專利名稱：一種復(fù)合型肝臟內(nèi)定向基因轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝病基因醫(yī)療領(lǐng)域，尤其涉及一種復(fù)合型肝臟內(nèi)定向基因轉(zhuǎn)移載體構(gòu) 建方法。
背景技術(shù)：
在世界范圍內(nèi)，肝硬化已成為僅次于心腦血管病和惡性腫瘤的重大疾病，對(duì)人類 危害極大。我國(guó)每年肝硬化病人逾100萬(wàn)，而且治療效果不佳，病人一旦進(jìn)入失代償期，5年 生存率極低。各種病因所引起的慢性肝病絕大多數(shù)都存在肝纖維化，其中25% -40%最終 發(fā)展為肝硬化及至肝癌，而且，肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段，能否將 病變終止于肝纖維化階段甚至逆轉(zhuǎn)至正常，是治療肝病的關(guān)鍵。但在實(shí)際工作中，對(duì)肝纖維 化治療仍缺乏有效辦法，積極尋找肝纖維化治療的新方法，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義與社會(huì)意 義。目前的研究證實(shí)，在肝纖維化的發(fā)病機(jī)制中，有兩方面的因素起主要作用，一是肝 細(xì)胞的損傷，二是肝星狀細(xì)胞(HSC)的過(guò)度活化。針對(duì)肝纖維化發(fā)病過(guò)程中肝細(xì)胞損傷和HSC過(guò)度活化這兩種主要病因，以及肝細(xì) 胞生長(zhǎng)因子(HGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β KTGF-β 1)這兩種細(xì)胞因子在肝纖維化中的重要作 用，許多學(xué)者利用HGF和TGF-β 1這兩種基因，用基因治療的方法進(jìn)行肝纖維化治療的實(shí)驗(yàn) 研究。但這些治療方法都有一定的欠缺，首先都是選用單一的治療基因，其治療效果難 以令人滿意，目前研究結(jié)果提示肝臟內(nèi)HGF與TGF-β 1平衡遭受破壞是誘發(fā)肝纖維化的 一個(gè)重要因素，已如上述，TGF-β 1可看作是與肝纖維化相關(guān)的最強(qiáng)有力的細(xì)胞因子，它可 使纖維組織積累并抑制其分解系統(tǒng)。于肝硬化組織，可以證實(shí)TGF-β 1有過(guò)剩表達(dá)，而HGF 卻反而表達(dá)低下。在反復(fù)發(fā)生的肝損害，作為重要的肝損傷修復(fù)因子本應(yīng)高表達(dá)的HGFjP 因某種原因而低下，從而導(dǎo)致肝纖維積累。曾有報(bào)告TGF-β 1可以抑制HGF mRNA表達(dá)，這 可能是HGF表達(dá)低下的原因。另?yè)?jù)Ueki等的研究，又已確認(rèn)HGF則能抑制TGF-β 1表達(dá)。 在生理狀態(tài)下，HGF和TGF-β 1可能互輔相成共同調(diào)節(jié)以抑制炎癥與調(diào)整再生，而因炎癥持 續(xù)等機(jī)制造成這一平衡破壞時(shí)，即可導(dǎo)致纖維組織趨于積累而形成肝纖維化。針對(duì)這一狀 況，我們聯(lián)合應(yīng)用了反義TGFi3 1和正義HGF基因進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，恢復(fù)受損傷肝臟內(nèi)HGF與 TGF-β 1平衡關(guān)系，以期在修復(fù)肝細(xì)胞損傷的同時(shí)又能抑制肝星狀細(xì)胞的過(guò)度活化，希望收 到理想的療效。另外目前肝臟基因治療中常用的轉(zhuǎn)染載體肝特異性差，轉(zhuǎn)染率低，影響了療效。目 前常用的肝細(xì)胞及肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)基因方法主要有1、采用病毒載體法如腺病毒、腺病毒相關(guān) 病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，2、非病毒載體法如脂質(zhì)體，去唾液酸一聚賴氨酸(ASoR-PL)復(fù)合體 等。3、單純cDNA質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)導(dǎo)法等。三者比較，病毒載體基因轉(zhuǎn)染效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但體 內(nèi)應(yīng)用宜導(dǎo)致受體補(bǔ)體介導(dǎo)的抗病毒免疫排斥反應(yīng)，從而影響其反復(fù)體內(nèi)應(yīng)用，及表達(dá)效 率與表達(dá)時(shí)間。另外其定向性差，安全性也一直受到關(guān)注；非病毒載體，具有安全、可反復(fù)體內(nèi)應(yīng)用，易與其他抗體結(jié)合、增加定向性的優(yōu)點(diǎn)，但其基因轉(zhuǎn)移效率較病毒載體低；質(zhì)粒與 cDNA直接注入法最為簡(jiǎn)單，便于使用，但較前二者其基因轉(zhuǎn)移效率最低表達(dá)時(shí)間最短。因此現(xiàn)有技術(shù)存在缺陷，需要改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的復(fù)合型肝臟內(nèi) 定向基因轉(zhuǎn)移載體。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種復(fù)合型肝臟內(nèi)定向基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟Al，腺病毒HGF， asTGF^ 1載體構(gòu)建；A2，甲殼糖包裹pAdV. CMV-HGF-asTGF β 1納米微囊病毒載體復(fù)合體構(gòu) 建；A3，納米微囊-pAdV. CMV-HGF-asTGF^ 1復(fù)合體外包被去唾液酸糖蛋白AsOR。