專利名稱：一種外生菌根輔助細(xì)菌短小芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物肥料領(lǐng)域，尤其涉及一種外生菌根輔助細(xì)菌短小芽孢桿菌及其 在促進(jìn)黑松生長(zhǎng)和防治松苗猝倒病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物根際促生細(xì)菌(Plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)是對(duì)根 際微生物區(qū)系中能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害、增加作物產(chǎn)量的細(xì)菌的統(tǒng)稱。自從1978 年Burr等人首先在馬鈴薯上報(bào)導(dǎo)PGPR以來，國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)20多個(gè)種屬PGPR。其中，假
Ifi^M (Pseudomonas) ,Wl^PfMM (Bacillus)、H干胃M (Agrobacterium) > K 菌屬(Eriwinia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、巴其Jf 德氏菌屬(Pasteuria) > W IS lif (Serratia)、腸桿菌(Enterobacter)等的作用最為突出。植物根際促生細(xì)菌和外生菌根真 菌(Ectomycorrhizal Fungi, EMF)作為植物根圈微生物的重要組成類群，對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)吸 收、生長(zhǎng)發(fā)育及土壤結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要的作用。國(guó)內(nèi)外已有大量的研究表明，菌根真菌與PGPR 混合接種對(duì)宿主植物的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)吸收具有積極意義(Linderman，1996 JezaRll et al, 2004 ；王新榮等，1998)。菌根輔助細(xì)菌(MycorrhizalHelper Bacteria,MHB)作為一類的特殊的 PGPR，與 菌根真菌的作用關(guān)系十分密切，是菌根學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。MHB的概念是1994年由法國(guó)學(xué) 者Garbaye提出的，具體是指可與菌根聯(lián)結(jié)并對(duì)菌根的形成具有選擇性促進(jìn)作用的細(xì)菌。 大量研究表明，MHB與菌根真菌雙接種可顯著促進(jìn)菌根真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)、提高菌根 侵染率等，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)(Garbaye et al,1992 ；Duponnois et al，2003)。國(guó)外關(guān)于 MHB與菌根真菌互作關(guān)系的研究已有幾十年的歷史，篩選出了大量的MHB，并對(duì)某些優(yōu)良的 MHB開展了比較深入的研究，但到目前為止，在我國(guó)還未見有關(guān)MHB的篩選研究以及MHB與 菌根真菌互作的相關(guān)報(bào)道。黑松(Pinus thimbergii)是我國(guó)南方人工林中最主要的造林樹種之一，廣泛應(yīng)用 于荒山造林、沿海防護(hù)林帶的建設(shè)，且具有極強(qiáng)的觀賞價(jià)值。黑松是典型的外生菌根樹種， 主要生長(zhǎng)在沿海土壤瘠薄的立地上，其生長(zhǎng)對(duì)外生菌根真菌(EMF)的依賴性很強(qiáng)，菌根技 術(shù)的應(yīng)用可以提高其在土壤貧瘠地區(qū)的生產(chǎn)力；而菌根輔助細(xì)菌(MHB)能通過促進(jìn)菌根菌 生長(zhǎng)，從而達(dá)到更好的促進(jìn)林木生長(zhǎng)的目的。因此，研究MHB及其與菌根真菌互作對(duì)黑松的 促生效果具有重要的理論和實(shí)踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種促進(jìn)黑松生長(zhǎng)和外生菌根真菌生長(zhǎng)的短 小芽孢桿菌。本發(fā)明還要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供上述外生菌根輔助細(xì)菌短小芽孢桿菌的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
