專利名稱：文昌魚富含亮氨酸蛋白alm基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及文昌魚富含亮氨酸蛋白ALM基因及其編碼的蛋白ALM,以及該蛋白在 制備治療感染性疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
文昌魚(Branchiostoma Japonicum)屬于脊索動(dòng)物門(Chordate)，頭索動(dòng)物亞門 (〇印11￡110(^(^(1￡1切)，是脊椎動(dòng)物“姐妹群”(5丨計(jì)吐Group)頭索動(dòng)物亞門的代表動(dòng)物，其形 態(tài)與脊椎動(dòng)物相似，具有脊椎動(dòng)物的一些共同特征。大量數(shù)據(jù)表明，現(xiàn)存的文昌魚雖然不是 現(xiàn)代脊椎動(dòng)物的直接祖先，但是它和脊椎動(dòng)物的直接祖先相似，在從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng) 物的進(jìn)化過程中，具有非常重要的位置。文昌魚獨(dú)特的進(jìn)化地位使其成為人們研究免疫學(xué) 的一個(gè)重要對(duì)象，近年來的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少具有重要意義的免疫基因。作為蛋白質(zhì)的一個(gè)重要組分，氨基酸的重復(fù)越來越引起人們的重視，尤其是真核 生物的蛋白質(zhì)。人們第一次認(rèn)識(shí)那種重復(fù)結(jié)構(gòu)是在富含亮氨酸的α 2-糖蛋白中，因此被命 名為富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)重復(fù)(Leucine-Rich r印eat，LRR)。自那以后，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)越來越 多的具有不同功能的蛋白質(zhì)也存在這種LRR結(jié)構(gòu)。LRR通常由20-29個(gè)氨基酸且含有保守 的11個(gè)氨基酸的基本序列所構(gòu)成，這11個(gè)氨基酸的基本序列是L#L*L**N(C)*L(*可以是 任何氨基酸，L的位置也可以為亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸，N可以為天冬酰胺、 絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸，C為絲氨酸和半胱氨酸)。除了這11個(gè)氨基酸外，其他的氨基 酸表現(xiàn)屢可變。第一個(gè)LRRs的三維晶體結(jié)構(gòu)是在核糖酶抑制劑中發(fā)現(xiàn)的，LRRs在整個(gè)蛋 白中是一種結(jié)構(gòu)單元，每一個(gè)單元由一個(gè)β鏈以一個(gè)環(huán)與α螺旋相接，這種結(jié)構(gòu)使得所有 鏈都螺旋圍繞著公共軸旋轉(zhuǎn)而呈現(xiàn)平行結(jié)構(gòu)，從而最終形成了非球形的馬蹄結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu) 內(nèi)部為平行的β折疊，外部則為螺旋結(jié)構(gòu)。LRR參與許多重要的生命活動(dòng)，如激素-受體的的相互作用、酶的抑制、細(xì)胞粘附 和細(xì)胞內(nèi)的交通。近來研究也證實(shí)LRR蛋白參與早期哺乳動(dòng)物的發(fā)育、神經(jīng)的發(fā)育、細(xì)胞的 極化、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡。研究還顯示LRR結(jié)構(gòu)域?qū)?xì)胞骨架的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)起著 十分重要的作用。在以上所有的功能中，LRR結(jié)構(gòu)域都可能是通過介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的相 互作用來實(shí)現(xiàn)。除了提供細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用外，這種重復(fù)結(jié)構(gòu)還有利于快速產(chǎn)生新 的突變，如植物的抗病和細(xì)菌的毒力，因?yàn)槠溥M(jìn)化非常快。研究顯示，一系列的人類疾病與 編碼含LRR的蛋白的基因突變有關(guān)。這種突變至今報(bào)道的主要有兩種類型典型的和核糖 酶抑制劑型。這些突變很可能影響其與配體親和性的改變或不同蛋白的其他結(jié)構(gòu)域的相互 作用，有時(shí)還可能引起功能的喪失，這些規(guī)律對(duì)引導(dǎo)我們進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)和治療疾病具有重 要的參考價(jià)值。植物基因組水平上存在的大量抗病基因(Resistance Gene, R基因)可使之在生 長(zhǎng)發(fā)育過程中抵抗病原微生物的侵染。R基因同病原微生物的致病基因存在著基因?qū)?(Gene for Gene)的遺傳學(xué)關(guān)系。