所述的構(gòu)建方法，所述步驟Al具體執(zhí)行以下操作采用腺病毒質(zhì)粒，pAd.CMV及 目標(biāo)基因質(zhì)粒PCL-HGF，PCBL-asTGFβ 1，經(jīng)酶切連接，重組構(gòu)建pAd. CMV-HGF-asTGFβ 1 腺病毒LacZ，Luciferase gene轉(zhuǎn)染載體；經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，擴(kuò)增，提?。凰貌糠謕Ad. CMV-HGF-asTGF^ 1質(zhì)粒，與含白蛋白啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的缺陷型pJM17重組，產(chǎn)生完整的病 毒基因組DNA，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)行AdV病毒包裝后，提取pAdV. CMV-HGF-asTGF β 1。所述的構(gòu)建方法，所述步驟Α2具體執(zhí)行以下操作0. 02%甲殼糖，NaAcHoAc液 +pAdV. CMV-HGF-asTGF β 1，lug/ml PSS 溶液，混勻后加入 NHS-PEG-MAL，MW2000, SSA-PEGMW 5000及PBS溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)，加氨酸終止反應(yīng)，再加巰基化轉(zhuǎn)鐵蛋白，室溫下形成納米 微囊pAdV. CMV-HGF-asTGF β 1混懸液，進(jìn)行超速離心提取凍干提純納米微囊病毒載體復(fù)合 體；所得納米微囊PAdV. CMV-HGF-asTGF β 1復(fù)合體，經(jīng)PBS液稀釋；Pincocreen法測(cè)定其 DNA包載量；激光散射法測(cè)定其直徑、大小后，待用。所述的構(gòu)建方法，所述步驟A3具體執(zhí)行以下操作從豬血清中提取AsOR，再AsOR 與Poly-L-lysine混合，利用復(fù)合納米微囊壁所含的轉(zhuǎn)鐵蛋白，將AsOR-PL與轉(zhuǎn)鐵蛋白按 Wangner 氏法交聯(lián)，經(jīng)純化獲得 AsOR-PL-Nanosphere-pAdV. CMV-HGF-asTGF β 1 復(fù)合體。本發(fā)明結(jié)合了病毒基因載體與非病毒基因載體的優(yōu)點(diǎn)，利用納米微囊 (Nanosphare)及去唾液酸糖蛋白-多聚賴氨酸(AsOR-PL)載體技術(shù)，通過(guò)納米微囊包裹病 毒基因載體，并在其外包被去唾液酸糖蛋白_多聚賴氨酸(AsOR-PL)，正常肝細(xì)胞膜上有十 分豐富的去唾液酸糖蛋白受體(ASG)，每個(gè)肝細(xì)胞約有50萬(wàn)個(gè)供結(jié)合位點(diǎn)。ASG受體能特 異性的識(shí)別血中的去唾液酸糖蛋白。另外本發(fā)明還將白蛋白啟動(dòng)子重組入腺病毒載體，賦 予腺病毒載體以肝細(xì)胞特異表達(dá)的特性，從而建立一種新的復(fù)合型肝臟內(nèi)定向基因轉(zhuǎn)移載 體。以期減低病毒基因載體的免疫源性，提高非病毒基因載體轉(zhuǎn)基因效率及定向性。


圖1為本發(fā)明構(gòu)建方法的技術(shù)路線圖；圖2為體內(nèi)注射納米微囊質(zhì)粒的動(dòng)物肝組織熒光顯微鏡照片；圖3為納米微囊包裹復(fù)合型基因轉(zhuǎn)移載體抗肝纖維化試驗(yàn)光學(xué)顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1納米微囊復(fù)合體的制備方法一)目的基因的獲取1.HGF基因的獲取1. 1 總 RNA 的抽提及 RT-PCR從-80°C冰箱中取出預(yù)先保留的包膜完整人胎肝lg，按RNA抽提試劑盒 說(shuō)明書(shū)方法-步抽提出總RNA，并放入-20°C冰箱備用。應(yīng)用Primer分析軟件對(duì) HGF序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)1對(duì)PCR引物引物F 5~ CCGGCTTGCAACATTCTT3~ ；引物R 5~TGCTTCAAATACACTGGCCTCTTCTA3~。按以下順序加樣10mmoL/L buffer 1 μ L，25mmoL/L 氯 it^ 2 μ L, lOmmoL/L dNTPl μ L, Rnase 0. 2 μ L, RtaseO. 2 μ L, TagO. 2 μ 弓 L F 0. 4μ L, 引物 R 0. 4 μ L,總 RNA 3. 6 μ L,DEPC ddH201. 0 μ L。合計(jì)總體積 10 μ L。反應(yīng)條件-M°C 50 秒，54°C60秒，72°C90秒。擴(kuò)增35輪。以抽提肝組織RNA為對(duì)照組，以擴(kuò)增產(chǎn)物為實(shí)驗(yàn)組 進(jìn)行電泳分析，對(duì)所得擴(kuò)增產(chǎn)物行膠回收，膠回收按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1. 2轉(zhuǎn)化大腸桿菌取30μ L已經(jīng)準(zhǔn)備好的感受態(tài)質(zhì)粒，加入3μ L PCR產(chǎn)物，在冰水中輕輕旋轉(zhuǎn) 30min,然后42°C熱擊45秒，冰浴3min，加入250 μ L NZY,于37°C 225 250r/min搖床復(fù)蘇 lh。