專利名稱：：一種大腸桿菌多個(gè)腸毒素基因的融合體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種基因工程亞單位疫苗，特別涉及一種產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)多價(jià)腸毒素免疫原，用于預(yù)防和治療由ETEC等細(xì)菌引起的腹瀉。
背景技術(shù)：
：產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)可引起幼齡動(dòng)物(包括仔豬、犢牛、羔羊等)的急性、傳染性腹瀉，嚴(yán)重危害畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，并且造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。ETEC還是發(fā)展中國(guó)家嬰幼兒及旅游者腹瀉的主要病原體，全球每年因ETEC感染的腹瀉病例高達(dá)6.5億人次，導(dǎo)致約38萬(wàn)5歲以下兒童死亡(Sizemore等，2004年，ExpertRev.Vaccines)。ETEC引起腹瀉發(fā)生的作用機(jī)理是細(xì)菌首先借助其表面的菌毛等黏附素定植于小腸粘膜上皮細(xì)胞上，進(jìn)而在腸道內(nèi)大量繁殖并產(chǎn)生腸毒素，作為直接致病因子的腸毒素使腸上皮細(xì)胞代謝紊亂，分泌大量水分和電解質(zhì)進(jìn)入腸腔，最終導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。ETEC的菌毛種類繁多，動(dòng)物來(lái)源菌株的菌毛，較重要的有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F18、F41等；人源ETEC的菌毛更多，已鑒定的超過(guò)25種。但是ETEC分泌的腸毒素只有兩種，不耐熱腸毒素LT和耐熱腸毒素ST，ST分為STa和STb兩個(gè)亞型。對(duì)于ETEC性腹瀉的治療，生產(chǎn)中主要應(yīng)用抗生素及化學(xué)藥物。但控制此病的關(guān)鍵在于預(yù)防，預(yù)防的方法除了保持衛(wèi)生、消毒環(huán)境外，主要使用疫苗免疫預(yù)防。目前商品化的ETEC疫苗有全菌滅活疫苗，菌毛亞單位疫苗和類毒素疫苗。以下列舉獲得我國(guó)農(nóng)業(yè)部獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)的4個(gè)疫苗，它們是在生產(chǎn)實(shí)踐中使用的獸用大腸桿菌疫苗的典型代表(1)羊大腸埃希氏菌病滅活疫苗，黑龍江省生物制品一廠，獸藥生字(2006)080074009。(2)仔豬大腸桿菌三價(jià)滅活疫苗，齊魯動(dòng)物保健品保健公司，獸藥生字(2006)150251028。(3)仔豬大腸桿菌病K88/K99雙價(jià)基因工程滅活疫苗，上海海利生物藥品有限公司，獸藥生字(2007)090201027ο(4)仔豬大腸桿菌病Κ88、LTB雙價(jià)基因工程活疫苗，中牧實(shí)業(yè)股份有限公司江西生物藥廠，獸藥生字(2008)140401025。不耐熱腸毒素LT由兩個(gè)亞基組成，A亞基(LTA)是毒性中心，B亞基(LTB)是一個(gè)五聚體結(jié)構(gòu)，沒有毒性且有良好的免疫原性，常常被用作疫苗的成分。耐熱腸毒素STa和STb是分子量很小的半抗原，缺乏免疫原性，若直接用全菌滅活疫苗免疫無(wú)法誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)STa和STb的中和抗體。為了解決這一問(wèn)題，可以將耐熱腸毒素STa或STb偶聯(lián)到大分子的載體蛋白上，使它們具備免疫原性(I.Klipstein等Developmentofavaccineofcross-linkedheat-stableandheat-labileenterotoxinsthatprotectsagainstEscherichiacoliproducingeitherenterotoxin.Infect.Immun.1982,37(2)550-557.II.Dubreuil等ArecombinantEscherichiacoliheat-stableenterotoxinb(STb)fusionproteinelicitingneutralizingantibodies,FEMSImmunol.Med.Microbiol.1996，13:317_323·)。