目前已從11種植物中克隆了 30余個(gè)R基因，這些基因絕 大多數(shù)編碼了植物信號(hào)傳導(dǎo)途徑的相關(guān)蛋白。在上述克隆的R基因中，至少有25個(gè)屬于帶有富含亮氨酸的重復(fù)序列和核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(LRR-NBS)的基因家族。LRR-NBS類抗病基因 作為植物抗病基因中分布最廣和數(shù)量最大的一個(gè)基因家族，其作用日益受到人們關(guān)注。擬 南芥測(cè)序計(jì)劃完成后，分析它的基因組，發(fā)現(xiàn)其中有近200個(gè)NBS-LRR類抗病基因。研究表 明，LRR結(jié)構(gòu)域與直接或間接的病原相互識(shí)別有關(guān)。有證據(jù)支持單一的LRR的氨基酸空間 結(jié)構(gòu)可以參與蛋白質(zhì)識(shí)別。通過對(duì)文昌魚基因組全序列進(jìn)行比較基因組學(xué)分析顯示大約有6600個(gè)LRR模序 結(jié)構(gòu)其編碼約1776個(gè)富含LRR的蛋白存在于文昌魚的基因組中。我們同時(shí)也用smart soft 和tmhmm soft對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的一些物種的基因組進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)(Homo sapiens, Mus musculus, Takifugu rubripes, Xenopus tropicalis, Gallus gallus, Drosophila melanogaster, Danio rerio, Ciona intestinalis 禾口 Caenorhabditis elegans 自 ensembl, Arabidopsis thaliana 來自 tigr, Branchiostoma Floridae 來自 JGI, urchin Strongylocentrotus_purpuratus來自NCBI)。每一個(gè)物種的非冗余蛋白通過BLAST program和hmmer程序比對(duì)SMART database來獲得每一個(gè)序列的結(jié)構(gòu)域信息。在所有預(yù)測(cè) 的含LRR蛋白中，大致可將其分成兩類一是分泌型蛋白或細(xì)胞內(nèi)蛋白，共占69 %。在這一 組中，約44%的蛋白只由LRR結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，另外還有25%的蛋白除了 LRR結(jié)構(gòu)域外還有其 他類型的結(jié)構(gòu)域組成。另一組則為細(xì)胞表面蛋白，共占31%，這類蛋白或者是跨膜蛋白，或 者是能過一個(gè)GPI結(jié)構(gòu)將其錨定在細(xì)胞膜上發(fā)揮其作用。在所有選擇的12個(gè)物種中，文昌 魚中含LRR蛋白的數(shù)量最多，約有1770個(gè)，文昌魚中種類繁多的這種含LRR蛋白的功能是 個(gè)值得深入研究的的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種新的文昌魚富含亮氨酸蛋白ALM基因及其編碼 的富含亮氨酸蛋白ALM。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供文昌魚富含亮氨酸蛋白ALM的表達(dá)方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供該蛋白在制備治療感染性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過引物擴(kuò)增基因片段和RACE基因UTR序列的方法，從文昌魚總RNA中克 隆得到文昌魚富含亮氨酸蛋白ALM基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。由文昌魚富含亮氨酸蛋白ALM基因編碼的富含亮氨酸蛋白ALM，其氨基酸序列如 序列表中<400>2序列所示。該蛋白的等電點(diǎn)為4. 67，分子量為57KDa。根據(jù)文昌魚富含亮氨酸蛋白ALM的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果，通過表達(dá)載體pET_21b，分段 在大腸桿菌中以胞內(nèi)包涵體的形式表達(dá)重組文昌魚非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3，具體包 括以下步驟1)重組表達(dá)載體 pET-2Ib-LRRl、pET-21b-LRR2 和 pET_21b_LRR3 的構(gòu)建；2)將重組表達(dá)載體 pET-2 Ib-LRRl、pET-2 lb-LRR2 和 pET_21b_LRR3 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 菌株 BL21(DE3)；3)對(duì)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株BL21 (DE3)進(jìn)行培養(yǎng)；4)重組文昌魚非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的提取和變復(fù)性處理。本發(fā)明所選擇的文昌魚屬于中國(guó)青島文昌魚(Branchiostoma japonic·)，采自 山東省青島市沙子口水域。