吸取150 μ L轉(zhuǎn)化物，鋪已經(jīng)備好的LB平板，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 48h。挑選生長(zhǎng)良 好的菌落，加入500mL LB培養(yǎng)基中搖菌24h。取出pUC18質(zhì)粒的LB培養(yǎng)液，8000r/min離 心2min，抽提質(zhì)粒，用Xba I回收得到2. 2kb的DNA片段，用Nru I和PvuII雙酶切pcDNA3， 回收約1. Okb的DNA片段，將這2個(gè)片段連接得質(zhì)粒pUD(約3. 3kb)。用Ava II和Ssp I 雙酶切PUD，回收約2. 7kb的DNA片段，另用AVR II酶切pEGFP-Nl，回收約1. Ikb的DNA片 段，該片段含有完整的卡那霉素基因，連接2個(gè)回收DNA片段得質(zhì)粒pUDK (約3. 8kb)。然后 將目的基因克隆至PUDK載體的多克隆位點(diǎn)，獲得攜帶目的基因的重組質(zhì)粒載體。2.正反義TGFi3 1基因的獲取2. ITGF β 1基因目的片段的獲得根據(jù)TGF β 1的cDNA序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別有EcoR I和HindIII的酶切位點(diǎn)， 兩對(duì)引物序列相同，但它們兩端所掛酶切位點(diǎn)相反，其中第一對(duì)引物TGFi3 I-Fl, Rl的酶切 位點(diǎn)與pcDNA3. 1(—)的多克隆酶切位點(diǎn)順序相同，而另一對(duì)引物TGF β 1_F2，R2與其方向 相反。以胎腦cDNA為模板，PCR擴(kuò)增TGFM目的片段，PCR反應(yīng)條件96°C預(yù)變性4min， 95°C變性20s，66°C退火30s，72°C延伸90s，32個(gè)循環(huán)，再72°C延伸lOmin。用電洗脫法回 收純化兩個(gè)PCR產(chǎn)物。分別命名為T(mén)GF β 1-1和TGF β 1_2，兩個(gè)PCR產(chǎn)物片段大小一致，均 有EcoR I和III酶切位點(diǎn)，但方向相反。2. 2中介重組體T-TGF β 1-1和TGF β 1-2的構(gòu)建將兩個(gè)純化的PCR產(chǎn)物末端加“Α”后，用Τ4連接酶將它們分別連接于T載體，轉(zhuǎn) 化JM109，提取質(zhì)粒后用EcoR I和Hind III雙酶切鑒定并測(cè)序證實(shí)目的片段無(wú)突變，得到 兩個(gè)中介重組體。分別命名為T(mén)-TGF^ 1-1和T-TGF^ 1_2。2. 3 表達(dá)重組體 pcDNA3. 1 (-) -TGF β 1 及 pcDNA3. 1 (-) -anti TGF β 1 的構(gòu)建
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用EcoR I 和 Hind III 重新切下T-TGF β 1-1 和 T-TGF β 1-2 質(zhì)粒內(nèi) TGF β lcDNA，定 向連接于已用EcoR I和Hind III雙酶切線性化的pcDNA3. 1㈠中，然后轉(zhuǎn)化JM109，提取 質(zhì)粒，用菌液PCR和EcoR I和Hind III雙酶切鑒定得到兩個(gè)表達(dá)重組體。由于TGFi^ 1-2 的酶切位點(diǎn)方向與載體的兩個(gè)酶切位點(diǎn)方向相反，故連接所得者為反義TGFi3 1質(zhì)粒，即 pcDNA3. l(-)-anti TGF^ 1，而TGF3 1-1的酶切位點(diǎn)方向與載體相同，故連接所得為正義 TGF β 1質(zhì)粒。二 )腺病毒載體的制備1.腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建取出pUC18質(zhì)粒的LB培養(yǎng)液，8000r/min離心2min，抽提質(zhì)粒，用Xba I回收得到 2. 2kb的DNA片段，用Nru I和Pvu II雙酶切pcDNA3，回收約1. Okb的DNA片段，將這2個(gè) 片段連接得質(zhì)粒PUD(約3. 3kb)。用Avail和Ssp I雙酶切pUD，回收約2. 7kb的DNA片 段，另用AVRII酶切pEGFP-Nl，回收約1. Ikb的DNA片段，該片段含有完整的卡那霉素基因， 連接2個(gè)回收DNA片段得質(zhì)粒pUDK (約3. 8kb)。然后將目的基因克隆至pUDK載體的多克 隆位點(diǎn)，獲得攜帶目的基因的重組質(zhì)粒載體。用BamH I和HindIII雙酶切pcDNA3LacZ后。 回收大小約3. Okb的DNA片段，將其插入至pUDK載體的BamHI和HindIII位點(diǎn)，獲得含目 的基因Shuttle-CMV質(zhì)粒。2.制備含目的基因的pAdEasy-Ι質(zhì)粒載體取4只無(wú)菌的1. 5mL的離心管(分別標(biāo)記為a，b，c, d)和0. 2cm的電轉(zhuǎn)化杯， 在冰上預(yù)冷；取適量的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，于冰上融化；向每個(gè)離心管中加入40μ L左 右的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞。在a管中，加入lyL(lmg/L)線性化的去磷酸化的含目的基因 Shuttle-CMV質(zhì)粒和1 μ L (100 μ g/L)超螺旋的pAdEasyl質(zhì)粒載體，輕輕混勻后置于冰上放 置；在b管中，加入1 μ L(lg/L)線性化的去磷酸化的ShuttLe-CMV-LacZ和1 μ L(100 μ g/ L)超螺旋的pAdEasy-Ι質(zhì)粒載體，輕輕混勻后置于冰上放置；在C管中，加入1 μ L(lg/L) 線性化的去磷酸化的空白的shuttle載體和1 μ L(100 μ g/L)超螺旋的pAdEasy-1質(zhì)粒載 體，輕輕混勻后置于冰上放置(該杯為陰性對(duì)照作為穿梭載體的背景對(duì)照用)；在d管中， 加入lyL(0. 