專利名稱：一種秸稈厭氧微生物糖化能力的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種秸稈糖化能力的檢測方法。
背景技術(shù)：
目前，秸稈微生物糖化過程中，主要通過測定發(fā)酵體系內(nèi)纖維素物質(zhì)被降解所產(chǎn) 生還原糖量的多少，來檢測微生物糖化能力。但由于葡萄糖效應(yīng)和提取發(fā)酵液并貯存過程 中還原糖會(huì)被持續(xù)利用等原因，只提取發(fā)酵液并測定其中殘留還原糖量，并不能真實(shí)的、實(shí) 時(shí)的反應(yīng)微生物糖化能力，導(dǎo)致微生物糖化能力的檢測缺乏連續(xù)性與實(shí)效性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有秸稈微生物糖化能力的檢測，不能真實(shí)的、實(shí)時(shí)的反 應(yīng)微生物糖化能力，導(dǎo)致檢測缺乏連續(xù)性與實(shí)效性的問題，而提供一種秸稈厭氧微生物糖 化能力的檢測方法。秸稈厭氧微生物糖化能力的檢測方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)
一、向容積為30ml的厭氧聚碳酸酯單室反應(yīng)器中添加21.6ml無碳源培養(yǎng)液和0. 12g 葡萄糖作為發(fā)酵液，然后接種2. 4ml利用還原糖高效產(chǎn)氫菌株YUAN-3的菌液，在30°C下培 養(yǎng)32h，期間每隔4h收集氫氣，氫氣利用高效氣相色譜進(jìn)行含量測定，同時(shí)利用高效液相色 譜測定發(fā)酵液中葡萄糖消耗量，以葡萄糖消耗量對氫氣產(chǎn)生量擬合回歸方程為Y = -O. 0000 7x2+0. 0064X+0. 0013 (R2=O. 9996)；
二、向容積為60ml的厭氧聚碳酸酯的雙室反應(yīng)器中添加43.2ml無碳源培養(yǎng)液，向反應(yīng) 器A室中添加秸稈段并接種2. 4ml厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌株的菌液，同 時(shí)向反應(yīng)器B室中接種2. 4ml利用還原糖高效產(chǎn)氫菌株YUAN-3的菌液，然后在30°C下培 養(yǎng)，每隔4h收集反應(yīng)器B室氫氣，并利用高效氣相色譜進(jìn)行氫氣含量測定；
三、將反應(yīng)器B室中產(chǎn)生氫氣量，代入擬合回歸方程Y= -0. 00007x2+0. 0064X+0. 0013 (R 2=0. 9996)，通過計(jì)算得到反應(yīng)器A室中厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌株降解秸 稈所產(chǎn)生的還原糖的量，即完成秸稈厭氧微生物糖化能力的檢測；
其中步驟一中無碳源培養(yǎng)基由1. Og的NH4Cl,3. 5g的K2HPO4U. 5g的KH2P04、0. 5g的 MgCl2U. Og的NaCUO. 2g的KCl、0. 5g的半胱氨酸、2. Og的蛋白胨、2. Og的酵母粉、5ml的維 生素液和Iml的微量元素溶液溶于IOOOmL的蒸餾水中組成，所述的維生素液溶液由50. Omg 的硫辛酸、20. Omg的生物素、0. 35g的煙酸、5. Omg的鹽酸硫胺素、50. Omg的對氨基苯甲酸、 20. Omg的葉酸、50. Omg的泛酸鈣、1. Omg的維生素B12和100. Omg的鹽酸吡哆醇溶于IOOOml 的蒸餾水中組成，PH值為6. 8 7. 0，所述的微量元素溶液由1. 5g的氯化亞鐵、70mg的氯 化鋅、6mg的硼酸、0. Ig的四水氯化錳、2mg的二水氯化銅、0. 19g的六水氯化鈷、24mg的六水 氯化鎳、36mg的一水鉬酸鈉、15mg的鎢酸鈉和15mg的五水硒酸鈉溶于IOOOmL的蒸餾水中 組成；步驟一中Y為單室反應(yīng)器中的葡萄糖消耗量，單位為克，χ為氫氣體積，單位為毫升； 步驟三中Y為反應(yīng)器B室中的葡萄糖消耗量，即為反應(yīng)器A室中產(chǎn)生的還原糖的量，單位為克，X為氫氣體積，單位為毫升。