專利名稱：用于體外大量擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種體外大量快速擴(kuò)增貼壁生長的細(xì)胞培 養(yǎng)方法，特別是利用微球作為細(xì)胞培養(yǎng)的載體，旋轉(zhuǎn)瓶作為發(fā)酵罐，體外大量擴(kuò)增毛囊干細(xì) 胞的生物反應(yīng)器技術(shù)。
背景技術(shù)：
疾病對人類的健康和生存構(gòu)成重大威脅、是世界各國普遍面臨的最重要的社會問 題。干細(xì)胞移植技術(shù)的問世和進(jìn)展，為傳統(tǒng)治療手段認(rèn)為是“不治之癥”的患者帶來了新的 生機(jī)和希望。但干細(xì)胞的來源、移植治療的安全性和有效性一直是干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)研究中 需要解決的重大科學(xué)問題。毛囊是皮膚的附屬器之一，起源于表皮和間充質(zhì)間的相互作用。毛囊中除了含有 表皮干細(xì)胞、黑色素干細(xì)胞外，還含有間充質(zhì)樣干細(xì)胞。這種毛囊間充質(zhì)樣干細(xì)胞不僅能夠 自我更新，還能夠分化成骨、軟骨、脂肪和血管平滑肌等多種組織特異性細(xì)胞。毛囊干細(xì)胞 的自我更新和多向分化，為包括毛囊在內(nèi)的多種組織器官的再生醫(yī)學(xué)奠定了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。 毛囊來源豐富、獲取方便，而且收獲毛囊基本不會對機(jī)體產(chǎn)生任何損害作用。因此毛囊干細(xì) 胞是目前已知的成體干細(xì)胞中最具有臨床應(yīng)用潛能的種子細(xì)胞。但收獲毛囊，分離干細(xì)胞， 開展再生醫(yī)學(xué)研究，需要大量的、未分化的種子細(xì)胞。傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)上，大量收獲諸如毛囊 干細(xì)胞等貼壁生長的細(xì)胞，通常是通過反復(fù)傳代而實(shí)現(xiàn)的。然而細(xì)胞經(jīng)過反復(fù)傳代后，不僅 增值能力迅速下降，而且還失去向多種組織特異性細(xì)胞分化的潛能，甚至移植后有可能誘 發(fā)腫瘤的形成。已知貼壁生長細(xì)胞的收獲量和培養(yǎng)面積成正比，即培養(yǎng)面積越大，收獲的 細(xì)胞量就越多。微載體含有很高的面積/體積比。1克直徑為100-300微米的微載體，如 Cultisphere-G所擁有的表面積大約是1平方米。這樣利用微載體作為細(xì)胞培養(yǎng)的基床，在 少量的培養(yǎng)基中，就能夠生產(chǎn)出大量的、貼壁生長的細(xì)胞，這樣既滿足開展干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué) 研究所必須的細(xì)胞的數(shù)量，也避免因反復(fù)傳代而可能導(dǎo)致的細(xì)胞增值能力、多向分化潛能 的下降以及移植后誘發(fā)腫瘤形成的風(fēng)險，還降低了生產(chǎn)成本。因此利用微載體作為細(xì)胞培 養(yǎng)的基床，來大量培養(yǎng)貼壁增長的細(xì)胞，已被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用中， 取得了令人滿意的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可作為種子細(xì)胞，用于開展細(xì)胞療法，治療和修復(fù)病 變組織器官的體外大量快速擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。本發(fā)明包括下列步驟1.器具、材料的準(zhǔn)備，包括①細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶垂直旋轉(zhuǎn)瓶和水平旋轉(zhuǎn)瓶，容量為IO-IOOOOml，轉(zhuǎn)速為1_500 轉(zhuǎn)/分；②微載體其材料由一種或多種可生物降解材料構(gòu)成，或由非生物降解材料構(gòu)成，或由可生物降解與非生物降解材料構(gòu)成；可生物降解材料為膠原蛋白、血液纖溶蛋白、明膠、透明質(zhì)酸、多聚乳酸、多聚乙醇 酸、聚亞胺脂、殼聚糖；所述的非生物降解材料為玻璃、硅膠、金屬、塑料；③細(xì)胞包括哺乳動物毛囊干細(xì)胞和人毛囊干細(xì)胞；④培養(yǎng)液包括DMEM、DMM-F12、EGM、KGM、IMDM、MEM、^Μ，其中添加一種或兩種以 上生物因子；生物因子為IGF、bFGF、EGF、VEGF、磷酸鹽維生素C、的塞米松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、 動物腦垂體提取物、青_鏈霉素、兩性霉素、含有或不含有人或動物血清；動物血清來自牛、羊、馬、豬或其它哺乳動物，可以是其中的一種，也可以是其中的 兩種或兩種以上。2.毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)，包括①將通過蛋白酶消化毛囊或毛囊組織塊培養(yǎng)法而獲得的人毛囊干細(xì)胞，以 IXIO3-IXIO9細(xì)胞/克微載體的密度，接種在微載體上，懸浮于培養(yǎng)液中；②將微載體連同種植在其上的細(xì)胞一起，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶中；③依據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶的容積，添加培養(yǎng)液至50-1000ml ；④將細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶的轉(zhuǎn)動模式設(shè)置 為轉(zhuǎn)動1-5分鐘/小時，轉(zhuǎn)速10-300轉(zhuǎn)/分鐘。培養(yǎng)箱的設(shè)置為37°C、5% CO2 ；⑤待細(xì)胞在微載體上貼附生長接近單層時，利用0. 25胰蛋白酶-0. 02% EDTAjf 細(xì)胞從微載體上消化下來，經(jīng)血清滅活胰蛋白酶，磷酸鹽緩沖液沖洗掉其中的血清和抗生 素后，待用。本發(fā)明建立一種以微球作為細(xì)胞培養(yǎng)的載體、旋轉(zhuǎn)瓶作為細(xì)胞增殖的發(fā)酵罐，體 外大量擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞的方法，該方法操作簡便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，避免反復(fù)傳代細(xì)胞而導(dǎo)致的細(xì) 胞增殖能力減弱、分化潛能降低等與傳統(tǒng)擴(kuò)增細(xì)胞方法相關(guān)的副作用，同時還節(jié)約培養(yǎng)液 的用量；利用該方法擴(kuò)增出來的毛囊干細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，且仍保持原來的分化潛能，可用 于(1)建立毛囊干細(xì)胞銀行，為成體干細(xì)胞相關(guān)研究提供優(yōu)質(zhì)的種子細(xì)胞；(2)移植修復(fù) 病變的組織器官；(3)構(gòu)建組織工程化器官，用作自體器官的替代物，用于移植修復(fù)病變或 缺失的器官；(4)作為基因治療的靶細(xì)胞，用于治療相應(yīng)的疾病。通過本發(fā)明獲得的毛囊干細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶消化后，從微載體上釋放下來，可作為種 子細(xì)胞，用于開展細(xì)胞療法，治療病變的組織器官，或用于構(gòu)建組織工程化器官，用以移植 治療病變或缺失的器官，也可以用作基因治療的靶細(xì)胞，用于移植治療代謝性或先天遺傳 性疾病。還可以將可生物降解微載體，連同在其上貼附生長的毛囊干細(xì)胞一起，直接移植到 病變的部位，用于治療相應(yīng)的組織器官的病變，或改善相應(yīng)病變器官的狀態(tài)，提高其功能， 從而達(dá)到修復(fù)組織器官的目的。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明包括下列步驟1.器具、材料的準(zhǔn)備，包括①細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶垂直旋轉(zhuǎn)瓶和水平旋轉(zhuǎn)瓶，容量為IO-IOOOOml，轉(zhuǎn)速為1_500 轉(zhuǎn)/分；
4
②微載體其材料由一種或多種可生物降解材料構(gòu)成，或由非生物降解材料構(gòu)成， 或由可生物降解與非生物降解材料構(gòu)成；可生物降解材料為膠原蛋白、血液纖溶蛋白、明膠、透明質(zhì)酸、多聚乳酸、多聚乙醇 酸、聚亞胺脂、殼聚糖；所述的非生物降解材料為玻璃、硅膠、金屬、塑料；③細(xì)胞包括哺乳動物毛囊干細(xì)胞和人毛囊干細(xì)胞；④培養(yǎng)液包括DMEM、DMM-Fl2, EGM、KGM、IMDM、MEM、EBM，其中添加一種或兩種以 上生物因子；生物因子為IGF、bFGF、EGF、VEGF、磷酸鹽維生素C、的塞米松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、 動物腦垂體提取物、青_鏈霉素、兩性霉素、含有或不含有人或動物血清；動物血清來自牛、羊、馬、豬或其它哺乳動物，可以是其中的一種，也可以是其中的 兩種或兩種以上。2.毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)，包括①將通過蛋白酶消化毛囊或毛囊組織塊培養(yǎng)法而獲得的人毛囊干細(xì)胞，以 IXIO3-IXIO9細(xì)胞/克微載體的密度，接種在微載體上，懸浮于培養(yǎng)液中；②將微載體連同種植在其上的細(xì)胞一起，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶中；③依據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶的容積，添加培養(yǎng)液至50_1000ml ；④將細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶的轉(zhuǎn)動模式設(shè)置 為轉(zhuǎn)動1-5分鐘/小時，轉(zhuǎn)速10-300轉(zhuǎn)/分鐘。培養(yǎng)箱的設(shè)置為37°C、5% CO2 ；⑤待細(xì)胞在微載體上貼附生長接近單層時，利用0. 25胰蛋白酶-0. 02% EDTAjf 細(xì)胞從微載體上消化下來，經(jīng)血清滅活胰蛋白酶，磷酸鹽緩沖液沖洗掉其中的血清和抗生 素后，待用。