01yg/L)的pUC18對(duì)照質(zhì)粒。調(diào)節(jié)電轉(zhuǎn)化儀，電擊參數(shù)200 Ω、5kV、25 μ F ； 將離心管稍適離心，將管中的菌液與DNA轉(zhuǎn)至相應(yīng)的電轉(zhuǎn)化杯中；電擊；電擊完畢后，迅速 取出電轉(zhuǎn)化杯，立即加入ImL無(wú)菌的LB培養(yǎng)基，用pipetman吹吸混勻。將菌液轉(zhuǎn)至15mL FaLcon 2095管中；于37°C 225 250r/min搖床復(fù)蘇Ih ；重組反應(yīng)及對(duì)照反應(yīng)的菌液(a， b，C 3管)，取一定的稀釋度(如50、100、250、60(^1^等)，分別涂布于2 5塊1^-1^11平 板；pUC18質(zhì)粒轉(zhuǎn)化組，僅作為感受態(tài)效率測(cè)試的對(duì)照，取10 100 μ L涂布于LB-Amp平板 中；取一些感受態(tài)細(xì)胞涂布于LB-Kan平板，作為菌體空白對(duì)照；37°C培養(yǎng)過(guò)夜。3.轉(zhuǎn)染 HEK-293 細(xì)胞從重組(pShuttLe-CMV加目的基因)實(shí)驗(yàn)平板和重組對(duì)照(pShuttLe-CMV-LacZ) 平板上，分別挑選10個(gè)或更多的很小的克隆，加入3 5mL LB-kanamycin培養(yǎng)基中，37°C、 225 250r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜。取2mL或更多的培養(yǎng)過(guò)夜的培養(yǎng)基小量提取DNA，最終 得到的DNA的體積為50 μ L，DNA用Tebuffer或者滅菌的dH20重懸。用Pac I酶切10 μ L 小量提取的DNA，完全消化后在0. 8%的TAE瓊脂糖凝膠上電泳，證實(shí)已經(jīng)得到目的基因的 DNA片段；在1只EP管中加入50 μ L的上述DNA，另加入450 μ L的不含血清DMEM培養(yǎng)基，輕
6輕混勻；在另1只EP管中加入450mL的不含血清DMEM培養(yǎng)基，再加入7 μ L脂質(zhì)胺，混勻； 然后，將2只EP管液體混勻，37°C水中溫浴20min。最后將上述液體加入用不含血清DMEM 培養(yǎng)基潤(rùn)洗1遍的HEK-293細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并放人37°C、225 250r/min搖床。4.收集病毒原種及擴(kuò)增6h后在上述HEK-293細(xì)胞中加入含12%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基。Id后在熒光顯微 鏡可看見(jiàn)細(xì)胞有綠色熒光，4 5d小心更換1次培養(yǎng)基，盡量避免HEK-293細(xì)胞懸浮；然后 繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 5d。待觀察到有大量細(xì)胞發(fā)生懸浮時(shí)，用吸管輕柔的上下吹打直到 細(xì)胞完全懸浮。將細(xì)胞懸液移入戴螺旋帽的離心管中，低速離心分離細(xì)胞。去除并保留上 清，用0. 5mL的滅菌PBS重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到已經(jīng)滅菌的細(xì)胞保存管中，低速離心分離細(xì)胞， 去除上清后再用新鮮的0. 2mL PBS重懸細(xì)胞。將細(xì)胞保存管密封放人液氮罐中5min后，取 出放入37°C水中均勻搖動(dòng)3min，使管中液體完全融化。重復(fù)上述過(guò)程共4次，最后將保留 培養(yǎng)基上清及細(xì)胞裂解液混勻，得到病毒原液。在感染前24h，更換HEK 293細(xì)胞培養(yǎng)基， 待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞覆蓋率為50 70%時(shí)，將上述過(guò)程所得到的病毒原液ImL加入50mL的培 養(yǎng)瓶中，再放入37°C、225 250r/min搖床中2h ；再加入含12%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基。2d 后在熒光顯微鏡可看見(jiàn)細(xì)胞有綠色熒光，4 5d后可收集細(xì)胞，用吸管輕柔的上下吹打直 到細(xì)胞完全懸浮。將細(xì)胞懸液移人戴螺旋帽的離心管中，低速離心分離細(xì)胞。去除并保留 上清，用ImL的保留上清液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到已經(jīng)滅菌的細(xì)胞保存管中，將細(xì)胞保存管密 封放人液氮罐中5min后，然后在37°C水中均勻搖動(dòng)3min，使管中液體完全融化。重復(fù)上述 過(guò)程共4次，最后將保留培養(yǎng)基上清及細(xì)胞裂解液混勻。這一過(guò)程重復(fù)4 5次后可獲得 1 X IO10 1 X IO1VmL含目的基因的腺病毒載體。此載體可以在-80°C的條件下保存1年。三)納米微囊復(fù)合體的制備1大腸桿菌(DH5a)感受態(tài)的制備1. 1接種一個(gè)單菌落于30mL LB培養(yǎng)液中，于37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜(250rpm/min)。