雖然ST是導(dǎo)致腹瀉發(fā)生的重要致病因子，但由于天然STa和STb分子沒有免疫原性，現(xiàn)在上市的疫苗產(chǎn)品都不含有ST成分。在已知的現(xiàn)有技術(shù)中，為了制備有效的STa或STb類毒素，研究人員還構(gòu)建了下列融合亞單位疫苗①LTB-STa二價(jià)融合腸毒素(張兆山等，不耐熱腸毒素和耐熱腸毒素基因的融合·中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1994，14(04)=219-222.)②STa-LTB二價(jià)融合腸毒素(許崇波等，大腸桿菌腸毒素ST1_LT_B融合基因的構(gòu)建·中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，18(05)=463-465.)③KSSac-STl-LTB三價(jià)融合腸毒素及菌毛蛋白(許崇波等，表達(dá)大腸桿菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25(01)9-12.)④LTB-STa-STb三價(jià)融合腸毒素(葛艷等，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌腸毒素LTB、STI和STII融合基因的構(gòu)建與表達(dá)研究.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002,24(05)=27-29.)⑤STa-STb-LTB三價(jià)融合腸毒素(武冬梅等，大腸桿菌腸毒素STI、STII、LTB融合基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15(05)150-154.)如前所述，致病菌ETEC的菌毛類型眾多，分離到的臨床致病株常常表達(dá)一些尚未鑒定的菌毛，因而只使用幾種常見類型的ETEC制備多價(jià)滅活全菌疫苗，其保護(hù)范圍是不夠的，經(jīng)常會(huì)遇到保護(hù)率偏低的問(wèn)題。與多種多樣的菌毛黏附素相比，腸毒素只有LT和ST兩類，不論ETEC產(chǎn)生什么類型的菌毛，最終都是依靠這兩種腸毒素引起發(fā)病，因此利用腸毒素制備疫苗可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)所有類型ETEC菌株的目的，其優(yōu)勢(shì)是免去制備多種(針對(duì)不同的菌毛型別)ETEC疫苗的麻煩，簡(jiǎn)化了免疫方案，降低了成本；能引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生更高水平的LT抗體，更重要的是能誘導(dǎo)ST抗體的產(chǎn)生(滅活疫苗無(wú)此功效)，因而能夠提高免疫預(yù)防的效果，并且具有一定的治療作用。上述文獻(xiàn)①、②、③中的三類融合腸毒素沒有包含STb，因而其免疫保護(hù)效果不全面；④和⑤包含了全部3種重要的腸毒素，但是其融合方案并非最優(yōu)。當(dāng)三種蛋白進(jìn)行融合時(shí)，一般位于中間的蛋白會(huì)比位于兩端的蛋白受到更大影響，其空間結(jié)構(gòu)會(huì)因?yàn)閮蓚?cè)融合蛋白的作用而改變，從而改變其免疫原性。所以，對(duì)于文獻(xiàn)④的設(shè)計(jì)的融合蛋白LTB-STa-STb，其不足是STa的抗原決定簇會(huì)受到兩側(cè)蛋白的影響而改變，從而無(wú)法呈現(xiàn)最佳的免疫原性。同理，文獻(xiàn)⑤構(gòu)建的STa-STb-LTB，缺陷是STb不能呈現(xiàn)最佳的免疫原性。針對(duì)它們的不足，本發(fā)明做了有效的改進(jìn)，使STa和STb的免疫原性都得到提高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)疫苗保護(hù)范圍較窄、不能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的抗耐熱腸毒素(STa及STb)抗體的不足，提供一種多價(jià)融合腸毒素免疫原，可以作為疫苗用于控制由ETEC等細(xì)菌引起的腹瀉，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)大保護(hù)范圍、提高保護(hù)率的效果。