專利名稱：一個耐旱基因SpUSP的克隆及其在抗逆方面的應用的制作方法
技術領域：
本專利屬于植物基因工程領域。具體涉及植物抗逆生物技術領域中，一個新鑒定 的植物USP基因，該USP基因在提高植物抗旱、抗寒、耐鹽和抗氧化逆境等方面有顯著的作用。
背景技術：
干旱的最直接危害是造成農作物減產，使農業(yè)歉收，嚴重時形成大饑荒。在嚴重干 旱時，人們飲水發(fā)生困難，生命受到威脅。中國每年都有不同程度的旱災發(fā)生。常年農作物 受旱面積約3億至4億畝，每年損失糧食近158億公斤，占各種自然災害損失總量的60%。 通過引流及節(jié)水灌溉等措施，可以暫緩干旱對農作物的威脅，但不能徹底改變植物對干旱 的抗性。應對干旱，需要轉換新思路，變被動抗旱為主動抗旱，由單一抗旱轉向全面抗旱。通 過基因工程的途徑為我們提供了一條主動的抗旱途徑(Carlos et al. 2005)。植物的生長發(fā)育和對逆境的適應涉及到復雜的基因表達調控網絡，尤其是對于 干旱、低溫和高鹽等脅迫的抗逆反應是多基因參與的協(xié)同防御反應。在長期的進化過程 中植物形成了逆境應答的基因表達模式來適應不同的環(huán)境脅迫(Bray，1997 ；Shinozaki andYamaguchi-Shinozaki, 1997)。轉錄因子調控的基因表達是植物逆境應答反應的關鍵環(huán)節(jié)。目前發(fā)現(xiàn)的與植物 逆境反應相關的轉錄因子主要分為如下幾類bZIP家族轉錄因子，WRKY家族轉錄因子， AP2/EREBP家族轉錄因子，MYB家族轉錄因子，NAC家族轉錄因子。這些轉錄因子有些受 ABA誘導，如bZIP可被干旱、高鹽等逆境因子和ABA激活表達，與ABA響應元件ABRE(ABA responsiveelement)結合后，也可促進下游基因表達(Choi et al.，2000)。MYB受干旱、高 鹽、低溫等多種逆境和ABA誘導表達，與下游調控因子結合位點為TAACTG，MYB必須與靶位 點結合后，受調控基因才響應逆境表達(Abe et al.，1997)。逆境脅迫下，另有部分基因表 達與ABA含量變化無關，表明逆境響應基因中存在不依賴ABA的調控方式，如脫水響應元件 (DRE/CRT)和鋅指蛋白同源結構域基因(ZFHDR)等。本發(fā)明的SpUSP基因是以抗旱的番茄IL系(滲入系)為材料，通過基因芯片差異 雜交技術，篩選到一些與抗旱相關的候選基因，對部分候選基因進行轉基因驗證后，發(fā)現(xiàn)了 一個能顯著增強植株抗旱性的新基因，在GenBank檢索與其同源性最高的僅為58%，其保 守域為存在一類似USP (Universal stress protein)的轉錄因子，該基因克隆自潘那利番 茄(Solanumpermelli)，因此我們將其命名為SpUSP。USP轉錄因子在細菌中有少量功能的 研究，在植物關于有功能的USP轉錄因子的報道非常少，在番茄中還未見相關報道。SpUSP 包含一個USP保守結構域，它是一個小的細胞質細菌蛋白，當細胞處在外界壓力的條件下 時，它的表達會增強，從而增強細胞的存活能力，提供了一種對外界壓力的普遍抗性。USP結 構域可能和Na7/H+反向轉運體結構域，Cl_電壓通道，氨基酸透酶，蛋白質激酶等發(fā)生作用 (Kristian et al. 2003)。在大腸桿菌中有6個編碼USP的蛋白家族，其中4個形成一類蛋 白，其作用為保護細胞，減少DNA損傷。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一個新鑒定植物耐旱基因即SPUSP基因，通過在植物中超 量表達該SPUSP基因，能提高植物的抗旱和耐鹽等特性，可以增強作物在逆境下(干旱、低 溫、鹽堿等)的適應性，使植物在逆境環(huán)境中能正常生長和發(fā)育。經基因改良后的植物，特 別適用于在田間和設施環(huán)境下栽培和種植，從而有利于增強作物生產力、穩(wěn)定處理和品質、 降低農業(yè)生產風險和成本。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明利用芯片差異篩選技術，從植物中克隆得到一個新的USP基因，它的核苷酸序列與目前已經鑒定的基因序列相似程度很低，最高僅為58%，屬于一個新的基因。其 cDNA序列如序列表SEQ ID NO 1所示，序列全長為572bp，其0RF序列從92_526bp。該基 因的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，編碼145氨基酸，將該基因在植物中超量表達，可以 提高植物的抗旱、抗寒和耐鹽等逆境適應性。本發(fā)明所述的植物包括單子葉植物、雙子葉植物。本發(fā)明克隆的基因被命名為SpUSP，包括該基因的DNA序列、cDNA序列，與該序列 具有90%以上同源性的序列及編碼相同功能蛋白質的DNA序列，均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所述基因包括完整的或部分的(20個及以上)核苷酸和(6個及以上)氨