1. 2向一個(gè)300mL的燒瓶中加入IOOmL LB培養(yǎng)液，再加入ImL過(guò)夜培養(yǎng)液，于37°C 搖床培養(yǎng)至A590為0. 375。1. 3將培養(yǎng)液分裝到2個(gè)50mL預(yù)冷無(wú)菌的聚丙烯管中，立即冰浴10-15min，然后 4°C，4000g 離心 IOmin01. 4棄去培養(yǎng)液，將離心管倒置于濾紙上，使殘留液流盡。細(xì)胞沉淀用IOmL冰冷的 0. IMCaCL溶液重懸，冰上放置30min，于4°C 4000g離心lOmin。1. 5棄去培養(yǎng)液，將離心管倒置于濾紙上lmin，加入冰冷的0. IMCaCL溶液4mL重 懸，然后加入30%體積的甘油分狀于與冷的無(wú)菌聚丙烯管，立即凍存于-70°C。2. VR 1255-Luc i ferase，EGFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(TOP 10)感受態(tài)。2. UflOyL VR1255-Luciferase，EGFP 質(zhì)粒加入-個(gè) 15mL 的無(wú)菌圓底試管中， 并放置于冰上，然后將盛有感受態(tài)大腸桿菌(T0P10)的管子握在手上使菌液融化，立即將 200mL感受態(tài)大腸桿菌加入管中，混勻后置于冰上30min。2. 2將管放入42°C水浴l-2min進(jìn)行熱休克，然后加入SOOuL LB培養(yǎng)液(無(wú)抗生 素)試管中，于37°C置滾筒式搖床(250g)培養(yǎng)45min，然后4000g離心5min，棄去上清，留 100uL-200uL涂于含氨芐青霉素的平板上，于37°C培養(yǎng)12_16h。3. pCMVLuc VR1255質(zhì)粒、綠色熒光蛋白基因(EGFP)的少量制備(質(zhì)粒提取試劑
7盒)3. 1在細(xì)菌沉淀中加入250ul Pl液，震蕩至徹底懸浮。3. 2加入250uL p2液，立即溫和顛倒離心管5_10次混勻，室溫靜止4分鐘。3. 3加入250ulP3液，立即溫和顛倒離心管5_10次混勻。3. 4浮120009-130009離心lOmjn，將上清液小心移入吸附柱，離心15秒，倒掉收
集管中的液體，將吸附柱放入同-個(gè)收集管中。3. 5在吸附柱中加入500ul Bl液，離心15秒，倒掉收集管中的液體，吸附柱放入
同-個(gè)收集管中。3. 6在吸附柱中加入500uL Wl液，離心15秒，倒掉收集管中的液體，吸附柱放入
同-個(gè)收集管中。3. 7吸附柱中加入500UIW1液，靜止1分鐘，離心15秒，倒掉收集管中的液體，吸附 柱放入同-個(gè)收集管中。3. 8離心1分鐘。3.9將吸附柱放入-個(gè)干凈的1.51^離心管中，在吸附膜中央加入501^ Tl液，室 溫靜置1分鐘后，離心1分鐘，將1. 5mL離心管(DNA溶液)-20°C保存。Pl :50mM Tris/HCL+RNase A 10mg/mL P2 1 % SDS,0. 2M NaOH P3:4M 鹽酸胍， 0. 75MKAc pH4. 6B1 中和液B2 洗滌液Wl 洗滌液(用時(shí)加入96mL無(wú)水乙醇，充分混勻) Tl =Tris緩沖液4.限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)BamH I 0. 5uL,HindIII 0. 5uL,BufferK luL，BSA luL,pCMVLuc VR1255質(zhì)粒7uL， 37°C反應(yīng)2小時(shí)。快速純化DNA片段。20uL體積反應(yīng)體系如下DNA0. 2-lugIOX 酶切 buffer2. OuL限制性內(nèi)切酶l_2u(單位)加ddH20 至20uL限制性內(nèi)切酶最后加入，輕輕混勻，稍加離心，放置于最適溫度水浴并按所需的時(shí) 間溫育，一般為37°C水浴消化Ihr。1).用于回收酶切片段時(shí)，反應(yīng)總體積可達(dá)50-200UL，各反應(yīng)組分需相應(yīng)增加。2).多種酶消化時(shí)若緩沖液條件相同，可同時(shí)加入；否則，先做低溫或低鹽的酶消 化，再做高溫或高鹽的酶消化。3).酶切結(jié)束時(shí)，加入0. 5M EDTA(ρΗ8. 0)使終濃度達(dá)10mM，以終止反應(yīng)?；?qū)⒎?應(yīng)管在65°C水浴放置IOmin以滅活限制性內(nèi)切酶活性。4).如消化反應(yīng)體積過(guò)大，電泳時(shí)加樣孔盛不下，可加以濃縮終止反應(yīng)后，加入 0. 6體積的5M乙酸銨(或1/10體積3M NaAc)和2倍體積無(wú)水乙醇，在冰上放置5min，然 后于4°C離心12000gX5min。傾去含大部分蛋白質(zhì)的上清液。于室溫晾干。DNA沉淀后溶于 適量 TE 中(ρΗ7· 6)。5).如要純化消化后的DNA，可用等體積酚/氯仿(1 1)和氯仿各抽提-次，再
用乙醇沉淀。
6).電泳檢測(cè)取質(zhì)粒酶切產(chǎn)物適量，加適當(dāng)Loading buffer混勻上樣，以未經(jīng)酶切的質(zhì)粒或/ 和酶切的空載體(如有)作對(duì)照，采用l-5V/cm的電壓，使DNA分子從負(fù)極向正極移動(dòng)，至 合適位置取出置紫外燈下檢測(cè)，攝片。(L)挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，接種于2. OmL LB (含相應(yīng)抗生素)液體 培養(yǎng)基中，37°C、250g振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(約12-14hr)。(2).取1. 5mL培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000gxlmin，棄上清，將離心管倒