本發(fā)明通過引物PCR從文昌魚的cDNA—鏈中克隆得到了目標(biāo)基因的部分片段， 并對(duì)該片段兩端進(jìn)行RACE擴(kuò)增，再設(shè)計(jì)引物克隆得到目標(biāo)基因全長(zhǎng)序列，命名為ALM基因 (Amphioxus LRR-containing Molecule)，其 DNA 序列如序列表中 <400>1 序列所示。該基 因編碼520個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如序列表<400>2序列所示，N端含有22個(gè)氨基酸組成 的信號(hào)肽，接下來是含35個(gè)氨基酸的LRRNT和1個(gè)含有18個(gè)氨基酸的LRR結(jié)構(gòu)，然后是14 個(gè)串聯(lián)重復(fù)的含標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)的由24個(gè)氨基酸所構(gòu)成的富含亮氨酸的LRR結(jié)構(gòu)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)如 圖IA所示。ALM蛋白約為57KDa，理論等電點(diǎn)pi為4. 67，為酸性蛋白。通過對(duì)ALM蛋白的 C端氨基酸殘基進(jìn)行GPI結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其具有典型的GPI結(jié)構(gòu)(SAA)，因此是一 GPI錨定 蛋白。和其他富含LRR的蛋白相比，ALM蛋白的三維結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)典型的馬蹄形(見圖1B)， 據(jù)此可與外源微生物結(jié)合。ALM基因的基因組結(jié)構(gòu)中不含內(nèi)含子(見圖1C)。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)三對(duì)引物，將ALM基因三段肽鏈的序列克隆到原核非融合表達(dá) 載體pET-21b上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)。此重組表達(dá)載體 pET-2Ib-LRRl、pET-21b-LRR2 和 pET_21b_LRR3 以 T7 為啟動(dòng)子，C 端有 6 XHis 結(jié)構(gòu)，便于利 用固定化金屬配體親和層析進(jìn)行純化。非融合表達(dá)蛋白LRRl的等電點(diǎn)為5. 44，編碼293個(gè) 氨基酸，分子量約為33KDa ；LRR2的等電點(diǎn)為5. 78，編碼258個(gè)氨基酸，分子量約為29KDa ； LRR3的等電點(diǎn)為5. 39，編碼173個(gè)氨基酸，分子量約為19. 6KDa。通過對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)時(shí) 間和溫度等條件的摸索和優(yōu)化，LRRl、LRR2和LRR3三個(gè)非融合蛋白的表達(dá)量都較高，但大 部分處于包涵體狀態(tài)。本發(fā)明還摸索和優(yōu)化了 LRR1、LRR2和LRR3三個(gè)非融合蛋白的變復(fù)性和純化條件， 得到較純的可溶性蛋白。本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒復(fù)制方法參照SBjbrook(SBjbrook，et al. 1989，Molecular doing. ColdSpring Harbor Labroratory Press. USA)方法，用 CaCl2 的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Ε. coli.DH5a或BL21(DE3)菌株，用含氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB加富培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化 菌株，用Omega公司試劑盒提取質(zhì)粒。本發(fā)明的文昌魚富含亮氨酸蛋白ALM經(jīng)初步驗(yàn)證，能較為廣泛地結(jié)合多種細(xì)菌， 具有明顯的細(xì)菌結(jié)合、細(xì)菌凝集和抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，可開發(fā)為天然的抑菌活性物質(zhì)以 及用于制備治療感染性疾病的藥物。


