專利名稱：一種mhv混合細(xì)胞培養(yǎng)多種病毒的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及病毒分離培養(yǎng)方法，具體涉及一種MHV混合細(xì)胞分離培養(yǎng)多種病毒的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
病毒性傳染病傳播速度快、范圍廣、社會(huì)危害影響大。因此，及時(shí)診斷感染的病原體對(duì)社會(huì)民心的穩(wěn)定至關(guān)重要。研究報(bào)道，絕大多數(shù)的病毒性感染是由常見(jiàn)病毒病原引起， 如流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等引起呼吸道感染，腸道病毒屬的EV71、CA16是引起兒童手足口病主要病毒病原。研究顯示，病毒繁殖具有嚴(yán)格的嗜宿主細(xì)胞性，必須在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)，因此，病毒分離培養(yǎng)比較細(xì)菌的培養(yǎng)要困難。目前，實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)病毒主要是采用一種細(xì)胞系，至于采用何種細(xì)胞系則根據(jù)疾病流行特征和癥狀，推測(cè)可能感染的病毒來(lái)選取敏感細(xì)胞系。通常，流感病毒分離培養(yǎng)主要采用MDCK細(xì)胞；腺病毒、呼吸道合胞病毒采用HEP-2細(xì)胞；EV71、CA16采用Vero細(xì)胞和 MRC-5細(xì)胞。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道采用二種或三種細(xì)胞分離培養(yǎng)主要呼吸道病毒。美國(guó)有機(jī)構(gòu)專門(mén)出售二種或三種細(xì)胞的混合細(xì)胞。但目前為止，尚未見(jiàn)對(duì)于能分離培養(yǎng)呼吸道和腸道病毒的混合細(xì)胞的詳細(xì)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分離培養(yǎng)多種病毒的培養(yǎng)方法，具體涉及一種MHV混合細(xì)胞分離培養(yǎng)多種病毒的培養(yǎng)方法。本發(fā)明方法主要涉及呼吸道病毒中的甲、乙型流感病毒、腺病毒，腸道病毒中的EV71病毒分離培養(yǎng)，尤其涉及MDCK、HEP-2、Vero三種細(xì)胞分離培養(yǎng)常見(jiàn)呼吸道病毒、常見(jiàn)腸道病毒培養(yǎng)方法。本方法通過(guò)T75細(xì)胞瓶制備MDCK、HEP-2、Vero單層細(xì)胞，單層細(xì)胞經(jīng)EDTA-胰酶消化，分別對(duì)MDCK、H印-2、Vero細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后混合，制成細(xì)胞數(shù)為1. 5X105/ml的細(xì)胞懸液，加入3ml培養(yǎng)小瓶制成混合細(xì)胞培養(yǎng)瓶，其中每株細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)分別為5X 104/ml。本發(fā)明的混合細(xì)胞培養(yǎng)瓶可用于分離培養(yǎng)多種病毒，包括甲型、乙型流感病毒；腺病毒；腸道病毒EV71，分離培養(yǎng)達(dá)到較好的效果。本發(fā)明通過(guò)三種細(xì)胞制成混合細(xì)胞瓶分離培養(yǎng)鑒定多種病毒病原，既提高了病毒診斷的特異性和敏感性，又能比較快速的出結(jié)果。本發(fā)明方法選用的培養(yǎng)基為細(xì)胞培養(yǎng)常用培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件在可控的溫度和CO2 濃度下，對(duì)甲、乙型流感病毒、腺病毒，EV71病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)，分離培養(yǎng)結(jié)果滿意。具體而言，本發(fā)明的MHV混合細(xì)胞分離培養(yǎng)多種病毒的培養(yǎng)方法，其特征在于，其包括步驟1)選擇培養(yǎng)試劑細(xì)胞生長(zhǎng)液為MEM母液加小牛血清(終濃度為10% )，加慶大霉素(終濃度Mug/ ml) ,7.5% NaHCO3調(diào)pH至7. 0 7. 2 ；病毒運(yùn)輸液為MEM母液加牛血清白蛋白(終濃度5ug/ ml)加青、鏈霉素(終濃度100ug/ml)加兩性霉素(終濃度0. 