置，使液體盡可能流盡。(3).將細(xì)菌沉淀重懸于IOOuL預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。(4).力卩200uL新鮮配制的溶液II，顛倒數(shù)次混勻(不要?jiǎng)×艺袷?，并將離心管放 置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解(溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清)。(5).加入150uL預(yù)冷的溶液III，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見(jiàn)白色絮狀沉淀，可在 冰上放置3-5min。溶液III為中和溶液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性， 形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。(6).加入450uL的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4°C離心12000gX10min。(7).小心移出上清于-新微量離心管中，加入2. 5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻， 室溫放置 2-5min，4°C離心 12000gxl5min。(8). ImL預(yù)冷的70 %乙醇洗滌沉淀1-2次，4°C離心8000gx7min，棄上清，將沉淀在
室溫下晾干。(9).沉淀溶于 20uL TE (含 RNase A 20ug/mL)，37 "C 水浴 30min 以降解 RNA 分 子，-20°C保存?zhèn)溆谩?.質(zhì)粒含有熒光素酶基因的pCMVLuc VR1255內(nèi)含人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子 (CMV)及綠色熒光蛋白基因(EGFP)，在DH5a中擴(kuò)增，以堿裂解法分離，以氯化艷梯度離心法 純化，大量制備質(zhì)粒DNA參照QIAGEN Giga質(zhì)粒提取純化試劑盒，調(diào)整濃度為lmg/mL，-20°C 保存?zhèn)溆谩?. Branched PEI (B-PEI 或 PEI)的制備 1. 154g PEI (25000)以 15. 18mL 0. 12mol PL磷酸鹽緩沖液(pH7. 12)溶解。于此溶液中加入1. 154g乳糖，0. 1527g氰基硼氫化鈉。反 應(yīng)液于37°C保溫。于不同時(shí)間間隔取2mL反應(yīng)液，以凝膠柱層析分離，以0. ILmoLPL碳酸氫 按溶液洗脫，收集所需洗脫組分，冰凍干燥。7. ΡΕΙ-DNAXhitosan-DNA,復(fù)合物的制備取等體積的PEI滴加于DNA溶液中，邊加 邊振蕩混合，配成20ugDNA的濃度，無(wú)菌過(guò)濾。Chitosan 0. 02% Chitosan SoLution 將-定 量的Chitosan用醋酸溶解過(guò)夜，加入NaAc至終濃度為25mM，用NaOH調(diào)PH至5. 7，加無(wú)菌 去離子水至Chitosan的終濃度為0. 02%，再用0. 22 μ m的無(wú)菌微孔濾器過(guò)濾除菌，室溫保 存。用50mM的Na2S04溶液配制不同濃度的DNA溶液，用時(shí)取含合適DNA量的該溶液，同 0. 02%的Chitosan溶液-起先分別加熱至55°C后，迅速將等體積的兩種溶液混合后，立即 置漩渦振蕩器上(2500rpm)混懸30Sec，產(chǎn)物置室溫30min以進(jìn)-步促進(jìn)顆粒的形成。復(fù)合 物溶液置4°C備用。8.檢測(cè) chitosan-DNA、PEI-DNA 的粒子大小及 zeta 電位(mv)，應(yīng)用 Zetasizer3000檢測(cè)儀測(cè)量納米微囊復(fù)合物的粒子大小及zeta電位。
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9. Chitosan-DNA, PEI-DNA 及質(zhì)粒 DNA 的穩(wěn)定性，將 Chitosan-DNA、PEI-DNA 復(fù)合 體及質(zhì)粒DNA與不同體積的新鮮大鼠血清或膽汁，及作為對(duì)照的生理鹽水混合，在37°C保 溫。不同時(shí)間間隔取出-定量的樣品，以肝素解離出游離的DNA，在溴化乙錠存在下以 瓊脂糖凝膠電泳分析法測(cè)定DNA的降解情況。實(shí)施例2納米微囊肝定向基因轉(zhuǎn)移的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)納米微囊是一種新型的非病毒載體，具有無(wú)毒性、無(wú)免疫原性和相對(duì)靶向性等優(yōu) 點(diǎn)，有結(jié)合、濃縮DNA及將DNA高效導(dǎo)入各種細(xì)胞的能力。體外顯示無(wú)明顯細(xì)胞毒性。殼聚 糖能與質(zhì)粒DNA有效地結(jié)合成納米微囊，并使其免受DNase的降解，對(duì)質(zhì)粒DNA具有一定程 度的保護(hù)作用。半乳糖改性的殼聚糖可作為肝細(xì)胞的靶向基因釋放載體，選用半乳糖基化 殼聚糖(GC)，即在殼聚糖分子結(jié)構(gòu)上修飾以半乳糖配體，通過(guò)半乳糖配體與肝細(xì)胞上特異 性的去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)結(jié)合而起到肝定向基因轉(zhuǎn)移作用。1材料和方法1. 1 材料質(zhì)粒pEGFP-Nl購(gòu)于Clonetech公司。