本發(fā)明的技術(shù)方案如下獲得產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的三段腸毒素基因STa，STb及LTB，將三者首尾相接連接在一起形成多價(jià)融合腸毒素基因，其融合的順序從5’端至3’端為STa-LTB-STb或STb-LTB-STa,即LTB位于中間、STa和STb位于兩側(cè)。為了增強(qiáng)多價(jià)腸毒素融合基因作為DNA疫苗免疫母雞的效果，可以在其上游連接雞的分泌性蛋白的信號(hào)肽基因。對(duì)于構(gòu)建的融合基因，LTB可以由LTB的片段代替，或者由CTB(霍亂毒素B亞基)或CTB的片段代替；STa和STb可以是單個(gè)基因或多個(gè)基因串聯(lián)在一起，或者是STa和STb的片段或多個(gè)片段的串連體。所述的腸毒素基因STa，STb,LTB,CTB的片段是指從全基因上截取的含有一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇的基因片段，其長(zhǎng)度至少是15個(gè)核苷酸，可通過(guò)相關(guān)生物軟件來(lái)分析、預(yù)測(cè)并選取這些基因片段。將獲得的多價(jià)基因插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)即可獲得多價(jià)腸毒素融合蛋白。構(gòu)建三價(jià)腸毒素融合基因STa-LTB-STb或STb-LTB-STa的技術(shù)方案及其應(yīng)用如下(1)分別擴(kuò)增STa、STb及LTB的基因以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的STa(V00612.1)、STb(E00811.1)及LTB(M17873.1)的全基因序列，在需要連接的兩個(gè)腸毒素基因上設(shè)計(jì)具有互補(bǔ)末端的引物，常規(guī)PCR反應(yīng)擴(kuò)增STa、STb及LTB的成熟基因。(2)使用重疊延伸PCR法，先將LTB與STa(或STb)連接，再將得到的二價(jià)融合基因與第三個(gè)基因STb(或STa)相連，從而得到5，-STa-LTB-STb-3，或5，-STb-LTB-STa-3，形式的融合基因。(3)可選步驟擴(kuò)增雞的分泌性蛋白的信號(hào)肽基因(命名為L(zhǎng))，同樣用重疊延伸PCR法將其融合到三價(jià)腸毒素融合基因的上游，得到如5，-L-STa-LTB-STb-3，或5’-L-STb-LTB-STa-3’形式的融合基因。優(yōu)選的信號(hào)肽基因?yàn)殡u胰島素基因的信號(hào)肽，長(zhǎng)度是72個(gè)堿基，其序列為5‘-ATGGCTCTCTGGATCCGATCACTGCCTCTTCTGGCTCTCCTTGTCTTTTCTGGCCCTGGAACCAGCTATGCA-3’；或者為雞的尿激酶型纖溶酶原激活物(upa)基因的信號(hào)肽，長(zhǎng)度是60個(gè)堿基，其序列為5‘-ATGAAGTTAATCATCTTTCTCACAGTAACTCTCTGCACACTTGTCACAGGACTTGATTCT-3’。(4)利用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，將三價(jià)腸毒素融合基因插入真核表達(dá)載體得到重組質(zhì)粒，即可作為三價(jià)腸毒素DNA疫苗；或?qū)⑷齼r(jià)腸毒素融合基因插入原核表達(dá)載體，得到的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中經(jīng)表達(dá)獲得融合腸毒素蛋白，即為腸毒素蛋白疫苗。(5)三價(jià)腸毒素疫苗的應(yīng)用用得到的三價(jià)腸毒素DNA疫苗或三價(jià)腸毒素蛋白疫苗免疫懷孕母畜，可以為吸食母乳的新生幼仔提供被動(dòng)免疫保護(hù)；這兩類疫苗也可直接用于免疫幼畜，使幼畜產(chǎn)生主動(dòng)免疫，預(yù)防腹瀉的發(fā)生；兩類疫苗還可以用于免疫蛋雞，得到含有抗腸毒素卵黃抗體的免疫雞蛋，再利用免疫雞蛋中的抗體給幼畜口服，同樣可以使其獲得被動(dòng)免疫保護(hù)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)是將3段重要的腸毒素STa、STb和LTB連接在一起并進(jìn)行了優(yōu)化組合，采用的融合方案是“STa-LTB-STb”或“STb-LTB-STa”。也就是說(shuō)本發(fā)明是將載體蛋白LTB置于中間，而兩個(gè)半抗原STa和STb分居兩端。上文“