圖IA為ALM蛋白根據(jù)SMART軟件預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及分段表達(dá)蛋白LRRl、LRR2 和LRR3的區(qū)域；圖IB為ALM蛋白預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；圖IC為ALM基因所在的基因組結(jié)構(gòu)圖。圖2為擴(kuò)增得到的ALM基因全長(zhǎng)片段，其中，1為PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，M為DNA分 子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)。圖3為ALM基因的分段重組表達(dá)載體pET_2 Ib-LRRl、pET_21b_LRR2和 pET-2lb-LRR3的構(gòu)建流程圖。圖 4 為分段重組表達(dá)載體 pET-21b-LRRl、pET_21b_LRR2 和 pET_21b_LRR3 誘導(dǎo)表 達(dá)蛋白LRRl、LRR2和LRR3的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖，其中，1為L(zhǎng)RRl，2為L(zhǎng)RR2，3為L(zhǎng)RR3， M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖5A為L(zhǎng)RR1、LRR2和LRR3包涵體變復(fù)性純化后SDS-PAGE電泳結(jié)果圖，其中，1為L(zhǎng)RR1，2為L(zhǎng)RR2，3為L(zhǎng)RR3，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖5B為L(zhǎng)RR1、LRR2和LRR3包涵體變復(fù)性 純化后western blot結(jié)果圖，其中，1為L(zhǎng)RR1，2為L(zhǎng)RR2，3為L(zhǎng)RR3。圖6為L(zhǎng)RR1、LRR2和LRR3蛋白對(duì)不同細(xì)菌的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，細(xì)菌包括 華納氏菌(S. warneri)、摩爾根菌(B. morgen)、氣單孢菌(A. hydrophila)、解藻酸弧菌 (V. alginolyticus)禾口金黃色葡萄球菌(S. aureus)。圖7為L(zhǎng)RRl、LRR2和LRR3蛋白對(duì)不同細(xì)菌的凝集試驗(yàn)結(jié)果，其中，細(xì)菌包括 華納氏菌(S. warneri)、摩爾根菌(B. morgen)、氣單孢菌(A. hydrophila)、解藻酸弧菌 (V. alginolyticus)禾口金黃色葡萄球菌(S. aureus)。圖8為L(zhǎng)RR2蛋白對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1 文昌魚總RNA的提取以及普通cDNA —鏈和Race cDNA 一鏈的合成總RNA的提取取文昌魚全魚，采用Trizol試劑法提取總RNA，酚/氯仿抽提去除 蛋白質(zhì)，獲得文昌魚總RNA。普通cDNA —鏈的合成取1 μ g總RNA，按照Τ0Υ0Β0公司的First Strand cDNASynthesis Kit ReverTra Ace-α -TM(code No. FSK-100)說明書操作，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 用于擴(kuò)增基因片段和克隆基因全長(zhǎng)的cDNA第一鏈。Race cDNA 一鏈的合成按照 Invitrogen 的 GeneRacerTM Kit 進(jìn)行 RNA 的去磷酸 化RACE、脫帽反應(yīng)、RNA oligo的連接及mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，從而合成用于Race的cDNA —鏈。實(shí)施例2 :ALM基因片段擴(kuò)增以及Race 5'和3'末端取2μ 1普通cDNA —鏈產(chǎn)物，根據(jù)差減雜交文庫(kù)中所得片段設(shè)計(jì) 弓I 物 5 ‘ PCR Primer 5 ‘ -GAGGTCGCTTGTGACGGTAG-3 ‘和 3 ‘ PCR Primer 5 ‘ -GTCAAGTTTCCGAGTCCGCT-3 ‘，PCR擴(kuò)增ALM基因的部分片段346bp。將擴(kuò)增得到的目標(biāo) 片段連接到pGEX T easy vector (promega)后，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，挑選重組克隆測(cè)序。取0.5μ1 Race cDNA —鏈產(chǎn)物，根據(jù)上面擴(kuò)增得到的部分ALM序列設(shè)計(jì)進(jìn) 行5' RACE擴(kuò)增的基因特異的外套引物為5 ‘ -gene-specific primer 5 ‘ -CGCTG AAAACACCAACACTTAAGGATG-3 ‘，內(nèi)巢引物為 5 ‘ -nested primer 5 ‘ -CTATTATCCCCA AGGTCAAGGTATCTC-3 ‘ ；3 ‘ RACE 擴(kuò)增的基因特異的外套引物為 3 ‘ -gene-specific primer 5 ‘ -GACGGTAGAGCCTTAACTGAACTGC-3 ‘，內(nèi)巢引物為 3 ‘ -nested primer 5 ‘ -ATTCCCACTGACACCGCCACA-3 ‘。將擴(kuò)增得到的目標(biāo)片段連接到pGEX T easy vector (promega)后，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，挑選重組克隆測(cè)序，并與前面得到的目標(biāo)片段 進(jìn)行拼接，得到ALM基因的全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度是2392bp，編碼520個(gè)氨基酸的ALM蛋白。