專利名稱：鑒別轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)的pcr檢測(cè)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種鑒別轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)的PCR方 法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國(guó)是轉(zhuǎn)基因作物的主要種植國(guó)家之一，2009年轉(zhuǎn)基因作物種植總面積位居全球 第六位。目前我國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物包括轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花、抗木瓜環(huán)斑病 毒的轉(zhuǎn)基因番木瓜等。其中，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉是我國(guó)種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物，2009年 種植面積達(dá)370萬(wàn)公頃，占我國(guó)棉花種植總面積的近70%。南農(nóng)6號(hào)是南京農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所選育的轉(zhuǎn)基因抗蟲雜交棉組合。2005年通過 國(guó)家農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定并定名(審定編號(hào)國(guó)審棉2005016)，并申請(qǐng)國(guó)家植物新 品種保護(hù)(公告號(hào)為CNA002866E)。截止2008年，轉(zhuǎn)基因棉南農(nóng)6號(hào)獲得了湖南、河南、江 蘇、江西、浙江等5省的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，示范、推廣315萬(wàn)畝(張?zhí)煺妫?高產(chǎn)、雄性不育化制種的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲雜交棉“南農(nóng)6號(hào)”的示范推廣，《中國(guó)科技成果》 2008年12期)。目前在我國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)了多個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花品種的商業(yè)化種植，開發(fā)快速、特 異的檢測(cè)方法來鑒別不同的轉(zhuǎn)基因品種，對(duì)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)和轉(zhuǎn)基因安全的監(jiān)管都顯得十分 必要和緊迫。目前，PCR技術(shù)是轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。在應(yīng)用這種技術(shù)進(jìn)行 轉(zhuǎn)基因作物定性檢測(cè)時(shí)，根據(jù)其擴(kuò)增的靶標(biāo)區(qū)域和特異性將其分為四類一、篩選檢測(cè)，以 轉(zhuǎn)基因通用的外源啟動(dòng)子和終止子為靶標(biāo)區(qū)域；二、基因特異性檢測(cè)，以特異的外源目的基 因?yàn)榘袠?biāo)區(qū)域；三、構(gòu)建特異性檢測(cè)，以轉(zhuǎn)基因元件之間的特異構(gòu)建為靶標(biāo)區(qū)域；四、轉(zhuǎn)化 體特異性檢測(cè)，以轉(zhuǎn)化體特異性片段(外源插入片段與受體基因組連接區(qū)域)為靶標(biāo)區(qū)域。 這四類檢測(cè)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)特異性是逐漸增加的，轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)是目前對(duì)轉(zhuǎn) 基因品系檢測(cè)特異性最高的檢測(cè)方法，也是目前轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中最常用的身份檢測(cè)方法，這 種檢測(cè)方法甚至能夠區(qū)分同一轉(zhuǎn)化載體產(chǎn)生的不同轉(zhuǎn)化植株品系。目前我國(guó)批準(zhǔn)種植的棉花品種中，僅M0N531和GK12的轉(zhuǎn)化體特異性序列和轉(zhuǎn)化 體特異性檢測(cè)方法已經(jīng)有報(bào)道，而轉(zhuǎn)基因棉南農(nóng)6號(hào)的轉(zhuǎn)化體特異性序列和轉(zhuǎn)化體特異性 檢測(cè)方法尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述領(lǐng)域中的空白，提供了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)的轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測(cè) 方法，該P(yáng)CR方法利用普通的PCR儀器、試劑快速準(zhǔn)確鑒別出轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)，以及 以南農(nóng)6號(hào)為親本的棉花品系?！N鑒別轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)的PCR檢測(cè)方法，其特征在于PCR正向引物依據(jù) SEQ IDN0. 1所示核苷酸序列的1-449位堿基序列設(shè)計(jì)，反向引物依據(jù)SEQ ID NO. 1所示核 苷酸序列的450-2247位堿基序列設(shè)計(jì)，擴(kuò)增靶標(biāo)為正反向引物序列在SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列上的識(shí)別位置之間的核苷酸序列。所述正向引物為NN6-F1 5 ‘-AACTGTAATGACTCCGCGCA-3，，所述反向引物為NN6-R1 5 ‘-GACGGGCAACACTAATTAAGAC-3，，擴(kuò)增區(qū)域位于 SEQID N01的274-514位，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為241bp。