本發(fā)明將厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌株與利用還原糖高效產(chǎn)氫菌 株YUAN-3進(jìn)行分室同步糖化發(fā)酵，根據(jù)利用還原糖高效產(chǎn)氫菌株YUAN-3在適宜條件下氫 氣產(chǎn)生量，與其消耗的葡萄糖形式的還原糖量呈一定的比例關(guān)系，通過測定YUAN-3即時(shí)氫 氣產(chǎn)量，計(jì)算產(chǎn)生單位體積H2時(shí)的還原糖消耗量，從而對分室同步培養(yǎng)條件下厭氧秸稈糖 化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌株解秸稈產(chǎn)糖的能力進(jìn)行檢測。本發(fā)明與直接測定厭氧秸稈 發(fā)酵體系中還原糖殘留量相比，更能真實(shí)反應(yīng)厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌株 的秸稈糖化能力及糖化潛力，高效產(chǎn)氫菌株與糖化發(fā)酵體系相連通，能通過時(shí)實(shí)測定其氫 氣產(chǎn)量，及時(shí)的檢測秸稈糖化菌的糖化能力，反應(yīng)秸稈轉(zhuǎn)化為還原糖的效果，該檢測方法具 備了很好的連續(xù)性和實(shí)效性，能實(shí)時(shí)的量化糖化效果，方法操作簡便，準(zhǔn)確性高，同步性好。


圖1為具體實(shí)施方式
一的步驟二中所用厭氧聚碳酸酯的雙室反應(yīng)器的裝置示意 圖；圖2為具體實(shí)施方式
三中利用還原糖高效產(chǎn)氫菌株YUAN-3產(chǎn)氫量對葡萄糖消耗量擬合 曲線圖；圖3為具體實(shí)施方式
三中反應(yīng)器B室中產(chǎn)氫氣變化動(dòng)態(tài)曲線圖；圖4為具體實(shí)施方 式三中反應(yīng)器產(chǎn)生及殘留還原糖量的曲線圖。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一結(jié)合圖1說明本實(shí)施方式，本實(shí)施方式秸稈厭氧微生物糖化能 力的檢測方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)
一、向容積為30ml的厭氧聚碳酸酯單室反應(yīng)器中添加21.6ml無碳源培養(yǎng)液和0. 12g 葡萄糖作為發(fā)酵液，然后接種2. 4ml利用還原糖高效產(chǎn)氫菌株YUAN-3的菌液，在30°C下培 養(yǎng)32h，期間每隔4h收集氫氣，氫氣利用高效氣相色譜進(jìn)行含量測定，同時(shí)利用高效液相色 譜測定發(fā)酵液中葡萄糖消耗量，以葡萄糖消耗量對氫氣產(chǎn)生量擬合回歸方程為Y = -O. 0000 7x2+0. 0064X+0. 0013 (R2=O. 9996)；
二、向容積為60ml的厭氧聚碳酸酯的雙室反應(yīng)器1中添加43.2ml無碳源培養(yǎng)液，向反 應(yīng)器A室1-1中添加秸稈段并接種2. 4ml厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌株的菌 液，同時(shí)向反應(yīng)器B室1-2中接種2. 4ml利用還原糖高效產(chǎn)氫菌株YUAN-3的菌液，然后在 30°C下培養(yǎng)，每隔4h收集反應(yīng)器B室1-2氫氣，并利用高效氣相色譜進(jìn)行氫氣含量測定；
三、將反應(yīng)器B室1-2中產(chǎn)生氫氣量，代入擬合回歸方程Y= -0. 00007x2+0. 0064X+0. 00 13 (R2=O. 9996)，通過計(jì)算得到反應(yīng)器A室1_1中厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌 株降解秸稈所產(chǎn)生的還原糖的量，即完成秸稈厭氧微生物糖化能力的檢測；