外生菌根輔助細(xì)菌短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) HR10，是一種從黑松 (Pinusthunbergii)和黃色須腹菌(Rhizopogen luteous,Rl)菌根共生體根際土壤中篩選 獲得的對(duì)黑松和黃色須腹菌(Rl)生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用的MHB菌株，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物 保藏中心CCTCC，保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2010143，保藏日期2010年6月12日。CCTCC NO :M 2010143菌株的菌學(xué)特性如下在TSA培養(yǎng)基平板，28°C培養(yǎng)24 36h菌落圓形、平鋪、米黃色、表面皺縮、較干、 邊緣放射狀，菌體細(xì)桿狀；革蘭氏染色為陽性、3% KOH試驗(yàn)陰性；芽孢中生。通過BIOLOG系 統(tǒng)對(duì)HRlO進(jìn)行鑒定，該菌株在鑒定板培養(yǎng)16 24h時(shí)的讀數(shù)相似值(SIM值)為0. 555，大 于0. 50，符合BIOLOG系統(tǒng)關(guān)于理想結(jié)果的要求，與數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果的相似性(PROB)都為 99%。利用該系統(tǒng)鑒定到了種，為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。測(cè)得16SrDNA大部分序列1409bp，具體如SEQ ID No 1所示。16SrDNA序列通過 BLAST比對(duì)，在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。與HRlO菌株相似性最高的 是短小芽孢桿菌，同源性達(dá)到100%。從進(jìn)化樹可以看出，HRlO與短小芽孢桿菌的親緣關(guān)系 較近，這與BIOLOG鑒定及BLAST的比對(duì)結(jié)果相符。CCTCC NO =M 2010143菌株對(duì)黑松具有促生長(zhǎng)的作用。CCTCC NO =M 2010143菌株對(duì)松樹苗木猝倒病病原絲核菌(Rhizoctonia sp.)具 有抑菌作用；溫室防治試驗(yàn)表明，該菌株能有效防治松苗猝倒病。并且上述CCTCC NO =M 2010143菌株對(duì)黃色須腹菌具有促生作用，且其與黃色須 腹菌互作對(duì)黑松的具有明顯的促生長(zhǎng)作用，各接種處理間均表現(xiàn)出正交互作用。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢(shì)(1)外生菌根輔助細(xì)菌短小芽孢桿菌HRlO為植物根際促生細(xì)菌，對(duì)黑樹的生長(zhǎng)具 有直接地促進(jìn)作用；并且還能夠促進(jìn)外生菌根真菌黃色須腹菌的生長(zhǎng)，與黃色須腹菌雙接 種對(duì)黑松的也具有明顯的促進(jìn)作用。(2)外生菌根輔助細(xì)菌短小芽孢桿菌HRlO對(duì)松樹苗木猝倒病病原絲核菌具抑制 作用；溫室防治試驗(yàn)表明，短小芽孢桿菌HRlO菌株能有效防治松樹苗木猝倒病。


短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)HR10，已保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保 藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)；地址武漢武漢大學(xué)；郵編430072 ；保藏號(hào)M 2010143 ；保藏日期 2010年6月12日。圖1短小芽孢桿菌HRlO菌體對(duì)黃色須腹菌(Rl)菌絲生長(zhǎng)的影響(X 17)；圖2短小芽孢桿菌HRlO菌株胞外代謝產(chǎn)物對(duì)黃色須腹菌(Rl)菌絲生長(zhǎng)的影響；圖3短小芽孢桿菌HRlO單獨(dú)接種及與黃色須腹菌(Rl)雙接種對(duì)黑松的促生作 用；圖4短小芽孢桿菌HRlO與苗木猝倒病病原絲核菌對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1 短小芽孢桿菌HRlO對(duì)黃色須腹菌(Rl)的促生作用將待測(cè)細(xì)菌活化后，用接種環(huán)取少量接種于裝有50mL TSA液體培養(yǎng)基的IOOmL三 角瓶中，280C，160r/min振蕩培養(yǎng)72h。將菌懸液倒入滅菌的離心管中，4°C，5000r/min離心 5min，倒去上清液，再用生理鹽水潤(rùn)洗菌體兩次，最后根據(jù)離心管內(nèi)菌體的數(shù)量適量加入生 理鹽水，混勻后即為HRlO菌株的菌體懸濁液(約含5X108cfu/mL)。