5ug)；病毒接種液為MEM母液加牛血清白蛋白(終濃度5ug/ml)加青、鏈霉素(終濃度50ug/ml)TPCK-胰酶(終濃度為 2ug/ml)ο2)制備培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存的5 15代MDCK細(xì)胞、HEP-2細(xì)胞、Vero細(xì)胞，分別在T75細(xì)胞瓶中長(zhǎng)成單層細(xì)胞。本發(fā)明所采用的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均可通過(guò)市購(gòu)的方式獲得，并按常規(guī)方法實(shí)驗(yàn)室保存。所述T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶采用的是Corning公司產(chǎn)品，編號(hào)4307203)制備MHV混合細(xì)胞瓶采用MDCK、H印-2、Vero細(xì)胞制備混合細(xì)胞培養(yǎng)瓶來(lái)分離培養(yǎng)呼吸道病毒中的甲型、乙型流感病毒、腺病毒；腸道病毒中的EV71病毒；其中，MDCK、H印_2、Vero三株細(xì)胞分別在T75細(xì)胞瓶中長(zhǎng)成單層細(xì)胞后經(jīng)EDTA-胰酶消化，分別對(duì)MDCK、H印-2、Vero細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后混合，制成細(xì)胞數(shù)為1. 5X105/ml的細(xì)胞懸液，其中每株細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)分別為5X104/ml，將上述混合細(xì)胞懸液分裝培養(yǎng)瓶中，3ml/ 瓶，置37°C、5% CO2溫箱中長(zhǎng)成80%左右的細(xì)胞單層。本發(fā)明中，優(yōu)選EDTA-胰酶為0. 25 % EDTA-胰酶；本發(fā)明中，優(yōu)選細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)采用白細(xì)胞計(jì)數(shù)板。4)標(biāo)本接種鼻咽拭標(biāo)本處理鼻咽標(biāo)本4°C、2000r/min離心5min去除沉淀，0. 22微米孔徑濾膜過(guò)濾除菌或以青/鏈霉素、兩性霉素處理4小時(shí)后接種混合細(xì)胞瓶，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。上述標(biāo)本采用模擬臨床標(biāo)本，具體制備如下述(1)采樣管制備，取3. 6ml病毒運(yùn)輸液加入IOml滅菌試管內(nèi)；(2)取實(shí)驗(yàn)室_86°C保藏的甲型、乙型流感病毒液、腺病毒液、EV71病毒液各10株， 每株病毒液吸取0.細(xì)1加入上述采樣管內(nèi)(1 10稀釋)；(3)每次隨機(jī)選取10名志愿者，滅菌棉拭子在志愿者咽后壁和扁桃腺兩側(cè)輕輕擦拭，置入采樣管內(nèi)，做成模擬臨床咽拭標(biāo)本。糞便標(biāo)本處理糞便標(biāo)本以1 5比例懸浮于pH7. 2PBS液，2000r/min離心5min 去除糞便渣，0. 22微米孔徑濾膜過(guò)濾除菌再以青/鏈霉素、兩性霉素處理4小時(shí)后接種混合細(xì)胞瓶，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。5)培養(yǎng)物鑒定接種標(biāo)本Mh以后，在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞致細(xì)胞病變效應(yīng)、熒光顯微鏡下觀察特異蛋白單克隆免疫熒光染色、RT-PCR、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定。本發(fā)明中，采用尼康TS100倒置顯微鏡；Olympus BX 51熒光顯微鏡；本發(fā)明中，采用甲型、乙型流感病毒單克隆免疫熒光抗體IMAGEN influenza virus Aand B (DAKO)；腺病毒單克隆免疫熒光抗體 D3 ultra DFA Respiratory virus ID kit (DIAGNOSTIC HYBRIDS)；泛腸道病毒混合免疫熒光抗體LIGHT DIAGNOSTICS Pan-Enterovirus Reagent, MIILIPORE(chemicon)。