其中步驟一中無碳源培養(yǎng)基由1. Og的NH4Cl,3. 5g的K2HPO4U. 5g的KH2P04、0. 5g的 MgCl2U. Og的NaCUO. 2g的KCl、0. 5g的半胱氨酸、2. Og的蛋白胨、2. Og的酵母粉、5ml的維 生素液和Iml的微量元素溶液溶于IOOOmL的蒸餾水中組成，所述的維生素液溶液由50. Omg 的硫辛酸、20. Omg的生物素、0. 35g的煙酸、5. Omg的鹽酸硫胺素、50. Omg的對氨基苯甲酸、 20. Omg的葉酸、50. Omg的泛酸鈣、1. Omg的維生素B12和100. Omg的鹽酸吡哆醇溶于IOOOml 的蒸餾水中組成，PH值為6. 8 7. 0，所述的微量元素溶液由1. 5g的氯化亞鐵、70mg的氯 化鋅、6mg的硼酸、0. Ig的四水氯化錳、2mg的二水氯化銅、0. 19g的六水氯化鈷、24mg的六水氯化鎳、36mg的一水鉬酸鈉、15mg的鎢酸鈉和15mg的五水硒酸鈉溶于IOOOmL的蒸餾水中 組成；步驟一中Y為單室反應(yīng)器中的葡萄糖消耗量，單位為克，χ為氫氣體積，單位為毫升； 步驟三中Y為反應(yīng)器B室1-2中的葡萄糖消耗量，即為反應(yīng)器A室1-1中產(chǎn)生的還原糖的 量，單位為克，χ為氫氣體積，單位為毫升。本實(shí)施方式步驟一中單室反應(yīng)器中葡萄糖作為唯一碳源。本實(shí)施方式步驟一中利用還原糖高效產(chǎn)氫菌株YUAN-3 (Bthanoligenens harbinense)為哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌，是高效產(chǎn)氫菌，為購買得到。本實(shí)施方式步驟一中R表示擬合度。本實(shí)施方式步驟二中厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌株為購買得到。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中所述雙室反應(yīng) 器(1)由兩個(gè)同樣大小厭氧聚碳酸酯單室反應(yīng)器組合而成，反應(yīng)器A室(1-1)和反應(yīng)器B 室(1-2)之間以0.45 μ m細(xì)菌濾膜分隔，反應(yīng)器B室(1_2)中不添加碳源，而利用反應(yīng)器A 室(1-1)中厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌株降解秸稈所產(chǎn)生的還原糖，進(jìn)行發(fā) 酵并產(chǎn)生氫氣。其中步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三結(jié)合圖1、2和3說明本實(shí)施方式，本實(shí)施方式本實(shí)施方式秸稈厭 氧微生物糖化能力的檢測方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)
一、向容積為30ml的厭氧聚碳酸酯單室反應(yīng)器中添加21.6ml無碳源培養(yǎng)液和0. 12g 葡萄糖作為發(fā)酵液，然后接種2. 4ml利用還原糖高效產(chǎn)氫菌株YUAN-3的菌液，在30°C下培 養(yǎng)32h，期間每隔4h收集氫氣，氫氣利用高效氣相色譜進(jìn)行含量測定，同時(shí)利用高效液相色 譜測定發(fā)酵液中葡萄糖消耗量，以葡萄糖消耗量對氫氣產(chǎn)生量擬合回歸方程為Y = -O. 0000 7x2+0. 0064X+0. 0013 (R2=O. 9996)；
二、向容積為60ml的厭氧聚碳酸酯的雙室反應(yīng)器1中添加43.2ml無碳源培養(yǎng)液，向反 應(yīng)器A室1-1中添加秸稈段并接種2. 4ml厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌株的菌 液，同時(shí)向反應(yīng)器B室1-2中接種2. 4ml利用還原糖高效產(chǎn)氫菌株YUAN-3的菌液，然后在 30°C下培養(yǎng)，每隔4h收集反應(yīng)器B室1-2氫氣，并利用高效氣相色譜進(jìn)行氫氣含量測定；
三、將反應(yīng)器B室1-2中產(chǎn)生氫氣量，代入擬合回歸方程Y= -0. 00007x2+0. 0064X+0. 00 13 (R2=O. 9996)，通過計(jì)算得到反應(yīng)器A室1_1中厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌 株降解秸稈所產(chǎn)生的還原糖的量，即完成秸稈厭氧微生物糖化能力的檢測；