背景技術(shù)：
”中文獻(xiàn)④與⑤的融合腸毒素沒有將LTB置于中間，而是將其置于一端，將STa或STb放在中間位置。為了克服滅活疫苗及LT類毒素不能誘導(dǎo)ST抗體的不足，增強(qiáng)STa和STb的免疫原性是構(gòu)建高效腸毒素疫苗的關(guān)鍵，所以將STa和STb融合在載體蛋白的兩端可以最大程度的保存其天然的抗原決定簇，使它們具有最大的免疫原性，因而本發(fā)明提供的腸毒素融合方式優(yōu)于文獻(xiàn)④與⑤的融合方案。具體而言，用文獻(xiàn)④的LTB-STa-STb融合蛋白免疫動(dòng)物后，誘導(dǎo)的STa抗體的活性相對(duì)不足；用文獻(xiàn)⑤的STa-STb-LTB融合蛋白免疫動(dòng)物后，誘導(dǎo)的STb抗體的活性相對(duì)不足。如果使用本發(fā)明提供的多價(jià)融合腸毒素“STa-LTB-STb”或“STb-LTB-STa”免疫動(dòng)物，相比于現(xiàn)有的腸毒素疫苗，其優(yōu)勢(shì)在于能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的STa抗體和STb抗體，從而獲得更高的保護(hù)率，提高疫苗的保護(hù)效果，降低ETEC性腹瀉的發(fā)生率。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.制備三價(jià)腸毒素DNA疫苗和蛋白疫苗(1)擴(kuò)增腸毒素基因STa不使用模板、直接用如下引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，條件94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，25個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5分鐘。STa-Fl:5，_agggaattcaccatgaacacattctactgctgcgagctgtgctgcaat_3，STa-R5'_tagcaggtgggtagcagccagcggcggcgggattgcagcacagc_3，(2)擴(kuò)增腸毒素基因LTB及STb模板用K88ac菌株(C83902，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)查所)裂解物，使用引物如下，作常規(guī)PCR擴(kuò)增，條件94°C預(yù)變性60秒，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸40秒，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5分鐘。LTB-F:5，-gctacccacctgctagcccagctccccagactattacag-3，LTB-R:5，_tggtgtggtgctggcgctgtttttcatactgattgcc_3，STb-F:5，-gccagcaccacaccaccctctacacaatcaaataagaaagat-3，STb-R:5，_cgctctagatcctcagcatccttttgctgcaaccat_3，(3)連接LTB與STb以獲得LTB-STb模板用上一步的PCR產(chǎn)物L(fēng)TB及STb的混合物，引物使用上一步用到的LTB-F，STb-R,PCR反應(yīng)條件如步驟(2)。(4)連接STa與LTB-STb以獲得STa-LTB-STb模板用步驟(1)與(3)的PCR產(chǎn)物STa與LTB-STb的混合物，使用引物如下，PCR反應(yīng)條件如步驟(2)。STa-F25'-acc:|gaattc[accatgaacacattc-3‘,含有EcoRI位點(diǎn)STbRl:5，-acc板ctag^ltcctcagcatcc-3，，含有XbaI位點(diǎn)(5)構(gòu)建三價(jià)腸毒素DNA疫苗pCI-STa-LTB-STb用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，將三價(jià)腸毒素融合基因STa-LTB-STb利用兩端的酶切位點(diǎn)克隆入真核表達(dá)載體PCI(美國(guó)Promega公司)中，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中。