5.1)致細(xì)胞病變效應(yīng)本發(fā)明采用的是三種細(xì)胞混合培養(yǎng)瓶，因此，如果培養(yǎng)物中存有對(duì)某一種細(xì)胞敏感的病毒，在倒置顯微鏡下可以觀察到該種細(xì)胞的病變效應(yīng)，提供如下信息(1)培養(yǎng)物可能有致細(xì)胞病變的病毒或毒素，( 可能是呼吸道的流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒或腸道病毒EV71。5.2)特異病毒蛋白檢測(cè)依據(jù)某一種細(xì)胞的致細(xì)胞病變效應(yīng)，推測(cè)可能的感染病毒，采用單克隆免疫熒光鑒定該病毒屬或病毒型。5. 3)特異病毒核酸檢測(cè)采用RT-PCR或PCR鑒定病毒亞型。5. 4)隨機(jī)引物擴(kuò)增培養(yǎng)物存有對(duì)混合細(xì)胞產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)，特異病毒和特異病毒核酸不能檢測(cè)的陽(yáng)性培養(yǎng)物，可采用隨機(jī)引物擴(kuò)增方法，測(cè)序拼接后比對(duì)鑒定。本發(fā)明中，甲1型流感病毒RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為431BP ；乙型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物為 390bp ；腺病毒擴(kuò)增產(chǎn)物為874bp。本發(fā)明方法采用上所述的三種細(xì)胞混合培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)10株甲型流感病毒、10株乙型流感病毒、10株腺病毒、10株EV71病毒，培養(yǎng)物經(jīng)培養(yǎng)4 后，結(jié)果顯示，均能觀察到致細(xì)胞病變效應(yīng)、10株甲型流感病毒、10株乙型流感病毒、10株腺病毒、10株EV71病毒單克隆免疫熒光熒光染色均為陽(yáng)性；培養(yǎng)物均能檢測(cè)到特異病毒核酸條帶。本發(fā)明方法通過(guò)三種細(xì)胞制成混合細(xì)胞瓶分離培養(yǎng)鑒定多種病毒病原，較現(xiàn)有技術(shù)分離培養(yǎng)效果好，克服傳統(tǒng)分離培養(yǎng)病毒主要是用一種細(xì)胞系，通過(guò)推測(cè)可能感染的病毒來(lái)選取敏感細(xì)胞系的缺陷，既提高了病毒診斷的特異性和敏感性，又能比較快速的出結(jié)^ ο


圖1，對(duì)照MHV混合細(xì)胞瓶(Mh)。圖2，乙型流感病毒污染模擬咽拭標(biāo)本MHV混合細(xì)胞瓶(Mh)。圖3，照片3.對(duì)照組MHV混合細(xì)胞瓶(Mh)。圖4，甲1型流感病毒污染模擬咽拭標(biāo)本MHV混合細(xì)胞瓶(Mh)。圖5，對(duì)照組MHV混合細(xì)胞瓶(48h)。圖6，腺病毒污染模擬咽拭標(biāo)本MHV混合細(xì)胞瓶(48h)。圖7，對(duì)照組MHV混合細(xì)胞瓶(48h)。圖8，EV71病毒污染模擬咽拭標(biāo)本MHV混合細(xì)胞瓶(48h)。圖9，對(duì)照組MHV-抗流感病毒McAbMOO。圖10，乙型流感病毒污染模擬咽拭標(biāo)本MHV-抗流感病毒McAbMOO。圖11，甲1型感病毒污染模擬咽拭標(biāo)本MHV-抗流感病毒McAbMOO。圖12，對(duì)照組MHV-抗腺病毒McAM200。圖13，腺病毒污染模擬咽拭標(biāo)本MHV-抗腺病毒McAM200。圖14，腺病毒污染模擬咽拭標(biāo)本MHV-抗腺病毒McAb*400。圖15，對(duì)照組MHV-抗腸道病毒McAM200。圖16，EV71病毒污染模擬咽拭標(biāo)本MHV-抗腸道病毒McAbMOO。圖17，其中1、2為390bpB型流感；3對(duì)照；4、5為210bp甲3流感；6為431bp甲1 流感；7、8、9 對(duì)照；10、11、12、13、14、15 為 341bpEV71 ；M 是 IOObp 距離條帶。圖18，其中1、3、4、5孔道為874腺病毒；M是200bp距離條帶。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11)取T75細(xì)胞瓶長(zhǎng)成單層的MDCK細(xì)胞(7代 12代)、HEP_2細(xì)胞和Vero細(xì)胞， 先用PH7. OPBS工作液洗一次，加0. 25% EDTA-胰蛋白酶消化，吸去EDTA-胰蛋白酶，加入 10毫升10%小牛血清的MEM生長(zhǎng)液，用彎嘴滴管打勻細(xì)胞，取上述細(xì)胞液90ul加入200ul 小塑料管，然后加苔盼藍(lán)IOul染色，取IOul上述染色細(xì)胞滴入白細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每一種細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)(染成藍(lán)色的為死細(xì)胞)控制為1.5X105/ml。