同時(shí)，用無菌注射器吸 取上清液，細(xì)菌過濾器(濾膜孔徑為0. 22 μ m，直徑為0. 25mm)過濾后即為HRlO菌株的無菌 濾液。(1)短小芽孢桿菌HRlO菌體懸液對(duì)黃色須腹菌(Rl)的促生測(cè)定采用干皿對(duì)抗法進(jìn)行試驗(yàn)。將Rl菌根真菌培養(yǎng)于ZPD培養(yǎng)基，在其生長(zhǎng)最旺盛期 間，用直徑為7mm的打孔器在培養(yǎng)皿邊緣打孔，取厚度(約5mm)基本一致的菌塊作為材料。 將菌根真菌菌塊倒置放入滅菌的空培養(yǎng)皿中，每皿接種三塊，三角狀放置，再用無菌移液器 吸取25 μ L HRlO菌株菌體懸濁液，滴加于各個(gè)真菌菌塊上，每個(gè)細(xì)菌菌株設(shè)六個(gè)重復(fù)，以滴 加生理鹽水的作為對(duì)照，置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔6天添加25 μ IlOmM的葡萄糖溶液， 以防止菌塊干燥。待菌塊生長(zhǎng)12 16d后，借助于裝有測(cè)微尺的體式顯微鏡觀測(cè)各個(gè)菌塊 的菌絲生長(zhǎng)情況(表1 ；圖1)，計(jì)算HRlO菌株對(duì)菌根菌絲的平均促生長(zhǎng)量。試驗(yàn)結(jié)果表明， HRlO菌株對(duì)Rl菌絲的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，與對(duì)照相比增長(zhǎng)了 13. 1%。表1短小芽孢桿菌HRlO菌株菌體對(duì)黃色須腹菌(Rl)菌絲生長(zhǎng)的影響
^iit __菌絲長(zhǎng)度
菌株 -
平均值/cm增長(zhǎng)率/%-
HRlO1.55±0.102a13.1
CK1.37+0.134a-注不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同。(2)短小芽孢桿菌HRlO胞外代謝產(chǎn)物對(duì)黃色須腹菌(Rl)菌落生長(zhǎng)的影響將ImL無菌濾液與45°C，20mL ZPD固體培養(yǎng)基混合倒平板，以無菌水處理作為對(duì) 照。將菌根真菌菌塊接種于培養(yǎng)皿中央，每處理三個(gè)重復(fù)，置于25°C恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)12 15d后觀測(cè)其菌落半徑(圖2)。試驗(yàn)結(jié)果表明，HRlO菌株的胞外代謝產(chǎn)物對(duì)Rl菌落的生 長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。HRlO在1000 μ L用量時(shí)，Rl菌落直徑比對(duì)照增長(zhǎng)了 20. 2% (表2)。
表2短小芽孢桿菌HRlO菌株胞外代謝產(chǎn)物對(duì)黃色須腹菌(Rl)菌落生長(zhǎng)的影響
^it __菌落直徑
菌株 -
大小/cm增長(zhǎng)率/%
HRlO 2.91 ±0.156 20.2 _CK_2.42 + 0.236__(3)短小芽孢桿菌HRlO菌株胞外代謝產(chǎn)物對(duì)黃色須腹菌(Rl)生物量的影響。通過將HRlO菌株胞外代謝產(chǎn)物與黃色須腹菌(Rl)共培養(yǎng)，稱量菌絲干重的方法 來研究胞外代謝產(chǎn)物對(duì)菌根菌絲生長(zhǎng)量的影響。具體方法如下將菌根真菌培養(yǎng)一段時(shí)間 后，用滅菌的打孔器打下菌餅(d = 7mm, <2 = 5mm)，每50mLZPD液體培養(yǎng)基中加入菌餅3
5塊，同時(shí)加入ImLHRlO菌株胞外代謝產(chǎn)物，25°C，160r/min共同振蕩培養(yǎng)12 15d，定性濾 紙過濾，再置于60°C烘箱中烘至恒重，然后用電子天平進(jìn)行稱量。以TSA培養(yǎng)液為對(duì)照，每 處理各3次重復(fù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，HRlO菌株的代謝產(chǎn)物能促進(jìn)Rl菌絲的生長(zhǎng)量，與對(duì)照相 比，菌絲生物量增長(zhǎng)了 30.5%。表3短小芽孢桿菌HRlO菌株胞外代謝產(chǎn)物對(duì)Rl菌絲生物量的影響 實(shí)施例2 短小芽孢桿菌HRlO與黃色須腹菌(Rl)互作對(duì)黑松的促生作用。芽苗的培育黑松種子經(jīng)60°C溫水浸泡24h用以催芽，以0. 5%高錳酸鉀溶液浸 泡，2h進(jìn)行表面消毒，再用自來水沖洗Ih后，播種于滅菌沙子中，置于25°C溫室中培養(yǎng)，待 其長(zhǎng)到子葉期時(shí)進(jìn)行芽苗截根移苗。盆栽基質(zhì)基質(zhì)土壤采自南京林業(yè)大學(xué)校園后山，土樣過篩后經(jīng)1.01X 106pa滅 菌，90min，冷卻后備用。