瓊脂精購(gòu)于上海生工公司。DNA Marker為 MBI公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶購(gòu)于TaKaRa公司。質(zhì)粒大量提取試劑盒(Qiagen Endo-Free Giga Kits為Qiagen公司產(chǎn)品。半乳糖基化殼聚糖，由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科實(shí) 驗(yàn)室構(gòu)建保存。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640，Lipofectamine TM2000脂質(zhì)體購(gòu)于Gibco。乙酸鈉 和硫酸鈉為分析純。1. 2 方法1. 2. 1殼聚糖-DNA復(fù)合物(納米微囊)的制備1)0. 02%殼聚糖的配制將一定 量的殼聚糖用乙酸溶解過(guò)夜，加入乙酸鈉至終濃度25mM，用NaOH調(diào)PH至5. 7，加無(wú)菌去離 子水至殼聚糖的終濃度為0. 02%，再用0. 22 μ m的無(wú)菌微孔濾器過(guò)濾除菌，室溫保存。2) 將500 μ L質(zhì)粒DNA溶液(2mg/mL)溶于4. 5mL 50mM的硫酸鈉中，與等體積(5mL) 0. 02 %的 殼聚糖溶液混合后，立即置漩渦振蕩器上(2500rpm)混懸30s，產(chǎn)物置室溫30min，進(jìn)一步促 進(jìn)顆粒的形成。復(fù)合物溶液置4°C保存。3)納米微囊瓊脂糖凝膠電泳。分別將納米微囊、 質(zhì)粒DNA與上樣緩沖液混合；在含EB的瓊脂凝膠中加樣，80V電壓下電泳約40min ；紫 外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)照相。1. 2. 2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8只狗隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組注射質(zhì)粒納米微囊， 對(duì)照組僅注射裸質(zhì)粒。2)手術(shù)前Id經(jīng)小隱靜脈注射氯化釓(14mg/kg)，清除KupfTer細(xì)胞。 3)碘伏消毒術(shù)區(qū)，逐層開(kāi)腹，解剖肝動(dòng)脈并注射納米微囊(或裸質(zhì)粒)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受 注射的質(zhì)粒含量為lmg。4) 36h后處死動(dòng)物，取肝組織，作冰凍切片。置于熒光顯微鏡下，觀 察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果體內(nèi)注射納米微囊質(zhì)粒的動(dòng)物肝組織在熒光顯微鏡下觀察，參見(jiàn)圖2，圖中可見(jiàn)肝 組織有較強(qiáng)的黃綠色熒光，說(shuō)明肝組織有較多的綠色熒光蛋白表達(dá)。而裸質(zhì)粒注射組肝組 織無(wú)綠色熒光蛋白表達(dá)。實(shí)施例3納米微囊包裹復(fù)合型基因轉(zhuǎn)移載體抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究
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1.小鼠肝纖維化模型的建立采用二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，參照 Alakkod (Biochen J，1987，244 :75_79)方法，用 0.9% (w/v) NaCl 將 DMN 稀釋到 0. 05% (ν/ ν)濃度，取2ml以0. 05% DMN/kg大鼠體重(10 μ L DMN/kg大鼠體重)的劑量腹腔注射，每 日1次，每周連續(xù)3天，共4周。取組織進(jìn)行光鏡及電鏡觀察行病理組織學(xué)鑒定。2.基因轉(zhuǎn)染AsOR-PL-Nanosphere-pAdV. CMV-HGF 及 pAdV. CMV-asTGF β 1 禾口 pAdV. CMV-HGF-asTGF β 1肝臟內(nèi)定向轉(zhuǎn)移研究。選用近交系大鼠及小鼠，隨機(jī)分組采用麻醉，手術(shù)方法方式，分別經(jīng)門(mén)靜脈，肝 動(dòng)脈，膽道，注入 AsOR-PL-Nanosphere-pAdV. CMV-HGF 及 pAdV. CMV-asTGF β 1 和 pAdV. CMV-HGF-asTGF β 1復(fù)合體。于術(shù)后1小時(shí)、24小時(shí)、3天、1周、3周、5周定期活雜受體動(dòng)物， 取肝、脾等等腹腔內(nèi)其它臟器組織及外周血。經(jīng)β-gal染色、Luciferase光密度檢測(cè)、熒 光顯微鏡觀察，免疫組化，PCR、Nerthern-Blot等方法，檢測(cè)LacZ、GFP及Luciferase標(biāo)志 基因表達(dá)與目標(biāo)蛋白合成。比較不同攝入途徑對(duì)肝臟內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的影響。⑶C、ELASA等方 法檢查受體抗病毒免疫反應(yīng)。3.抗纖維化效應(yīng)的鑒定同等條件下飼養(yǎng)各組小鼠，定期進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)、原位雜交及小鼠生存期鑒定抗 纖維化效應(yīng)?