2)將細(xì)胞數(shù)均計(jì)數(shù)為1. 5XlOVml MDCK, HEP-2和Vero細(xì)胞等體積混勻，此時(shí)， 每一種細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)為5X104/ml，吸取Iml混合細(xì)胞液加入至5ml量的玻璃培養(yǎng)小瓶，置 37V,5% CO2溫箱培養(yǎng)12 18小時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)成80%左右的單層。3)取實(shí)驗(yàn)室-86°C保藏的甲型流感病毒10株，乙型流感病毒10株，吸取每株流感病毒液0. 4ml加入至IOml滅菌試管內(nèi)，加入3. 6ml病毒運(yùn)輸液(1 10稀釋)，隨機(jī)選取 10名志愿者咽拭子分別置入上述含有流感病毒IOml滅菌試管內(nèi)，模擬臨床咽拭子標(biāo)本。咽拭標(biāo)本2000r/min離心5min去除沉淀，上清液加入青/鏈霉素(終濃度100ug/ml)、兩性霉素(0. 5ug/ml)處理4小時(shí)后，每份標(biāo)本取0. 2ml分別接種于混合細(xì)胞瓶中。另取0. 2ml 病毒運(yùn)輸液接種于混合細(xì)胞瓶中作為陰性對(duì)照。每份病毒樣品和陰性對(duì)照平行做5管。置 37V,5% CO2溫箱中孵育1小時(shí)，讓病毒吸附到細(xì)胞上，棄上清液，加入病毒培養(yǎng)液1ml，置 37V,5% CO2溫箱中培養(yǎng)。M小時(shí)后開(kāi)始觀察混和細(xì)胞瓶中陰性對(duì)照組和病毒接種組細(xì)胞形態(tài)，觀察CPE產(chǎn)生。4)接種標(biāo)本組混合細(xì)胞瓶CPE++ +++后，吸取出對(duì)照組和標(biāo)本組細(xì)胞懸液，并同時(shí)刮下對(duì)照組、標(biāo)本組細(xì)胞滴于12孔玻片上每份樣品做2孔。自然干燥，冷丙酮-甲醇固定，pH7. OPBS鹽溶液清洗3次后，每孔加入甲、乙型流感病毒單克隆抗體10ul，37°C濕盒孵育30min，PBS鹽溶液清洗3次，晾干，滴加熒光鏡油，在熒光顯微鏡下觀察熒光顆粒。5)標(biāo)本組和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用invitrogen公司TRIzol LS Reagent試劑抽提病毒核酸。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)流感病毒型與亞型，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)特異條帶。結(jié)果顯示，MDCK.Hep-2.Vero混合細(xì)胞瓶分離培養(yǎng)模擬甲型流感病毒咽拭標(biāo)本10 份(分別采用實(shí)驗(yàn)室保存各10株甲1型流感病毒)和模擬乙型流感病毒咽拭標(biāo)本10份 (分別采用實(shí)驗(yàn)室保存各10株乙型流感病毒)，分離培養(yǎng)結(jié)果滿意。倒置顯微鏡下可以觀察到甲、乙型流感病毒引起混合細(xì)胞瓶的MDCK細(xì)胞病變效應(yīng)，見(jiàn)照片(如圖1、2、3、4所示)； 在熒光顯微鏡下觀察到流感病毒特異熒光顆粒(見(jiàn)照片如圖9、10、11所示)；RT-PCR可以檢測(cè)到431bp的甲1型流感病毒特異產(chǎn)物條帶和390bp的乙型流感病毒特異產(chǎn)物條帶(如圖17所示)實(shí)施例21)取T75細(xì)胞瓶長(zhǎng)成單層的MDCK細(xì)胞(7代 12代)、HEP_2細(xì)胞和Vero細(xì)胞， 先用PH7. OPBS工作液洗一次，加0. 25% EDTA-胰蛋白酶消化，吸去EDTA-胰蛋白酶，加入10毫升10%小牛血清的MEM生長(zhǎng)液，用彎嘴滴管打勻細(xì)胞，取上述細(xì)胞液90ul加入200ul 小塑料管，然后加苔盼藍(lán)IOul染色，取IOul上述染色細(xì)胞滴入白細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每一種細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)(染成藍(lán)色的為死細(xì)胞)控制為1.5X105/ml。2)把細(xì)胞數(shù)均計(jì)數(shù)為1. 