其中步驟一中無碳源培養(yǎng)基由1. Og的NH4Cl,3. 5g的K2HPO4U. 5g的KH2P04、0. 5g的 MgCl2U. Og的NaCUO. 2g的KCl、0. 5g的半胱氨酸、2. Og的蛋白胨、2. Og的酵母粉、5ml的維 生素液和Iml的微量元素溶液溶于IOOOmL的蒸餾水中組成，所述的維生素液溶液由50. Omg 的硫辛酸、20. Omg的生物素、0. 35g的煙酸、5. Omg的鹽酸硫胺素、50. Omg的對氨基苯甲酸、 20. Omg的葉酸、50. Omg的泛酸鈣、1. Omg的維生素B12和100. Omg的鹽酸吡哆醇溶于IOOOml 的蒸餾水中組成，PH值為7. 0，所述的微量元素溶液由1. 5g的氯化亞鐵、70mg的氯化鋅、6mg 的硼酸、0. Ig的四水氯化錳、2mg的二水氯化銅、0. 19g的六水氯化鈷、24mg的六水氯化鎳、 36mg的一水鉬酸鈉、15mg的鎢酸鈉和15mg的五水硒酸鈉溶于IOOOmL的蒸餾水中組成；步 驟一中Y為單室反應(yīng)器中的葡萄糖消耗量，單位為克，χ為氫氣體積，單位為毫升；步驟三 中Y為反應(yīng)器B室1-2中的葡萄糖消耗量，即為反應(yīng)器A室1-1中產(chǎn)生的還原糖的量，單位 為克，χ為氫氣體積，單位為毫升。
本實(shí)施方式中所用秸稈段為水稻秸稈段；
本實(shí)施方式步驟一中以葡萄糖消耗量對氫氣產(chǎn)生量擬合回歸方程Y = -0. 00007x2+0. 0 064x+0. 0013 (R2=O. 9996)，按圖2所示YUAN-3產(chǎn)氫量對葡萄糖消耗量擬合曲線，按圖3所示 將YUAN-3產(chǎn)氫量代入回歸方程所得厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系JY(在文中簡稱為JY)產(chǎn)還原 糖量如圖4所示，YUAN-3在發(fā)酵過程中所消耗的還原糖量在不斷升高，且呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化趨 勢，終點(diǎn)最大值164. 80mg,計(jì)算得到JY降解秸稈產(chǎn)生還原糖量為0. 5150g/g秸稈，秸稈降解 率達(dá)到61. 06% ；而反應(yīng)器內(nèi)殘留還原糖含量均較低，最高值也分別只有3. 31mg,且未呈現(xiàn) 變化趨勢；同時(shí)，利用DNS法測定了反應(yīng)體系中的殘留的還原糖量，反應(yīng)器內(nèi)JY和YUAN-3 還原糖含量均較低，最高值也分別只有3. 310mg和3. 005mg，且動(dòng)態(tài)變化并不規(guī)律；結(jié)果表 明，在秸稈降解的過程中，可能還原糖在產(chǎn)生后便被及時(shí)利用，很難在反應(yīng)體系發(fā)現(xiàn)糖的殘 留；由此可見，以產(chǎn)生一定體積氫氣所消耗的葡萄糖量，來表述JY降解秸稈產(chǎn)生的還原糖 量是可行和有效的。
權(quán)利要求
一種秸稈厭氧微生物糖化能力的檢測方法，其特征在于秸稈厭氧微生物糖化能力的檢測方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、向容積為30ml的厭氧聚碳酸酯單室反應(yīng)器中添加21.6ml無碳源培養(yǎng)液和0.12g葡萄糖作為發(fā)酵液，然后接種2.4ml利用還原糖高效產(chǎn)氫菌株YUAN 3的菌液，在30℃下培養(yǎng)32h，期間每隔4h收集氫氣，氫氣利用高效氣相色譜進(jìn)行含量測定，同時(shí)利用高效液相色譜測定發(fā)酵液中葡萄糖消耗量，以葡萄糖消耗量對氫氣產(chǎn)生量擬合回歸方程為Y＝ 0.00007x2+0.0064x+0.0013；二、向容積為60ml的厭氧聚碳酸酯的雙室反應(yīng)器(1)中添加43.2ml無碳源培養(yǎng)液，向反應(yīng)器A室(1 1)中添加秸稈段并接種2.4ml厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌株的菌液，同時(shí)向反應(yīng)器B室(1 