐘，取上清液；將上清液進(jìn)行蒸餾、精餾，得到乙醇產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以柑橘皮渣為原料生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述柑橘 是指蕓香科柑橘亞科柑橘族柑橘亞族真正柑橘組的六屬植物的果實。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以柑橘皮渣為原料生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于在步驟(2) 的水解過程中，首先，根據(jù)添加的纖維素酶或木聚糖酶的最適溫度和最適PH，通過溫度探 頭、PH探頭和相關(guān)的控制儀器，用控制加熱裝置的開關(guān)和適當(dāng)?shù)渭铀峄驂A的方法，自動控制 溫度和PH保持在纖維素酶或木聚糖酶的最適值；同樣，在步驟(6)的發(fā)酵過程中，通過同樣 的方法自動控制溫度和PH保持在酵母菌的最適值。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的以柑橘皮渣為原料生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所 述酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克魯維酵母(Kluyveromyces sp.) > 嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、休哈塔假絲酵母(Candida shehatae)、樹干 畢赤酵母(Pichia stipitis)、季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)、酒香酵母 (Brettanomyces anomalus)和產(chǎn)阮假絲酵母(Candida Utilis)中的一種或一種以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以柑橘皮渣為原料生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述的水 解用酶為纖維素酶或木聚糖酶或者上述兩種酶的混合。
全文摘要
本發(fā)明公開一種以柑橘皮渣為原料生產(chǎn)乙醇的方法，步驟如下將柑橘皮渣烘干、粉碎、過篩得到柑橘皮渣粉；將柑橘皮渣粉放入發(fā)酵罐中，加水，調(diào)pH至4.0～6.5，添加水解酶，在溫度45～65℃，攪拌水解12～24h；然后升溫至90～98℃，保持15～25分鐘滅酶；然后離心取上清液加入一定物質(zhì)配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，升溫至121～125℃，保持15～25分鐘滅菌，然后將種子液接入到上述滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后離心取上清液進(jìn)行蒸餾、精餾，得到乙醇產(chǎn)品。本發(fā)明采用柑橘皮渣生產(chǎn)乙醇的方法，提高了乙醇的產(chǎn)量和產(chǎn)率，適于工業(yè)化生產(chǎn)，同時更加充分的利用了柑橘皮渣，減少廢棄物的排放，有利于保護(hù)環(huán)境。
文檔編號C12R1/645GK101914578SQ20101023320
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月21日
發(fā)明者武玉學(xué), 王強, 靳挺 申請人:浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院