所述PCR檢測(cè)方法在鑒別南農(nóng)6號(hào)以及以南農(nóng)6號(hào)為親本的棉花品種上的應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明人通過Genome walking方法擴(kuò)增獲得了南農(nóng)6號(hào)的轉(zhuǎn)化體特異性 序列，如SEQ ID NO. 1所示，所謂轉(zhuǎn)化體特異性序列指南農(nóng)6號(hào)這個(gè)轉(zhuǎn)基因品系所唯一擁有 的序列，這種唯一性由外源轉(zhuǎn)化載序列以及外源轉(zhuǎn)化載體在宿主基因組的特定插入位置決 定。在轉(zhuǎn)基因過程中，外源基因可能插入到宿主基因組的很多個(gè)位置，外源基因插入位置不 同將得到不同的轉(zhuǎn)基因品系，即得到不同的轉(zhuǎn)化體特異性。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)化體特異性序 列的5’端1 449bp為外源轉(zhuǎn)化載體序列，3’端450-2247bp位置為宿主棉花的基因組序 列?；谵D(zhuǎn)化體特異性片段與轉(zhuǎn)基因品系的一一對(duì)應(yīng)性，通過在該特異性序列上設(shè)計(jì)引物， 正向引物設(shè)計(jì)在1 449bp位置，反向引物設(shè)計(jì)在3’端450 2247bp位置，采用這對(duì)正反 向引物對(duì)待測(cè)品系的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是一種檢測(cè)未知棉花品系是否是南農(nóng)6號(hào)及其 子代的有效手段。在檢測(cè)中，由于設(shè)計(jì)的正反向引物的正確靶標(biāo)序列就是其設(shè)計(jì)所依據(jù)的 轉(zhuǎn)化體特異性序列，即SEQ ID NO. 1，即事先已經(jīng)非常清楚引物在靶標(biāo)序列上的識(shí)別位置和 靶標(biāo)序列片段長(zhǎng)度，因此能夠預(yù)先計(jì)算出擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)該為多長(zhǎng)，當(dāng)某個(gè)待測(cè)品系的基因組 擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)相應(yīng)長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段時(shí)，說明該品系就是南農(nóng)6號(hào)或者以南農(nóng)6號(hào)為親本的 棉花品種。本發(fā)明的核心貢獻(xiàn)在于獲得并向公眾提供了南農(nóng)6號(hào)的轉(zhuǎn)化體特異性序列，基于 其與轉(zhuǎn)基因品系的一一對(duì)應(yīng)性，提供了其在檢測(cè)南農(nóng)6號(hào)上的應(yīng)用，即根據(jù)其設(shè)計(jì)特異性 引物來鑒別待測(cè)品系是否是南農(nóng)6號(hào)或其子代，根據(jù)一段已知序列采用引物常規(guī)設(shè)計(jì)規(guī)則 來設(shè)計(jì)擴(kuò)增該段序列的引物，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是普遍掌握的常規(guī)技能，本發(fā) 明的檢測(cè)方法不限于采用哪一對(duì)特異性引物，不同的人根據(jù)SEQ ID NO. 1及本發(fā)明的檢測(cè) 方法中提供的引物設(shè)計(jì)思路可能會(huì)設(shè)計(jì)出不同的引物對(duì)，但都是基于本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化體 特異性序列SEQ ID NO. 1所示的序列這個(gè)前提，因此都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。發(fā)明人同 時(shí)也提供了采用一對(duì)自己設(shè)計(jì)的特異性引物NN6-F1/NN6-R1進(jìn)行檢測(cè)的方法。由于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)是我國(guó)目前廣泛種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品系之一，因此 本發(fā)明為特異性鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)提供了便利，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、靈敏度 高、特異性好、所需實(shí)驗(yàn)條件不高，因此有非常高的實(shí)用價(jià)值。


圖1轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)轉(zhuǎn)化體特異性序列的Genome Walking擴(kuò)增M :DNA Marker DL2000 ； 1-4 :DL1_DL4 的 Walking 產(chǎn)物圖2轉(zhuǎn)基因棉南農(nóng)6號(hào)轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測(cè)結(jié)果M :DNA Marker DL2000 ；1 空白對(duì)照，2 南農(nóng)6號(hào)，3-12 10個(gè)市場(chǎng)棉花樣品