基酸系列。本發(fā)明可以通過農桿菌介導的遺傳轉化方法或其他轉基因方法把SpUSP基因轉 入植物中，通過篩選鑒定并純化，獲得純合的轉基因植株或株系均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明通過在植物體內超量表達該基因可以提高植物的抗旱性，抗寒性，耐鹽性 和抗氧化脅迫，其在抗逆方面的應用均屬于本發(fā)明的保護范圍。


序列表SEQ ID NO 1是本發(fā)明克隆的SpUSP基因的cDNA序列。序列表SEQ ID NO 2是本發(fā)明克隆的SpUSP基因編碼的氨基酸序列。圖1 是SpUSP基因正義(超量)表達載體構建過程。圖2 是圖1中PMD18-T載體的示意圖。圖3 是圖1中PMV載體示意圖。圖4 :SpUSP基因在番茄不同組織和器官中特異性表達分析。圖中1 幼葉，2 中等 葉，3 老葉，4 幼莖，5 花，6 果實，7 根。圖5 不同逆境下番茄SpUSP基因的表達分析。圖中1 :CK，2 :3iiMABA處理2h， 3 :3iiMABA處理12h，4 :4°C冷處理8小時，5 :40°C熱處理7小時，6 :10mM H202處理，7 200mMNaCl 處理 6h，8 :200mMNaCl 處理 12h，9 :2mM SA 處理。圖6 干旱處理對SpUSP轉基因番茄植株的影響。圖6A是干旱處理下的植株；圖 6B是正常澆水下生長的植株。圖7 SpUSP轉基因番茄植株和對照葉片失水情況。圖8 SpUSP轉基因番茄植株在控制澆水條件下植株鮮重與干重的差異。圖8A是鮮重，圖8B是干重。圖9 :SpUSP轉基因番茄植株在限制澆水條件下葉綠素含量差異。圖10 :SpUSP轉基因番茄植株經PEG處理后脯氨酸含量差異。圖11 低溫處理后轉基因株系和對照的生長情況。圖中圖左為對照中蔬6號，圖 右為存活的為轉基因株系E44，死亡的為E69株系。圖12 :NaCl和甘露醇處理后番茄SpUSP轉基因種子的發(fā)芽情況。圖中A，B，C為 對照未處理的番茄種子發(fā)芽情況；D，E，F(xiàn)為NaCl和甘露醇處理后番茄種子的發(fā)芽情況；A， D是轉基因株系E69 ；B, E是轉基因株系E44 ；C, F是對照中蔬6號。圖13 鹽處理對番茄SpUSP轉基因葉片葉綠素含量的影響。圖14 百草枯處理后番茄SpUSP轉基因種子的發(fā)芽抗性情況。上排清水對照，下 排添加0. 2M百草枯。圖15 百草枯處理后，番茄SpUSP轉基因植株生長的差異。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發(fā)明做出更詳細的描述。根據(jù)以下的描述和這些實施 例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況 下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。1本發(fā)明的SpUSP基因的克隆與分析本發(fā)明中的基因是根據(jù)番茄耐旱基因芯片雜交結果，對大量候選基因進行轉基因 功能驗證的基礎上，發(fā)現(xiàn)番茄SpUSP基因能顯著增強植株對逆境的抵抗能力?；蛐酒s交結果表明，SpUSP基因在耐旱與干旱敏感的材料中表達量存 在明顯差異，根據(jù)基因芯片注釋的基因信息(Http //solgenomics, net/tomato/)， 設計擴增SpUSP基因的引物，正向引物為5，-CACGCGGCAAGAGAGAATACATGGA-3，，反向 引物為5，-ATAATGTAATGAATGTGTTGGGCGA-3，，通過PCR的方法，從野生番茄種潘那利 (S.pennellii)引自美國番茄遺傳資源中心(TGRC)中擴增出全長SpUSP基因cDNA序列。 擴增方法是先提取番茄RNA，然后利用反轉錄試劑盒(購自T0Y0B0公司，日本)，按照試劑 盒說明書反轉錄合成SpUSP基因的cDNA，利用上述設計SpUSP基因的引物，通過PCR擴增 得到SpUSP全長基因，經1 %瓊脂糖凝膠檢測，用回收試劑盒(購自北京普博欣公司，具體 程序見說明書)回收目的片段，克隆至PMD18-T載體(購自TAKARA公司)，取5 y L連接 產物熱擊法(參照J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版 社，2002版)轉化大腸桿菌DH5 a，涂布于含有氨芐青霉素/異丙基-卩-D-硫代半乳糖苷 /5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-半乳糖甘(Amp/IPTG/X-gal)的LB固體平板上，37°C培養(yǎng)過 夜，挑選藍斑1個和白斑若干，于含Amp 50mg/L的液體LB培養(yǎng)基中，37°C 200r/min振蕩培 養(yǎng)過夜，用小量法提取質粒(試劑盒購自北京普博欣公司，具體程序見說明書)。