實(shí)施例3 =ALM基因全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增根據(jù)實(shí)施例2拼接得到的ALM基因序列，設(shè)計(jì)引物 5 ‘ -TCACAACATCTCAGCGAGAA-3 '和 5 ‘ -GGATAAACAGTTGGCACAATCT-3 ‘，采用 Takara 的 PrimeSTAR高保真聚合酶擴(kuò)增ALM的ORF框基因，擴(kuò)增得到的2226bp片段的電泳圖譜如圖 2所示。將擴(kuò)增得到的目標(biāo)片段加A后連接到pGEX T easy vector (promega)，然后轉(zhuǎn)化 DH5a大腸桿菌，挑選重組克隆測(cè)序。Blast同源分析表明，獲得了 ALM基因的全長(zhǎng)序列。
實(shí)施例4 重組ALM分段表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建依據(jù)ALM基因的序列及其預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)并合成三對(duì)分段表達(dá)的引物，上 游引物均含BamH I切割位點(diǎn)，下游引物均含Xho I切割位點(diǎn)。LRRl 上游引物 LRRl-up :5，-at GGATCC TATGAGCGACGTCTGCTACTG-3，保護(hù)堿基 BamH I ALM基因序列LRRl 下游引物 LRRl-Iow :5，-ta CTCGAG CCGAGGACGGAAAAGTTCAG-3，
保護(hù)堿基 Xho I
ALM基因序列 LRR2 上游引物 LRR2-up :5，-at GGATCC GATGCTACAACTCAACAACAAC-3‘
保護(hù)堿基 BamH I ALM基因序列 LRR2 下游引物 LRR2-low :5，-ta CTCGAG CCGAGGACGGAAAAGTTCAG-3‘
保護(hù)堿基 Xho I
ALM基因序列LRR3 上游引物 LRR3-Up 5，-at GGATCC TATGAGCGACGTCTGCTACTG-3‘保護(hù)堿基 BamH I ALM基因序列LRR3 下游引物 LRR3-low :5，-ta CTCGAG CCGCAGAACAGACAGGACATC-3，保護(hù)堿基 Xho I ALM基因序列以含有ALM基因全長(zhǎng)序列的pGEM T easy vector質(zhì)粒為模板，LRRl-up和 LRRl-low, LRR2-up和LRR2_low、LRR3_up和LRR3_low為引物，得到特異擴(kuò)增的單一條帶， 產(chǎn)物大小分別為902bp、797bp、542bp。用TaKaRa公司的BamH I和Xho I雙酶切PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物和質(zhì)粒PET-21B，用OMEGA公司的試劑盒膠回收酶切產(chǎn)物。將基因的酶切產(chǎn)物克隆到雙 酶切的原核非融合表達(dá)載體pET-21b上，得到重組表達(dá)載體pET-21b-LRRl、pET_21b_LRR2 和pET-21b-LRR3 (構(gòu)建過程如圖3所示)。重組表達(dá)載體pET_2Ib-LRRl、pET_21b_LRR2和 pET-21b-LRR3中的外源基因經(jīng)測(cè)序鑒定正確。實(shí)施例5 重組文昌魚非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的表達(dá)將重組表達(dá)載體pET-2Ib-LRRl、pET_21b_LRR2 和 pET_21b_LRR3 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)?；蚬こ叹暳呀馍锨逡航?jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，菌株經(jīng)0. 5mM的IPTG 誘導(dǎo)后有明顯的特異表達(dá)產(chǎn)物帶(見圖4)，分子量與預(yù)測(cè)分子量相吻合。對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、誘 導(dǎo)濃度和溫度等條件的摸索得出，基因工程菌的培養(yǎng)條件為將單菌落接種于IOml含有 100mg/L氨芐青霉素抗性LB液體加富培養(yǎng)基中，37°C劇烈震蕩培養(yǎng)16小時(shí)，作為種子菌； 取種子菌按1 100的比例接種于含氨芐青霉素的LB液體加富培養(yǎng)基中，37°C劇烈震蕩放 大培養(yǎng)至OD6tltl約為0. 5 0. 6 ；加入終濃度為0. 5mM的IPTG，37°C誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)；4°C、 SOOOrpm離心15分鐘，收集菌體。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，在該培養(yǎng)條件下，非融合蛋白 LRR1、LRR2和LRR3的表達(dá)量占菌體總蛋白的50%以上，但95%以上處于包涵體狀態(tài)。