5XlOVml MDCK, HEP-2和Vero細(xì)胞等體積混勻，此時(shí)， 每一種細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)為5X104/ml，吸取Iml混合細(xì)胞液加入至5ml量的玻璃培養(yǎng)小瓶，置 37°C,5% CO2溫箱培養(yǎng)12 18小時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)成80%左右的單層。3)取實(shí)驗(yàn)室_86°C保臧的腺病毒10株，吸取每株流感病毒液0. 4ml加入IOml滅菌試管，加入3.6ml病毒運(yùn)輸液(1 10稀釋)，隨機(jī)選取10名志愿者咽拭子分別置入上述含有腺病毒IOml滅菌試管內(nèi)，模擬臨床咽拭子標(biāo)本。咽拭標(biāo)本2000r/min離心5min去除沉淀，上清液加入青/鏈霉素(終濃度lOOug/ml)、兩性霉素(0. 5ug/ml)處理4小時(shí)后，每份標(biāo)本取0. 2ml分別接種于混合細(xì)胞瓶中。另取0. 2ml病毒運(yùn)輸液接種于混合細(xì)胞瓶中作為陰性對(duì)照。每份病毒樣品和陰性對(duì)照平行做5管。置37°C，5%C02溫箱中孵育1小時(shí)， 讓病毒吸附到細(xì)胞上，棄上清液，加入病毒培養(yǎng)液lml，置37°C，5% CO2溫箱中培養(yǎng)。對(duì)小時(shí)后開(kāi)始觀察混和細(xì)胞瓶中陰性對(duì)照組和病毒接種組細(xì)胞形態(tài)，觀察CPE產(chǎn)生。4)接種標(biāo)本組混合細(xì)胞瓶CPE++ +++后，吸取出對(duì)照組和標(biāo)本組細(xì)胞懸液，并同時(shí)刮下對(duì)照組、標(biāo)本組細(xì)胞滴于12孔玻片上每份樣品做2孔。自然干燥，冷丙酮-甲醇固定，pH7. OPBS鹽溶液清洗3次后，每孔加入腺病毒單克隆抗體10ul，37°C濕盒孵育30min， PBS鹽溶液清洗3次，晾干，滴加熒光鏡油，在熒光顯微鏡下觀察熒光顆粒。5)標(biāo)本組和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用invitrogen公司TRIzol LS Reagent試劑抽提病毒核酸。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)腺病毒，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)特異條帶。結(jié)果顯示，MDCK、!fep-2、Ver0混合細(xì)胞瓶分離培養(yǎng)模擬腺病毒咽拭標(biāo)本10份(采用實(shí)驗(yàn)室保存各10株腺病毒)分離培養(yǎng)結(jié)果滿意。倒置顯微鏡下可以觀察到腺病毒病毒引起混合細(xì)胞瓶的Hep-2細(xì)胞病變效應(yīng)(如圖5、6所示)；在熒光顯微鏡下觀察到腺病毒特異熒光顆粒(如圖12、13、14所示見(jiàn)照片)；PCR可以檢測(cè)到874bp的腺病毒特異產(chǎn)物條帶(如圖18所示)。實(shí)施例31)取T75細(xì)胞瓶長(zhǎng)成單層的MDCK細(xì)胞(7 12代)、HEP_2細(xì)胞和Vero細(xì)胞，先用PH7. OPBS工作液洗一次，加0. 25% EDTA-胰蛋白酶消化，吸去EDTA-胰蛋白酶，加入10 毫升10%小牛血清的MEM生長(zhǎng)液，用彎嘴滴管打勻細(xì)胞，取上述細(xì)胞液90ul加入200ul小塑料管，然后加苔盼藍(lán)IOul染色，取IOul上述染色細(xì)胞滴入白細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每一種細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)(染成藍(lán)色的為死細(xì)胞)控制為1.5X105/ml。2)把細(xì)胞數(shù)均計(jì)數(shù)為1. 5XlOVml MDCK, HEP-2和Vero細(xì)胞等體積混勻，此時(shí)， 每一種細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)為5X104/ml，吸取Iml混合細(xì)胞液加入至5ml量的玻璃培養(yǎng)小瓶，置 37°C,5% CO2溫箱培養(yǎng)12 18小時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)成80%左右的單層。3)取實(shí)驗(yàn)室_86°C保藏的EV71病毒10株，吸取每株EV71病毒液0. 