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork :Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001)中所述的條件，或按照儀器或者試劑制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)轉(zhuǎn)化體特異性序列的克隆1實(shí)驗(yàn)材料1.1植物材料轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)(生廠商江蘇神農(nóng)大豐種業(yè)科技有限公司)，是現(xiàn)有品 種，記載在《現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技(上半月刊)》2005年08期的“南農(nóng)6號(hào)栽培技術(shù)要點(diǎn)”一文中， 本實(shí)驗(yàn)室也有保存，自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)，可向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證試驗(yàn)。1. 2酶與試劑分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker等購(gòu)自大連寶生物工 程有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公 司合成。1. 3實(shí)驗(yàn)儀器PCR 擴(kuò)增儀Mastercycle gradient (Eppendorfco.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA測(cè)序儀(Applied Biosystem377型全自動(dòng)熒光序列分析儀)DNA 電泳分析系統(tǒng)Kodak EDAS 290 (Kodak co.)其它儀器包括離心機(jī)，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。2實(shí)驗(yàn)方法和過程2. 1棉花基因組DNA提取與檢測(cè)2. 1. 1棉花基因組DNA提取取子葉期的幼嫩棉花葉片做為DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout試劑盒(天 澤基因公司)的操作手冊(cè)，進(jìn)行棉花材料總DNA的提取。2.1.4DNA 檢測(cè)取5iU提取的DNA溶液，以0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)其亮度和帶型來初步判 斷提取DNA的質(zhì)量。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提取的DNA的濃度和純度。2. 2Genome walking分離轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)的轉(zhuǎn)化體特異性序列Genome walking也是一種擴(kuò)增已知序列旁側(cè)未知區(qū)域序列的方法，主要步驟為 基因組DNA酶切、與接頭連接、兩次巢式PCR擴(kuò)增等。本實(shí)施例采用Genome walking的 方法獲得了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)的轉(zhuǎn)化體特異性序列。具體步驟參照Genome Walker Universal Kit (Takara大連公司)試劑盒說明，本實(shí)施例進(jìn)行了部分改進(jìn)，主要操作步驟 如下。2. 2. 1基因組DNA酶切分別用Dral、StuI、Pvu II和EcoR V酶切南農(nóng)6號(hào)基因組DNA，標(biāo)記為DL1 DL4。酶切體系為基因組 DNA(0. lug/uL),25uL;10X 酶切 Buffer，10 y L ；內(nèi)切酶(10U/ u L), 8 u L ；ddH20，57 u L ；總體積100 u L。37°C溫浴2h，取出離心管，低速離心5 10s，繼 續(xù)溫浴16 18h。各取5 y L進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)酶切是否完全。
2. 2. 2純化酶切產(chǎn)物按回收試劑盒說明書純化酶切產(chǎn)物。2. 2. 3連接反應(yīng)連接反應(yīng)體系純化的酶切產(chǎn)物，4 iiL ；接頭(25iiM)，1.9iiL ;10X連接Buffer， 1. 6u L ； T4DNA 連接酶(6U/ u L) ,0. 5u L ； ddH20,8 u L ；總體積 16 u L。混合反應(yīng)液，16°C溫浴過夜，然后70°C變性5min。每管加入72yL ddH20，混 勻，-20°C保存?zhèn)溆谩?. 2. 4PCR 反應(yīng)Genome Walking共需要兩輪PCR反應(yīng)，其PCR的反應(yīng)體系見表1。表1反應(yīng)體系(ii L) 兩輪PCR擴(kuò)增的程序見表2。表2 Genome Walking 擴(kuò)增程序 2. 2. 5序列測(cè)定和分析
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0. 8 %的瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳，采用QIAquick Gel Extraction kit 回收擴(kuò)增片段，連接到 pGEM-T easy (Promega，Madison，Wis.)，采用 ABI PRISM 1300 Genetic Analyzer進(jìn)行序列測(cè)定。采用軟件vector NTI10. 0 (Invitrogen)對(duì)測(cè)定的序列 進(jìn)行拼接和分析。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)中用BLASTN檢索相 似的基因組序列。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3. 1轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)轉(zhuǎn)化體特異性序列測(cè)定南農(nóng)6號(hào)的Genome Walking以轉(zhuǎn)化載體序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物NN6-WP1和 NN6-WP2 (表3)，分別進(jìn)行第一輪和第二輪PCR擴(kuò)增，結(jié)果在第4泳道獲得約2200bp大小的 擴(kuò)增條帶(圖1)。經(jīng)序列測(cè)定擴(kuò)增的條帶大小為2247bp。表 3 Genome Walking 弓丨物 3. 2轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)轉(zhuǎn)化體特異性序列分析將獲得的2247bp序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，其中l(wèi)_449bp為轉(zhuǎn)化載體序列， 450-2247bp為棉花基因組序列。實(shí)施例2.