實(shí)施例6 重組文昌魚非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的變復(fù)性處理洗滌變性將收集的沉淀用IM PBS洗滌兩次，12，OOOrpm室溫離心lOmin，收集沉 淀，稱濕重，按照Ig IOml的比例加入Binding buffer，冰浴下超聲4個(gè)循環(huán)(超聲4s，間 歇4s，重復(fù)99次為一個(gè)循環(huán))破碎細(xì)菌細(xì)胞，加入終濃度為的Triton-XlOO，冰上攪拌 約30min，12，000g 4°C離心15min，棄上清(留少許作電泳)，沉淀再稱濕重，按照Ig Iml 的比例用dd H2O重懸，分成IOOul/管共7管，于4°C保存。將分裝出的IOOul/管的重懸液 12，OOOg 4°C離心15min，每份沉淀再重懸于IOOul含不同濃度(1M，2M，3M，4M，5M，6M，8M)尿素的 0. IMTris. HCl (pH 8. 0)中，靜置 5min，12，OOOg 4°C離心 15min，取上清作 SDS-PAGE 電 泳，找出最佳包涵體洗滌和變性的條件。實(shí)驗(yàn)最后確定先將包涵體用3M尿素-TBS溶液洗 去大部分雜蛋白，再將沉淀用6M尿素-TBS溶液進(jìn)行溶解，進(jìn)行后述的透析復(fù)性處理。透析復(fù)性將溶解好的包涵體用相應(yīng)濃度尿素的0. IM Tris. HCl (pH 8. 0)進(jìn)行稀 釋，使其蛋白質(zhì)終濃度維持在50ug/ml。將稀釋好的包涵體溶解液預(yù)冷后裝入已經(jīng)處理好的 透析袋中，將兩側(cè)透析袋的口扎緊，最后將透析袋轉(zhuǎn)移至透析液中，4°C透析12hr，更換新的 透析液(透析液中的尿素濃度逐漸遞減，最后濃度為0M)，每隔12hr換一次透析液，透析液 要用磁力攪拌器不停進(jìn)行攪拌，但要注意磁力攪拌子不要碰到透析袋，以免扎破透析袋。透 析結(jié)束后的包涵體復(fù)性液利用超濾手段進(jìn)行濃縮。將保存在10%乙醇中的合適孔徑的超濾 膜用去離子水沖洗干凈后，安裝在超濾儀的罐底部。將超濾儀安裝好后固定在磁力攪拌器 的上方，通入氮?dú)馓峁怏w壓力，操作在層析柜中進(jìn)行，壓力控制在0. 1-0. 3mPa(14-42psi) 之間。閉合超濾儀氣體閥門，打開磁力攪拌器，收集濾出液，待超濾儀罐中剩少許液體時(shí)， 緩慢關(guān)閉液氮罐閥門，打開超濾儀氣體閥門，停止攪拌，取出罐中液體和濾出液分別進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，超濾膜清洗后仍保存在10%乙醇中。本實(shí)驗(yàn)中使用了切割分 子量為IK的超濾膜來進(jìn)行樣品的濃縮處理。重組文昌魚非融合蛋白LRR1、LRR2、LRR3經(jīng)變復(fù)性處理后，得到了較純的蛋白(見 圖5)，純度達(dá)到90%以上，可進(jìn)行后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)分析。實(shí)施例7 重組文昌魚非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)將華納氏菌(S. warneri)、摩爾根菌(B. morgen)、氣單孢菌(A. hydrophila)和金 黃色葡萄球菌(S. aureus)保存的甘油菌株劃線于LB固體固體培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出克隆后挑 取單克隆于LB液體培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)活化菌株。解藻酸弧菌(V. alginolyticus)保存的 甘油菌株劃線于TCBS選擇性固體培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出克隆后挑取單克隆于高鹽的LB液體培 養(yǎng)基(3% NaCl)中于37°C培養(yǎng)活化菌株。將華納氏菌(S. warneri)、摩爾根菌(B. morgen)、 氣單孢菌(A. hydrophila)和金黃色葡萄球菌(S. aureus)各IOul接種于10ml LB液體培 養(yǎng)基中(無氨芐抗性)，37°C培養(yǎng)過夜。將解藻酸弧菌(V. alginolyticus)以同樣比例放大 于高鹽LB液體培養(yǎng)基中(3% NaCl)，26°C培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的菌液于4°C 6000g離心5min，棄上清，每管加入3ml預(yù)冷的PBS溶液 洗滌沉淀三次。每管加入1. 6ml預(yù)冷的TBS溶液重懸沉淀，重懸后將菌液分裝500 μ 1/管 +0. IMCaCl2 30 μ 1+20% BSA 30 μ 1+等量的Irr蛋白(上樣前先進(jìn)行BCAP定量)。于4°C 孵育2小時(shí)后，4°C、轉(zhuǎn)速IOOOg/分下離心5分鐘，棄上清，每管用Iml預(yù)冷的TBS溶液洗滌 二次。每管用Iml預(yù)冷的TBS溶液(含5mM CaCl2)洗滌沉淀三次。棄上清，直接向沉淀中 加入 20ul SDS-PAGE Loading buffer，于 100°C煮 10 分鐘后，上樣進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，以 抗His的單克隆抗體為一抗，Western blot檢測(cè)(見圖6)。