4ml加入IOml 滅菌試管，加入3.6ml病毒運(yùn)輸液(1 10稀釋)，隨機(jī)選取10名志愿者咽拭子分別置入上述含有EV71病毒IOml滅菌試管內(nèi)，模擬臨床咽拭子標(biāo)本。咽拭標(biāo)本2000r/min離心5min 去除沉淀，上清液加入青/鏈霉素(終濃度lOOug/ml)、兩性霉素(0. 5ug/ml)處理4小時(shí)后，每份標(biāo)本取0. 2ml分別接種于混合細(xì)胞瓶中。另取0. 2ml病毒運(yùn)輸液接種于混合細(xì)胞瓶中作為陰性對(duì)照。每份病毒樣品和陰性對(duì)照平行做5管。置37°C，5%C02溫箱中孵育1 小時(shí)，讓病毒吸附到細(xì)胞上，棄上清液，加入病毒培養(yǎng)液1ml，置37°C，5 % CO2溫箱中培養(yǎng)。 24小時(shí)后開(kāi)始觀察混和細(xì)胞瓶中陰性對(duì)照組和病毒接種組細(xì)胞形態(tài)，觀察CPE產(chǎn)生。4)接種標(biāo)本組混合細(xì)胞瓶CPE++ +++后，吸取出對(duì)照組和標(biāo)本組細(xì)胞懸液，并同時(shí)刮下對(duì)照組、標(biāo)本組細(xì)胞滴于12孔玻片上每份樣品做2孔。自然干燥，冷丙酮-甲醇固定，pH7. OPBS鹽溶液清洗3次后，每孔加入腸道病毒屬特異單克隆抗體10ul，37°C濕盒孵育 30min, PBS鹽溶液清洗3次，晾干，滴加熒光鏡油，在熒光顯微鏡下觀察熒光顆粒。5)標(biāo)本組和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用invitrogen公司TRIzol LS Reagent試劑抽提病毒核酸。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)腸道病毒EV71病毒，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)特異條帶。結(jié)果顯示，MDCK, H印-2、Vero混合細(xì)胞瓶分離培養(yǎng)模擬EV71病毒咽拭標(biāo)本10份 (為實(shí)驗(yàn)室保存各10株EV71病毒)分離培養(yǎng)結(jié)果滿意。倒置顯微鏡下可以觀察到EV71病毒引起混合細(xì)胞瓶Vero細(xì)胞病變效應(yīng)(如圖7、8所示)；在熒光顯微鏡下觀察到EV71病毒特異熒光顆粒(如圖15、16) ；RT-PCR可以檢測(cè)到341的EV71病毒特異產(chǎn)物條帶(如圖 17所示)。
權(quán)利要求
1.一種MHV混合細(xì)胞分離培養(yǎng)多種病毒的培養(yǎng)方法，其特征在于，其包括步驟1)選擇培養(yǎng)試劑細(xì)胞生長(zhǎng)液為MEM母液加小牛血清，終濃度為10%，加慶大霉素，終濃度Mug/ml， 7. 5% NaHCO3 調(diào) pH 至 7. 0 7. 2 ；病毒運(yùn)輸液為MEM母液加牛血清白蛋白，終濃度5ug/ml，加青、鏈霉素終濃度IOOug/ ml，加兩性霉素終濃度0. 5ug；病毒接種液為MEM母液加牛血清白蛋白終濃度5ug/ml，加青、鏈霉素終濃度50ug/ml， TPCK-胰酶終濃度為2ug/ml ；2)制備培養(yǎng)細(xì)胞5 15代MDCK細(xì)胞、HEP-2細(xì)胞和Vero細(xì)胞，分別在T75細(xì)胞瓶中長(zhǎng)成單層細(xì)胞；3)制備MHV混合細(xì)胞瓶采用MDCK、H印-2、Vero細(xì)胞制備混合細(xì)胞培養(yǎng)瓶，分離培養(yǎng)呼吸道病毒中的甲型、乙型流感病毒、腺病毒；腸道病毒中的EV71病毒；4)標(biāo)本接種鼻咽拭標(biāo)本處理鼻咽標(biāo)本4°C、2000r/min離心5min去除沉淀，0. 22微米孔徑濾膜過(guò)濾除菌或以青/鏈霉素、兩性霉素處理4小時(shí)后接種混合細(xì)胞瓶，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照；糞便標(biāo)本處理糞便標(biāo)本以1 5比例懸浮于pH7. 2PBS液，2000r/min離心5min去除糞便渣，0. 