2)中接種2.4ml利用還原糖高效產(chǎn)氫菌株YUAN 3的菌液，然后在30℃下培養(yǎng)，每隔4h收集反應(yīng)器B室(1 2)氫氣，并利用高效氣相色譜進(jìn)行氫氣含量測定；三、將反應(yīng)器B室(1 2)中產(chǎn)生氫氣量，代入擬合回歸方程Y＝ 0.00007x2+0.0064x+0.0013，通過計(jì)算得到反應(yīng)器A室(1 1)中厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌株降解秸稈所產(chǎn)生的還原糖的量，即完成秸稈厭氧微生物糖化能力的檢測； 其中步驟一中無碳源培養(yǎng)基由1.0g的NH4Cl、3.5g的K2HPO4、1.5g的KH2PO4、0.5g的MgCl2、1.0g的NaCl、0.2g的KCl、0.5g的半胱氨酸、2.0g的蛋白胨、2.0g的酵母粉、5ml的維生素液和1ml的微量元素溶液溶于1000mL的蒸餾水中組成，所述的維生素液溶液由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的煙酸、5.0mg的鹽酸硫胺素、50.0mg的對氨基苯甲酸、20.0mg的葉酸、50.0mg的泛酸鈣、1.0mg的維生素B12和100.0mg的鹽酸吡哆醇溶于1000ml的蒸餾水中組成，pH值為6.8～7.0，所述的微量元素溶液由1.5g的氯化亞鐵、70mg的氯化鋅、6mg的硼酸、0.1g的四水氯化錳、2mg的二水氯化銅、0.19g的六水氯化鈷、24mg的六水氯化鎳、36mg的一水鉬酸鈉、15mg的鎢酸鈉和15mg的五水硒酸鈉溶于1000mL的蒸餾水中組成；步驟一中Y為單室反應(yīng)器中的葡萄糖消耗量，單位為克，x 為氫氣體積，單位為毫升；步驟三中Y為反應(yīng)器B室(1 2)中的葡萄糖消耗量，即為反應(yīng)器A室(1 1)中產(chǎn)生的還原糖的量，單位為克，x 為氫氣體積，單位為毫升。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種秸稈厭氧微生物糖化能力的檢測方法，其特征在于步驟 二中所述雙室反應(yīng)器(1)由兩個(gè)同樣大小厭氧聚碳酸酯單室反應(yīng)器組合而成，反應(yīng)器A室 (1-1)和反應(yīng)器B室(1-2)之間以0.45 μ m細(xì)菌濾膜分隔，反應(yīng)器B室(1_2)中不添加碳 源，而利用反應(yīng)器A室(1-1)中厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌株降解秸稈所產(chǎn) 生的還原糖，進(jìn)行發(fā)酵并產(chǎn)生氫氣。
全文摘要
一種秸稈厭氧微生物糖化能力的檢測方法，涉及一種秸稈糖化能力的檢測方法。它解決了現(xiàn)有秸稈微生物糖化能力的檢測，不能真實(shí)的、實(shí)時(shí)的反應(yīng)微生物糖化能力，導(dǎo)致檢測不準(zhǔn)確的問題。方法一、擬合回歸方程；二、向雙室反應(yīng)器中加無碳源培養(yǎng)液，向反應(yīng)器A室中加秸稈段并接種厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或菌株的菌液，同時(shí)向反應(yīng)器B室中接種YUAN-3的菌液，培養(yǎng)收集反應(yīng)器B室氫氣，并利用高效氣相色譜進(jìn)行氫氣含量測定；三、反應(yīng)器B室中產(chǎn)生氫氣量代入回歸方程，計(jì)算得到反應(yīng)器A室中厭氧秸稈糖化復(fù)合菌系或厭氧秸稈糖化菌株降解秸稈所產(chǎn)生的還原糖的量，即完成。本發(fā)明能真實(shí)反應(yīng)糖化能力，具備了很好的連續(xù)性和實(shí)效性，能實(shí)時(shí)的量化糖化效果。
文檔編號C12Q1/02GK101906458SQ20101023513
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者任南琪, 劉冰, 徐誠蛟, 王愛杰 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)