實(shí)施例8 重組文昌魚非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)將華納氏菌(S. warneri)、摩爾根菌(B. morgen)、氣單孢菌(A. hydrophila)和金 黃色葡萄球菌(S. aureus)各IOul接種于10ml LB液體培養(yǎng)基中(無氨芐抗性)，37°C培 養(yǎng)過夜。將解藻酸弧菌(V. alginolyticus)以同樣比例放大于高鹽LB液體培養(yǎng)基中(3% NaCl)，26°C培養(yǎng)過夜。取1. 5ml過夜培養(yǎng)菌液于1. 5ml EP管，4°C、轉(zhuǎn)速IOOOOg/分下離心1分鐘。棄上清，每管加Iml預(yù)冷的PBS溶液洗滌沉淀二次。棄上清，每管加Iml預(yù)冷的PBS溶液重 懸沉淀，視沉淀量加入等量的10mg/ml FITC溶液，混勻。室溫避光孵育1小時(shí)。4°C、轉(zhuǎn)速 6000g/分下離心5分鐘，棄上清，每管加Iml預(yù)冷的PBS溶液洗滌沉淀至上清液澄清。用 Binding buffer (PH7. 5)洗滌沉淀，4°C、轉(zhuǎn)速6000g/分下離心5分鐘。棄上清，加入500 μ 1 Binding buffer (PH7. 5)重懸菌，每種菌分五組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組加入等量的菌液(測(cè)0D600 值)，各組加樣如下①菌液+Binding buffer，②菌液+Binding buffer+5mM CaCl2,③菌液 +10% BSA+Binding buffer+5mM CaCl2,④菌液+Irr 蛋白+Binding buffer+5mM CaCl2，⑤ 菌液+Irr蛋白+Binding buffer+5mM EDTA。室溫孵育過夜，第二天在熒光顯微鏡下觀察結(jié) 果，拍照(見圖7)。實(shí)施例9 重組文昌魚非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的細(xì)菌生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)將華納氏菌(S. warneri)、摩爾根菌(B. morgen)、氣單孢菌(A. hydrophila)和金 黃色葡萄球菌(S. aureus)各IOul接種于10ml LB液體培養(yǎng)基中(無氨芐抗性)，37°C培 養(yǎng)過夜。將解藻酸弧菌(V. alginolyticus)以同樣比例放大于高鹽LB液體培養(yǎng)基中(3% NaCl)，26°C培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)飽和的IOml菌液于4 °C、轉(zhuǎn)速5000g/分下離心10分鐘。沉淀用 1 XPBS (ρΗ7· 4)洗滌1次，4°C、轉(zhuǎn)速5000g/分下離心2分鐘。將菌液稀釋之10e-3/ml, 20ul 菌液+20ul蛋白，混勻，TBS作陰性對(duì)照。每組分別涂布三個(gè)平板，37°C培養(yǎng)過夜。次日觀 察和計(jì)數(shù)平板上生長(zhǎng)出的克隆。結(jié)果采用秩和檢驗(yàn)的方法進(jìn)行檢驗(yàn)(見圖8)。
權(quán)利要求
通過引物擴(kuò)增基因片段和RACE基因UTR序列的方法，從文昌魚總RNA中克隆得到文昌魚富含亮氨酸蛋白ALM基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
2.由權(quán)利要求1所述的文昌魚富含亮氨酸蛋白ALM基因編碼的富含亮氨酸蛋白ALM, 其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。
3.重組文昌魚非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的表達(dá)方法，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求 2所述的富含亮氨酸蛋白ALM的結(jié)構(gòu)域，通過表達(dá)載體pET-21b，分段在大腸桿菌中以胞內(nèi) 包涵體的形式表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)方法，包括以下步驟1)重組表達(dá)載體pET-2Ib-LRRl、pET-21b-LRR2 和 pET_21b_LRR3 的構(gòu)建；2)將重組表達(dá)載體pET-2Ib-LRRl、pET-2 lb-LRR2和pET_21b_LRR3轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株 BL21(DE3)；3)對(duì)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株BL21(DE3)進(jìn)行培養(yǎng)；4)重組文昌魚非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的提取和變復(fù)性處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)方法，其特征在于，在步驟1)中所述的重組表達(dá)載體 