22微米孔徑濾膜過(guò)濾除菌再以青/鏈霉素、兩性霉素處理4小時(shí)后接種混合細(xì)胞瓶，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照；5)培養(yǎng)物鑒定接種標(biāo)本Mh以后，在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞致細(xì)胞病變效應(yīng)、熒光顯微鏡下觀察特異蛋白單克隆免疫熒光染色、RT-PCR、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，MDCK、!fep-2、Vero三株細(xì)胞分別在T75細(xì)胞瓶中長(zhǎng)成單層細(xì)胞后經(jīng)EDTA-胰酶消化，分別對(duì)MDCK、H印-2、Vero細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后混合，制成細(xì)胞數(shù)為1.5X105/ml的細(xì)胞懸液，其中每株細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)分別為5X IO4/ ml，將上述混合細(xì)胞懸液分裝培養(yǎng)瓶中，:3ml/瓶，置37°C、5 % CO2溫箱中長(zhǎng)成80 %左右的細(xì)胞單層。
3.按權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的EDTA-胰酶為0.25% EDTA-胰酶。
4.按權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)采用白細(xì)胞計(jì)數(shù)板。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中，鼻咽拭標(biāo)本采用模擬臨床標(biāo)本， 具體制備如下述(1)采樣管制備，取3.6ml病毒運(yùn)輸液加入IOml滅菌試管內(nèi)；(2)取_86°C保藏的甲型、乙型流感病毒液、腺病毒液、EV71病毒液各數(shù)株，每株病毒液吸取0.細(xì)1加入上述采樣管內(nèi)1 10稀釋；(3)每次隨機(jī)選取志愿者，滅菌棉拭子在志愿者咽后壁和扁桃腺兩側(cè)輕輕擦拭，置入采樣管內(nèi)，做成模擬臨床咽拭標(biāo)本。
6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中，采用甲型、乙型流感病毒單克隆免疫熒光抗體IMAGEN influenza virus A and B (DAKO)；腺病毒單克隆免疫熒光抗體D3 ultra DFA Respiratory virus ID kit (DIAGNOSTIC HYBRIDS)；泛腸道病毒混合免疫熒光抗體 LIGHT DIAGNOSTICS Pan-Enterovirus Reagent, MIILIPORE (chemicon)。
7.按權(quán)利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述的甲1型流感病毒RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為43IBP ；乙型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物為390bp ；腺病毒擴(kuò)增產(chǎn)物為874bp。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種MHV混合細(xì)胞分離培養(yǎng)多種病毒的培養(yǎng)方法，其通過(guò)T75細(xì)胞瓶制備MDCK、HEP-2、Vero單層細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶消化，分別對(duì)所述細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后混合，制成細(xì)胞數(shù)為1.5×105/ml的細(xì)胞懸液，加入培養(yǎng)小瓶制成混合細(xì)胞培養(yǎng)瓶。本發(fā)明的混合細(xì)胞培養(yǎng)瓶可用于分離培養(yǎng)多種病毒，如甲型、乙型流感病毒；腺病毒；腸道病毒EV71。本發(fā)明方法通過(guò)三種細(xì)胞制成混合細(xì)胞瓶分離培養(yǎng)鑒定多種病毒病原，較現(xiàn)有技術(shù)分離培養(yǎng)效果好，克服傳統(tǒng)分離培養(yǎng)病毒主要是用一種細(xì)胞系，通過(guò)推測(cè)可能感染的病毒來(lái)選取敏感細(xì)胞系的缺陷，既提高了病毒診斷的特異性和敏感性，又能比較快速的出結(jié)果。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102337249SQ201010236929
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者姜慶五, 姜晨彥, 居麗雯, 蔣露芳, 高穎陽(yáng) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)