(6)DNA疫苗pCI-STa-LTB-STb的制備大量培養(yǎng)含質(zhì)粒pCI-STa-LTB-STb的E.coliDH5α，使用SDS堿裂解法分離質(zhì)粒、聚乙二醇法純化質(zhì)粒(參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版第一章方案3和方案8，作者為J.Sambrook和D.W.Russel1)，即可獲得用于免疫動(dòng)物的三價(jià)腸毒素DNA疫苗pCI-STa-LTB-STb。(7)構(gòu)建三價(jià)腸毒素原核表達(dá)載體pET30-STa-LTB_STb使用如下一對(duì)引物，以構(gòu)建好的pCI-STa-LTB-STb質(zhì)粒作模板，擴(kuò)增得到三價(jià)腸毒素融合基因STa-LTB-STb，再利用其兩端的酶切位點(diǎn)克隆入原核表達(dá)載體pET30a(+)(美國(guó)Novagen公司)中，獲得重組質(zhì)粒pET30-STa-LTB_STb并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中。ssFl:5，-gcctaca.catatg;aacacattctactg-3，，含有NdeI位點(diǎn)ssRl:5，-acg;ctcgag,gcatccttttgctgcaaccatta-3，，含有XhoI位點(diǎn)(8)表達(dá)融合腸毒素STa-LTB-STb并分離純化培養(yǎng)重組大腸桿菌BL21(DE3)pET30-STa-LTB-STb,添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分離包涵體(其主要成分是融合腸毒素蛋白STa-LTB-STb)，充分洗滌除去雜質(zhì)，再用高濃度的尿素緩沖液溶解包涵體，超濾法除去尿素并復(fù)性包涵體，即得到可溶性的融合腸毒素STa-LTB-STb，可以與合適的佐劑混合制成疫苗，也可不加佐劑單獨(dú)使用。STa-LTB-STb包涵體還可以不經(jīng)溶解、復(fù)性處理，只通過(guò)洗滌步驟后直接作為疫苗使用，這樣也可以激發(fā)抗腸毒素抗體的產(chǎn)生，但比可溶性STa-LTB-STb蛋白的免疫原性稍弱。實(shí)施例2.構(gòu)建含有雞胰島素信號(hào)肽的三價(jià)腸毒素DNA疫苗pCI-ins-STa-LTB-STb(1)擴(kuò)增雞胰島素信號(hào)肽基因ins不使用模板、直接用如下引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，條件94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，25個(gè)循環(huán)，最后72°C再延伸5分鐘。insF5'-aac；|gaattc|；accatggctctctggatccgatcactgcctcttctggctctccttgt-3',含有EcoRI位點(diǎn)insR5'-gcagtagaatgtgtttgcatagctggttccagggccagaaaagacaaggagagccag-3'(2)擴(kuò)增耐熱腸毒素基因STa不使用模板、直接用如下引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同步驟(1)。STa-F:5，_aacacattctactgctgcgagctgtgctgcaatccc_3，STa-R5'_tagcaggtgggtagcagccagcggcggcgggattgcagcacagc_3，(3)連接ins與STa以獲得ins-STa模板用前兩步的PCR產(chǎn)物ins及STa的混合物，引物使用insF和STa_R，PCR反應(yīng)條件如步驟(1)。(4)連接ins-STa與LTB-STb以獲得ins-STa-LTB-STb模板用PCR產(chǎn)物ins-STa及LTB-STb(制備方法同實(shí)施例1)的混合物，引物使用insF和STb-R(見實(shí)施例1)，PCR反應(yīng)條件如步驟(1)。(5)構(gòu)建表達(dá)雞胰島素信號(hào)肽的三價(jià)腸毒素DNA疫苗pCI-ins-STa-LTB-STb用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，將ins-STa-LTB-STb利用兩端的酶切位點(diǎn)克隆入真核表達(dá)載體PCI中，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5ci中。