pET-2Ib-LRRl、pET-2lb-LRR2 和 pET_21b_LRR3 的構(gòu)建包括以下步驟a)依據(jù)權(quán)利要求1所述的ALM基因的序列和權(quán)利要求2所述的ALM蛋白的結(jié)構(gòu)，合成 三對(duì)引物，LRRl 上游引物 LRRl-up 為 5’atGGATCCTATGAGCGACGTCTGCTACTG-3’，LRRl 下游引 物 LRRl-Iow 為 5’-taCTCGAGCCGAGGACGGAAAAGTTCAG-3’，LRR2 上游引物 LRR2_up 為 5，-atg GATCCGATGCTACAACTCAACAACAAC-3’，LRR2 下游引物 LRR2_low 為 5’-taCTCGAGCCGAGGACGGAA AAGTTCAG-3，，LRR3 上游引物 LRR3_up 為 5 ’ -atGGATCCTATGAGCGACGTCTGCTACTG-3 ’，LRR3 下 游弓丨物 LRR3-1 ow 為 5，-taCTCGAGCCGCAGAACAGACAGGACATC-3，，其中，上游引物均含有 BamH I切割位點(diǎn)，下游引物均含有Xh0 I切割位點(diǎn)；b)以含有ALM基因的pGEMT easy vector質(zhì)粒為模板，以LRRl-up和LRRl-low、 LRR2-up和LRR2-low、LRR3_up和LRR3_low為引物，高保真聚合酶PCR擴(kuò)增基因片段；c)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到原核融合表達(dá)載體pET-21b上，得到重組表達(dá)載體 pET-2Ib-LRRl、pET-2lb-LRR2 和 pET_21b_LRR3。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)方法，其特征在于，步驟3)的培養(yǎng)條件為將單菌落接 種于IOml含有100mg/L氨芐青霉素抗性LB液體加富培養(yǎng)基中，37°C劇烈震蕩培養(yǎng)16小 時(shí)，作為種子菌；取種子菌按1 100的比例接種于含氨芐青霉素的LB液體加富培養(yǎng)基中， 37°C劇烈震蕩放大培養(yǎng)至OD6tltl約為0. 5 0. 6 ；加入終濃度為0. 5mM的IPTG，37°C誘導(dǎo)表 達(dá)6小時(shí)；4°C、8000rpm離心15分鐘，收集菌體。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)方法，其特征在于，步驟4)所述的變復(fù)性處理包括以下 步驟a)洗滌變性將收集的沉淀用IMPBS洗滌兩次，12，OOOrpm室溫離心lOmin，收集沉淀， 稱濕重，按照Ig IOml的比例加入Binding buffer，冰浴下超聲4個(gè)循環(huán)破碎細(xì)菌細(xì)胞， 加入終濃度為的Triton-XlOO，冰上攪拌約30min, 12，000g 4°C離心15min，棄上清，沉 淀再稱濕重，按照Ig Iml的比例用dd H2O重懸，將重懸液12，000g 4°C離心15min，沉淀 先用3M的尿素-TBS溶液洗去雜蛋白，再用6M的尿素-TBS溶液進(jìn)行溶解；b)透析復(fù)性將稀釋好的包涵體溶解液預(yù)冷后裝入處理好的透析袋中，將兩側(cè)透析袋的口扎緊后轉(zhuǎn)移至透析液中，4°C透析12hr，更換新的透析液，每隔12hr換一次透析液，透 析液用磁力攪拌器不停進(jìn)行攪拌，透析結(jié)束后的包涵體復(fù)性液利用切割分子量為IK的超 濾膜進(jìn)行濃縮。
8.由權(quán)利要求3所述的表達(dá)方法獲得的重組文昌魚非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3在 制備治療感染性疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及文昌魚富含亮氨酸蛋白ALM基因及其編碼的富含亮氨酸蛋白ALM，以及該蛋白在制備治療感染性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過引物擴(kuò)增基因片段和RACE基因UTR序列，從文昌魚總RNA中克隆得到ALM基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。該基因編碼的ALM蛋白的氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。本發(fā)明的富含亮氨酸蛋白ALM經(jīng)初步驗(yàn)證，能較為廣泛地結(jié)合多種細(xì)菌，具有明顯的細(xì)菌結(jié)合、細(xì)菌凝集和抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，可開發(fā)為天然的抑菌活性物質(zhì)以及用于制備治療感染性疾病的藥物。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101914545SQ201010234879
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者元少春, 徐安龍, 董美玲, 鄭婷婷, 韓燕 , 黃功華 申請(qǐng)人:中山大學(xué)