質粒用限 制性內切酶(Xhol和BamHI)酶切，對經檢測正確的陽性重組克隆進行序列測定，測序工作 由上海英駿生物技術有限公司完成。利用GENESCAN對該基因序列分析，結果表明，該基因序列全長為572bp，編碼145 個氨基酸(見序列表SEQ ID NO. 1所示)。該基因含有2個內含子，具有USP基因的保守結 構域。利用BLAST軟件(程序)在NCBLMicroTom和TIGR數(shù)據(jù)庫上進行搜索，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明克隆的基因序列與目前公布的基因序列的同源性均很低，最高的僅為58%，屬于一個新的 與植物耐旱性狀相關的候選基因，申請人將其命名為SpUSP。2載體構建在擴增SpUSP基因的引物兩側分別加上Sal I和Kpn I酶切位點，隨后以潘那 利cDNA為模板，進行PCR擴增，將擴增的產物克隆到PMD18-T載體，具體步驟見本發(fā)明的 SpUSP基因的克隆與分析部分。隨后，以Sal I和Kpnl雙酶切帶有目的基因全長片段的 PMD18-T載體，同時以Xho I和Kpnl雙酶切pMV載體，1. 0%瓊脂糖膠檢測，回收目的基因片 段及PMV的載體大片段，將回收的目的基因片段與pMV的載體大片段以1 1的比例混合， 加入T4DNA連接酶2U，1 X反應緩沖液，無菌水補充體積至20 u L。22°C連接lh，取5 y L連 接產物轉化大腸桿菌DH5ci，Km抗性平板篩選陽性克隆，酶切檢測。pMV載體和PMD18-T載 體的示意圖及其構建流程見圖1，圖2和圖3。對獲得的重組克隆利用電轉化儀在1800V的電壓下轉化農桿菌C58，用含利福平 (Rif) 100mg/L,卡那霉素(Km) 50mg/L的LB固體平板篩選，挑選陽性克隆，28°C、150r/min振 蕩培養(yǎng)過夜，收集20 u L菌液，ddH20重懸，95°C變性lOmin, 10000r/min離心lmin,取2 y L 上清液作為模板，以上述SpUSP基因的引物進行重組質粒的PCR陽性檢測，確認為陽性的保 存后用于進一步的遺傳轉化。3遺傳轉化將中蔬6號番茄種子(購自中國農科院蔬菜花卉研究所)經次氯酸鈉消毒15min， 播種于1/2MS培養(yǎng)基上(pH = 5. 8)，于25士2°C，黑暗條件下培養(yǎng)直至種子發(fā)芽，轉入光照 強度為18001x，16h光/8h暗的光周期條件下進行培養(yǎng)。切取7-8d苗齡無菌苗子葉預培養(yǎng) 2d (培養(yǎng)基為MS，pH = 5. 8)。MS。重懸至0D6QQ 0. 5的農桿菌液浸染3-5min，用滅菌濾紙 吸干多余菌液，重新置回預培養(yǎng)基上，黑暗條件下共培養(yǎng)2d，轉入到篩選培養(yǎng)基1. 0ZR+頭 孢霉素(Cef)400mg/L+卡拉霉素(Km) 100mg/L)上進行抗性篩選，每兩周繼代一次，抗性芽 出現(xiàn)后將外植體轉入0. 2ZR+Cef (頭孢霉素)200mg/L+Km(卡拉霉素)100mg/L的培養(yǎng)基中。 于20 30d后切下抗性芽，轉移至生根培養(yǎng)基(編號為RM)中誘導生根，根系發(fā)達的植株 移栽花缽。上述培養(yǎng)基的具體配方見表1所示。 表1番茄遺傳轉化培養(yǎng)基配方0
權利要求
一種克隆的植物抗旱基因，它的核苷酸如序列表SEQ ID NO1所示。
2.一種克隆的植物抗旱基因，它的蛋白質序列如SEQ ID N0:2所示。
3.權利要求1所述的基因在番茄抗逆境中的應用。
4.權利要求2所述的基因在番茄抗逆境中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，尤其屬于番茄轉基因技術領域?？寺〉玫揭环N與植物抗旱相關的基因SpUSP，該基因的核苷酸如序列表SEQ ID NO1所示，它的蛋白質序列如SEQ ID NO2所示。生物學功能驗證和遺傳轉化表明，該基因可在番茄抗逆育種和遺傳改良中應用，為番茄類植物提供了一種新的基因資源。
文檔編號C12N15/29GK101988068SQ20101023524
公開日2011年3月23日 申請日期2010年7月21日 優(yōu)先權日2010年7月21日
發(fā)明者盧永恩, 葉志彪, 張余洋, 張俊紅, 李漢霞, 王濤濤, 理查德 申請人:華中農業(yè)大學