；虮磉_(dá)情況檢測(cè)用RT-PCR檢測(cè)肝組織中HGF、TGF- β ImRNA表達(dá)情況，Western 印跡方法檢測(cè)HGF、TGF-β 1表達(dá)情況，肝組織中HGF、TGF-β 1免疫組化方法檢測(cè)HGF、 TGF-β 1蛋白表達(dá)及定位，ELISA方法測(cè)定血清中HGF、TGF-β 1水平變化。肝組織形態(tài)學(xué)觀察對(duì)組織切片進(jìn)行染色觀察，肝纖維化病理學(xué)分級(jí)參照中華醫(yī) 學(xué)會(huì)病毒性肝炎防治方案(中華傳染病雜志，1995，13 241-247)標(biāo)準(zhǔn)分為四級(jí)。用光學(xué)顯 微鏡觀察肝組織細(xì)微病理變化，參見(jiàn)附圖3，其中Α、B、C、D為未轉(zhuǎn)染納米微囊包裹復(fù)合型 基因轉(zhuǎn)移載體的對(duì)照組肝組織切片，可見(jiàn)肝纖維化改變。圖Ε、F、G、H為轉(zhuǎn)染納米微囊包裹 復(fù)合型基因轉(zhuǎn)移載體的實(shí)驗(yàn)組肝組織切片，分別為轉(zhuǎn)染納米微囊包裹復(fù)合型基因轉(zhuǎn)移載體 3、6、9、12周以后的肝組織切片，其中圖G、H可見(jiàn)肝纖維化明顯改善。血清學(xué)指標(biāo)ALB檢測(cè)應(yīng)用自動(dòng)生化分析儀；ALT、AST檢測(cè)采用賴氏法；透明質(zhì)酸 (HA)、層粘蛋白(LN)和III、IV型膠原檢測(cè)采用放免法。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種復(fù)合型肝臟內(nèi)定向基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟Al，腺病毒HGF，asTGF β1載體構(gòu)建；A2，甲殼糖包裹pAdV.CMV HGF asTGFβ1納米微囊病毒載體復(fù)合體構(gòu)建；A3，納米微囊 pAdV.CMV HGF asTGFβ1復(fù)合體外包被去唾液酸糖蛋白AsOR。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟Al具體執(zhí)行以下操作采 用腺病毒質(zhì)粒，pAd. CMV及目標(biāo)基因質(zhì)粒PCL-HGF，PCBL-asTGF^ 1，經(jīng)酶切連接，重組構(gòu) 建pAd. CMV-HGF-asTGF β 1腺病毒LacZ，Luciferase gene轉(zhuǎn)染載體；經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌， 擴(kuò)增，提?。凰貌糠謕Ad. CMV-HGF-asTGF β 1質(zhì)粒，與含白蛋白啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的缺陷型 PJMl7重組，產(chǎn)生完整的病毒基因組DNA，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)行AdV病毒包裝后，提取pAdV. CMV-HGF-asTGFβ 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟Α2具體執(zhí)行以下操作 0. 02 % 甲殼糖，NaAcHoAc 液 +pAdV. CMV-HGF-asTGF β 1，lug/ml PSS 溶液，混勻后加入 NHS-PEG-MAL,MW2000, SSA-PEG MW5000及PBS溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)，加氨酸終止反應(yīng)，再加 巰基化轉(zhuǎn)鐵蛋白，室溫下形成納米微囊pAdV. CMV-HGF-asTGF β 1混懸液，進(jìn)行超速離心提 取、凍干提純納米微囊病毒載體復(fù)合體；所得納米微囊PAdV. CMV-HGF-asTGF β 1復(fù)合體，經(jīng) PBS液稀釋；Pincocreen法測(cè)定其DNA包載量；激光散射法測(cè)定其直徑、大小后，待用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟A3具體執(zhí)行以下操作從 豬血清中提取AsOR，再AsOR與Poly-L-lysine混合，利用復(fù)合納米微囊壁所含的轉(zhuǎn)鐵蛋 白，將AsOR-PL與轉(zhuǎn)鐵蛋白按Wangner氏法交聯(lián)，經(jīng)純化獲得AsOR-PL-Nanosphere-pAdV. CMV-HGF-asTGF β 1 復(fù)合體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種復(fù)合型肝臟內(nèi)定向基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟A1，腺病毒HGF，asTGFβ1載體構(gòu)建；A2，甲殼糖包裹pAdV.CMV-HGF-asTGFβ1納米微囊病毒載體復(fù)合體構(gòu)建；A3，納米微囊-pAdV.CMV-HGF-asTGFβ1復(fù)合體外包被去唾液酸糖蛋白AsOR。建立一種新的復(fù)合型肝臟內(nèi)定向基因轉(zhuǎn)移載體。以期減低病毒基因載體的免疫源性，提高非病毒基因載體轉(zhuǎn)基因效率及定向性。
文檔編號(hào)C12N15/861GK101921807SQ201010234139
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者何勇, 周峻, 周景師, 岳樹(shù)強(qiáng), 曹大勇, 李海民, 王德盛, 竇科峰, 趙威, 陳勇 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)