(6)DNA疫苗pCI-ins-STa-LTB-STb的制備制備方法同實(shí)施例1的步驟(6)。實(shí)施例3.構(gòu)建含有雞尿激酶型纖溶酶原激活物(upa)信號(hào)肽的三價(jià)腸毒素DNA疫苗pCI-upa-STa-LTB-STb7(1)擴(kuò)增雞upa的信號(hào)肽基因upa不使用模板、直接用如下引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，條件94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，25個(gè)循環(huán)，最后72°C再延伸5分鐘。upaF5'-aac|gaattc|;accatgaagttaatcatctttctcacagtaactctctgcac-3‘,含有EcoRI位點(diǎn)upaR:5，-gcagtagaatgtgttagaatcaagtcctgtgacaagtgtgcagagagttactg-3，(2)擴(kuò)增腸毒素基因STa制備方法同實(shí)施例2的步驟(2)。(3)連接upa與STa以獲得upa-STa模板用前兩步的PCR產(chǎn)物upa及STa的混合物，引物使用upaF和STa_R(見實(shí)施例2)，PCR反應(yīng)條件如步驟⑴。(4)連接upa-STa與LTB-STb以獲得upa-STa-LTB-STb模板用PCR產(chǎn)物upa-STa及LTB-STb(制備方法同實(shí)施例1)的混合物，引物使用upaF和STb-R(見實(shí)施例1)，PCR反應(yīng)條件如步驟(1)。(5)構(gòu)建表達(dá)雞upa信號(hào)肽的三價(jià)腸毒素DNA疫苗pCI-upa-STa-LTB-STb用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，將upa-STa-LTB-STb利用兩端的酶切位點(diǎn)克隆入真核表達(dá)載體PCI中，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5ci中。(6)DNA疫苗pCI-upa-STa-LTB-STb的制備制備方法同實(shí)施例1的步驟(6)。實(shí)施例4.三價(jià)腸毒素DNA疫苗和蛋白疫苗免疫蛋雞制備抗毒素卵黃抗體(IgY)及IgY對(duì)仔豬的保護(hù)效果用4種免疫原三價(jià)腸毒素DNA疫苗pCI-ins-STa-LTB-STb(pCI-ins-SLS)、pCI-upa-STa-LTB-STb(pCI-upa-SLS)、pCI-STa-LTB-STb(pCI-SLS)以及三價(jià)腸毒素蛋白疫苗STa-LTB-STb(SLS)免疫海蘭褐母雞，每組5只母雞，在開產(chǎn)前半個(gè)月進(jìn)行首次免疫，兩周后二免，再隔三周后進(jìn)行三免。免疫方式DNA疫苗——胸部肌肉兩點(diǎn)加上大腿肌肉兩點(diǎn)；蛋白疫苗——胸部肌肉兩點(diǎn)，頸部皮下一點(diǎn)。免疫劑量/雞/次200μg質(zhì)粒DNA或400μg蛋白。三免后10天開始連續(xù)收集雞蛋，用水稀釋法分離IgY。水稀釋法的主要步驟分離卵黃，加入6倍體積的蒸餾水，0.IM稀鹽酸調(diào)節(jié)pH為5.0，4°C靜置過(guò)夜，離心取上清，即為含有IgY的水溶性組分，硫酸銨鹽析，超濾除鹽。用間接ELISA法檢測(cè)三種腸毒素STa、STb及LTB的特異性抗體的效價(jià)。ELISA實(shí)驗(yàn)中用于包被96孔板的抗原是用大腸桿菌表達(dá)的融合腸毒素GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)-STa、Trx(硫氧還蛋白)-STb及LTB。二抗為HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG，顯色底物TMB，檢測(cè)450nm下的OD值?？贵w的效價(jià)定義為OD45tlnm值>0.2的IgY的最大稀釋倍數(shù)。表1.