權(quán)利要求
一種用于體外大量擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于包括下列步驟1)器具、材料的準(zhǔn)備，包括①細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶垂直旋轉(zhuǎn)瓶和水平旋轉(zhuǎn)瓶，容量為10 10000ml，轉(zhuǎn)速為1 500轉(zhuǎn)/分；②微載體其材料由一種或多種可生物降解材料構(gòu)成，或由非生物降解材料構(gòu)成，或由可生物降解與非生物降解材料構(gòu)成；③細(xì)胞包括哺乳動物毛囊干細(xì)胞和人毛囊干細(xì)胞；④培養(yǎng)液包括DMEM、DMM F12、EGM、KGM、IMDM、MEM、EBM，其中添加一種或兩種及以上生物因子；⑤細(xì)胞培養(yǎng)箱CO2孵箱。2)毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)，包括①將通過蛋白酶消化毛囊或毛囊組織塊培養(yǎng)法而獲得的人毛囊干細(xì)胞，以1X103 1X109細(xì)胞/克微載體的密度，接種在微載體上，懸浮于培養(yǎng)液中；②將微載體連同種植在其上的細(xì)胞一起，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶中；③依據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶的容積，添加培養(yǎng)液至50 1000ml；④將細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶的轉(zhuǎn)動模式設(shè)置為轉(zhuǎn)動1 5分鐘/小時，轉(zhuǎn)速10 300轉(zhuǎn)/分鐘。培養(yǎng)箱的設(shè)置為37℃、5％CO2；⑤待細(xì)胞在微載體上貼附生長接近單層時，利用0.25胰蛋白酶 0.02％EDTA，將細(xì)胞從微載體上消化下來，經(jīng)血清滅活胰蛋白酶，磷酸鹽緩沖液沖洗掉其中的血清和抗生素后，待用。
2.按權(quán)利要求1所述的用于體外大量擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟1) 中②所述的可生物降解材料為膠原蛋白、血液纖溶蛋白、明膠、透明質(zhì)酸、多聚乳酸、多聚乙 醇酸、聚亞胺脂、殼聚糖；所述的非生物降解材料為玻璃、硅膠、金屬、塑料。
3.按權(quán)利要求1所述的用于體外大量擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟1) 中④所述的生物因子為IGF、bFGF、EGF、VEGF、磷酸鹽維生素C、的塞米松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋 白、動物腦垂體提取物、青-鏈霉素、兩性霉素、含有或不含有人或動物血清。
4.按權(quán)利要求3所述的用于體外大量擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的 動物血清來自牛、羊、馬、豬或其它哺乳動物，可以是其中的一種，也可以是其中的兩種或兩 種以上。
全文摘要
用于體外大量擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)方法屬細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明建立一種以微球作為細(xì)胞培養(yǎng)的載體、旋轉(zhuǎn)瓶作為細(xì)胞增殖的發(fā)酵罐，體外大量擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞的方法，該方法操作簡便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，避免反復(fù)傳代細(xì)胞而導(dǎo)致的細(xì)胞增殖能力減弱、分化潛能降低等與傳統(tǒng)擴(kuò)增細(xì)胞方法相關(guān)的副作用，同時還節(jié)約培養(yǎng)液的用量；利用該方法擴(kuò)增出來的毛囊干細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，且仍保持原來的分化潛能，可用于(1)建立毛囊干細(xì)胞銀行，為成體干細(xì)胞相關(guān)研究提供優(yōu)質(zhì)的種子細(xì)胞；(2)移植修復(fù)病變的組織器官；(3)構(gòu)建組織工程化器官，用作自體器官的替代物，用于移植修復(fù)病變或缺失的器官；(4)作為基因治療的靶細(xì)胞，用于治療相應(yīng)的疾病。
文檔編號C12N5/0775GK101914495SQ201010238350
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者劉晉宇, 李玉林 申請人:吉林大學(xué)