本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體特異性PCR方法應(yīng)用于鑒別轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)1實(shí)驗(yàn)材料1. 1植物材料轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)10個(gè)棉花材料，購(gòu)自市場(chǎng)。1. 2酶與試劑分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、Marker等購(gòu)自大連寶生物生物工程 有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任 公司合成。1. 3實(shí)驗(yàn)儀器PCR 擴(kuò)增儀Mastercycle gradient (Eppendorf co.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA 電泳分析系統(tǒng)Kodak EDAS 290 (Kodak co.)其它儀器包括離心機(jī)，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。2實(shí)驗(yàn)方法和過程2. 1棉花基因組DNA提取與檢測(cè)見實(shí)施例1中2. 1棉花基因組DNA提取與檢測(cè)。2. 2鑒別轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)的轉(zhuǎn)化體特異性PCR方法本發(fā)明的PCR方法應(yīng)用于鑒別棉花樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品系南農(nóng)6號(hào)。采用引物NN6-F1/NN6-R1組合(序列見表4)，檢測(cè)購(gòu)自市場(chǎng)的10個(gè)棉花樣品，見圖2。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)能特異性擴(kuò)增出預(yù)期的241bp的產(chǎn)物，檢測(cè)的10個(gè)市 場(chǎng)樣品中均未能擴(kuò)增獲得相同大小的片段?？寺∧限r(nóng)6號(hào)的擴(kuò)增片段，按實(shí)施例1中“2. 2. 5序列測(cè)定和分析”進(jìn)行序列分析。 序列分析結(jié)果表明，擴(kuò)增片段序列與序列SEQ ID NOl的274-514位完全一致。檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明提供的PCR方法能很好地鑒別出棉花樣品中是否含有轉(zhuǎn)基 因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)。PCR 反應(yīng)體系為0. 25 μ L rTaq (5U/ μ L)，5 μ L 10XPCR Buffer (Mg2+Plus)，4 μ L dNTP (各2. 5mM)，引物各2 μ L(IOyM),模板各2 μ L(20ng/ μ L)，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積至 50 μ L0擴(kuò)增程序?yàn)?4 V預(yù)變性4min ；94 V變性30sec，52 °C退火30sec，72 V延伸 30sec，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0表4鑒別轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)的轉(zhuǎn)化體特異性PCR引物
權(quán)利要求
鑒別轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)的PCR檢測(cè)方法，其特征在于PCR正向引物依據(jù)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的1 449位堿基序列設(shè)計(jì)，反向引物依據(jù)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的450 2247位堿基序列設(shè)計(jì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR檢測(cè)方法，所述正向引物為NN6-F1 5 ‘-AACTGTAATGACTCCGCGCA-3，，所述反向引物為 NN6-R1 5 ‘-GACGGGCAACACTAATTAAGAC-3，， 擴(kuò)增區(qū)域位于SEQ ID NO. 1的274-514位，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為241bp。
3.權(quán)利要求1或2所述PCR檢測(cè)方法在鑒別南農(nóng)6號(hào)以及以南農(nóng)6號(hào)為親本的棉花品 種上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明“鑒別轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)的PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用”，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)的PCR檢測(cè)方法，其特征在于PCR正向引物依據(jù)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的1-449位堿基序列設(shè)計(jì)，反向引物依據(jù)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的450-2247位堿基序列設(shè)計(jì)。能利用普通的PCR儀器、試劑快速準(zhǔn)確鑒別出轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)，以及以轉(zhuǎn)基因抗蟲棉南農(nóng)6號(hào)為親本的棉花品系。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101899513SQ20101023389
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者孫爻, 彭于發(fā), 蘇長(zhǎng)青, 謝家建 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所