三次免疫后抗三種腸毒素特異性卵黃抗體的效價(jià)序分組—[種腸毒素抗體的效價(jià)號(hào)STaSTbLTB1pCI-ins-SLS1,6006,40025,6002pCI-upa-SLS1,2006,40020,0003pCI-SLS8003,20016,0004SLS蛋白3,20012,80051,200仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn)每組8只新生仔豬，人工飼喂牛奶而不喂母乳，實(shí)驗(yàn)組每天口服IOml卵黃(來(lái)自于接受免疫的母雞產(chǎn)的雞蛋)，對(duì)照組口服普通卵黃10ml，服用3天。第4天口服ETECK88菌株IXIO12CFU/頭進(jìn)行攻毒。此后觀察10天，記錄發(fā)病和死亡情況，在此期間各組飼喂普通牛奶。從10天后的仔豬存活情況看，用三價(jià)腸毒素DNA疫苗和三價(jià)腸毒素蛋白疫苗免疫蛋雞獲得的卵黃抗體都能夠起到有效的保護(hù)作用，預(yù)防ETEC引起的腹瀉。表2.仔豬先服用抗腸毒素IgY、再經(jīng)ETEC攻毒后的存活情況序號(hào)分組存活數(shù)數(shù)存活率1pCI-ins-SLS6/875%2pCI-upa-SLS6/875%3pCI-SLS5/862.5%4SLS蛋白8/8100%5對(duì)照組1/812.5%實(shí)施例5.三價(jià)腸毒素蛋白疫苗免疫妊娠母豬對(duì)仔豬產(chǎn)生的被動(dòng)保護(hù)作用使用如下三種疫苗(1)商品化仔豬大腸埃希氏菌病三價(jià)滅活疫苗(由K88，K99，987P三種株菌組成)(2)三價(jià)腸毒素蛋白STa-LTB-STb(SLS)(3)三價(jià)腸毒素蛋白SLS與Κ88菌毛等質(zhì)量混合(SLS+K88菌毛)熱洗脫法制備Κ88菌毛將Κ88菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)36h。離心收集菌體，PBS重懸，置60°C水浴30min，振蕩lOmin，離心取上清，用直徑0.22μm濾膜過(guò)濾，濾液即為K88菌毛粗提物。將粗提物用2.5%檸檬酸調(diào)pH至4.0，4°C靜置2h，4°C11000r/min離心30min，棄上清，沉淀用PBS溶解，這一過(guò)程重復(fù)三次，最終獲得純化的9K88菌毛蛋白。實(shí)驗(yàn)共使用12頭母豬，分為4組——3個(gè)疫苗免疫組和1個(gè)對(duì)照組，每組3頭。妊娠母豬在產(chǎn)仔前40日和15日各肌肉注射1次。免疫劑量三價(jià)滅活疫苗按說(shuō)明書使用，SLS蛋白組為IOmg/頭，SLS+K88菌毛組為20mg/頭。產(chǎn)仔后取各組母豬的乳汁混合，間接ELISA法檢測(cè)乳汁中抗K88菌毛、STa,STb,LTB特異性抗體的效價(jià)，具體方法同實(shí)施例4。攻毒試驗(yàn)各組仔豬3日齡時(shí)口服ETECK88或F41菌株1XIO12CFU/頭進(jìn)行攻毒。此后觀察10天，各組仔豬繼續(xù)服用母乳，記錄發(fā)病和死亡情況。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3可見，本發(fā)明提供的三價(jià)腸毒素蛋白STa-LTB-STb免疫妊娠母豬后，可在其乳汁中檢測(cè)到高效價(jià)的三種抗毒素，仔豬攝入這樣的乳汁后，使其在遭到ETEC強(qiáng)毒株人工感染時(shí)能夠獲得有效的保護(hù)，存活率達(dá)到70-80%，攝入普通母乳的對(duì)照組仔豬存活率不及10%。商品化的三價(jià)滅活疫苗對(duì)于同源菌株的感染(本例中為K88)有較好的保護(hù)率(70%)，但對(duì)于異源菌株F41感染的保護(hù)率較低(40%)。相反，SLS重組腸毒素對(duì)各種菌毛類型的菌株(本例中為K88和F41)的保護(hù)率都很高，充分說(shuō)明本發(fā)明提供的三價(jià)腸毒素SLS與傳統(tǒng)滅活疫苗相比，不受ETEC菌毛類型的限制，有更廣的保護(hù)范圍。將三價(jià)腸毒素SLS與菌毛蛋白混合，制備的多價(jià)疫苗對(duì)同源菌株的保護(hù)效果更好，仔豬的存活率達(dá)到90%，因而本發(fā)明提供的三價(jià)腸毒素SLS可以作為其他多價(jià)或多聯(lián)疫苗的一個(gè)組分而被使用。表3.妊娠母豬乳汁中特異性抗體的效價(jià)及仔豬經(jīng)攻毒后的存活情況權(quán)利要求一種大腸桿菌多個(gè)腸毒素基因的融合體，其特征是含有3種不帶信號(hào)肽序列的成熟基因不耐熱腸毒素LT、耐熱腸毒素STa及STb，其融合的順序是LT居中，STa和STb在兩側(cè)，此多價(jià)融合基因是“5’STaLTSTb3’”或“5’STbLTSTa3’”。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大腸桿菌多個(gè)腸毒素基因的融合體，其特征在于不耐熱腸毒素LT是指不耐熱腸毒素LT的B亞基LTB、LTB的突變體、含有LTB抗原決定簇的基因片段或LTB的類似物霍亂毒素B亞基。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大腸桿菌多個(gè)腸毒素基因的融合體，其特征在于STa、LT和STb任意兩個(gè)融合基因之間由超過(guò)15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的連接序列連接。4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種大腸桿菌多個(gè)腸毒素基因的融合體，其特征在于3種腸毒素基因LT、STa或STb是其正?；?、突變基因、基因的片段、多個(gè)基因的串聯(lián)體或多個(gè)基因片段的串聯(lián)體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種大腸桿菌多個(gè)腸毒素基因的融合體，其特征在于在其5’端加上信號(hào)肽序列。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種大腸桿菌多個(gè)腸毒素基因的融合體，其特征在于所述的信號(hào)肽序列是指雞的胰島素的信號(hào)肽，其序列長(zhǎng)度為72個(gè)堿基，其序列為ATGGCTCTCTGGATCCGATCACTGCCTCTTCTGGCTCTCCTTGTCTTTTCTGGCCCTGGAACCAGCTATGCA。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種大腸桿菌多個(gè)腸毒素基因的融合體，其特征在于所述的信號(hào)肽序列是指雞的尿激酶型纖溶酶原激活物(upa)的信號(hào)肽，其序列長(zhǎng)度為60個(gè)堿基，其序列為ATGAAGTTAATCATCTTTCTCACAGTAACTCTCTGCACACTTGTCACAGGACTTGATTCT。8.應(yīng)用權(quán)利要求1或5所述的一種大腸桿菌多個(gè)腸毒素基因的融合體，其特征在于將它克隆至適當(dāng)?shù)恼婧吮磉_(dá)載體中，制成核酸疫苗，免疫動(dòng)物用于防治產(chǎn)腸毒素大腸桿菌引起的腹瀉。9.一種產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的多價(jià)融合腸毒素蛋白，其由權(quán)利要求1所述的一種大腸桿菌多個(gè)腸毒素基因的融合體在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多價(jià)融合腸毒素蛋白，其特征在于單獨(dú)作為疫苗使用，或者作為一個(gè)組分被加入其他多價(jià)或多聯(lián)疫苗中，免疫動(dòng)物或人防治由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌引起的腹瀉。全文摘要本發(fā)明涉及一種大腸桿菌(E.coli)三價(jià)腸毒素融合基因及其應(yīng)用，屬于基因工程亞單位疫苗領(lǐng)域。產(chǎn)腸毒素E.coli(ETEC)是引起幼畜及嬰幼兒腹瀉的主要病原，針對(duì)現(xiàn)有ETEC疫苗保護(hù)范圍窄、不能誘導(dǎo)高水平抗毒素的不足，本發(fā)明設(shè)計(jì)一種三價(jià)E.coli腸毒素融合體，其融合模式為5’-STa-LT-STb-3’或5’-STb-LT-STa-3’，用這種多價(jià)腸毒素基因或蛋白免疫動(dòng)物后能夠誘導(dǎo)高水平的抗STa、STb、LT抗體的產(chǎn)生，因而能夠中和關(guān)鍵致病因子腸毒素的毒性，提高免疫保護(hù)率，擴(kuò)大保護(hù)范圍(不受E.coli菌毛類型的限制)，從而有效防治ETEC性腹瀉。文檔編號(hào)C12N15/62GK101914564SQ20101023664公開日2010年12月15日申請(qǐng)日期2010年7月26日優(yōu)先權(quán)日2010年7月26日發(fā)明者吳菲菲,尤建嵩,徐永平,李化強(qiáng),李曉宇,王林會(huì),金禮吉,馬永生申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)