短小芽孢桿菌HRlO菌體懸濁液的制備將供試細(xì)菌活化后，用接種環(huán)取少量接種 于裝有50mL TSA液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，28°C，160r/min振蕩培養(yǎng)72h。將菌懸液 倒入滅菌的離心管中，4°C，5000r/min離心5min，倒去上清液，潤(rùn)洗菌體兩次，最后獲得菌 體懸濁液，并將各菌株接種液濃度調(diào)至5 X 108CfU/ml左右。黃色須腹菌(Rl)固體菌劑的制備利用ZPD培養(yǎng)基平板培養(yǎng)Rl菌根菌，將其作為 母菌種備用。固體擴(kuò)大培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石、玉米粉和麩皮，三者以8 1 1的比例充分混合， 攪拌均勻，然后加入ZPD營(yíng)養(yǎng)液(以手緊握有水滲出但不下滴為準(zhǔn))再次拌勻，取約400g 基質(zhì)裝入培養(yǎng)袋中，將其壓實(shí)，并用包裝繩扎好袋口。培養(yǎng)基質(zhì)經(jīng)1. 01 X 106pa滅菌90min， 冷卻后，在無菌條件下將Rl接種于固體培養(yǎng)基質(zhì)，置于25°C恒溫培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基 質(zhì)后即制備成外生菌根真菌的固體菌劑。短小芽孢桿菌HRlO與黃色須腹菌(Rl)雙接種的盆栽試驗(yàn)采用芽苗截根法移栽 黑松幼苗，基質(zhì)土與固體菌劑比例為10 1，細(xì)菌接種液的量為5mL/株，濃度約為IO7Cfu/ go具體方法如下首先，取適量無菌的盆栽基質(zhì)裝入培養(yǎng)杯中，然后在土層表面覆約20g的 外生菌根菌劑；其次，將子葉期的黑松幼苗輕輕地從育苗盆中取出，并用清水將幼苗根部的 沙子沖洗干凈，用解剖刀將芽苗截去少量主根后移栽至培養(yǎng)杯中，使根系盡量包埋于菌劑 中，壓實(shí)土壤；第三，用無菌移液管吸取5ml的細(xì)菌菌體懸濁液，沿幼苗根系將其緩緩注入， 然后再覆一層基質(zhì)土，每個(gè)處理的盆栽基質(zhì)土為200g ；第四，澆水定根。以單接種細(xì)菌或外 生菌根菌及不接菌三種處理作為對(duì)照，每處理10個(gè)重復(fù)。置于25°C溫室培養(yǎng)，光照為12h/ d，適時(shí)澆水，統(tǒng)一管理。待雙接種處理黑松苗生長(zhǎng)16個(gè)月后，對(duì)植株的生長(zhǎng)狀況、生物量進(jìn) 行觀察和測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明(表4 ；圖3)，各接種處理均能顯著改善黑松的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，但不同處 理間差異顯著。單接種HRlO對(duì)黑松的促生作用最為顯著，該處理的黑松苗高、地徑的增長(zhǎng)
6率分別高達(dá)62. 92%,62. 50%;R1+HR10混接處理，單接種Rl處理對(duì)黑松生長(zhǎng)的促生作用次 之，各處理間差異達(dá)顯著水平。不同接種處理對(duì)黑松植株總生物量的影響也存在顯著差異。單接種HRlO可以顯 著增加黑松植株的總生物量，其植株總濕重的增長(zhǎng)率高達(dá)132. 29%;R1+HR10混接和單接種 Rl處理的黑松總生物量的增長(zhǎng)率分別達(dá)到73. 7%和27. 86%，以上三種接種處理與CK均達(dá) 到顯著差異水平。表4短小芽孢桿菌HRlO與黃色須腹菌(Rl)互作對(duì)黑松苗木生長(zhǎng)的影響 實(shí)施例3 短小芽孢桿菌HRlO對(duì)絲核菌(Rhizoctonia sp.)平板抑菌作用將用NA斜面活化的短小芽孢桿菌HRlO菌株劃線接種于PDA平板兩側(cè)，再將松樹 苗木猝倒病病原菌PDA平板培養(yǎng)物用直徑5mm的打孔器打取同質(zhì)同量的菌塊，點(diǎn)接于平板 中間。28°C培養(yǎng)7天觀察抑菌帶的有無，并記錄其寬度。從表5和圖4可看出，HRlO對(duì)病 原菌絲核菌(Rhizoctonia sp.)具有拮抗作用。與對(duì)照相比，抑菌率達(dá)85. 58%。表5短小芽孢桿菌HRlO對(duì)絲核菌(Rhizoctonia sp.)的抑制作用 實(shí)施例4 短小芽孢桿菌HRlO對(duì)溫室盆栽松苗猝倒病的防治芽苗的培育同實(shí)施例2;接種方法待黑松芽苗長(zhǎng)至子葉期時(shí)進(jìn)行移栽(每處理20個(gè)重復(fù))，移栽基質(zhì)土 壤采自南京林業(yè)大學(xué)校園后山，與沙子、蛭石以2 1 1的比例充分混勻后經(jīng)1.01 X IO6Pa 滅菌90min，冷卻后即為培養(yǎng)基質(zhì)。將松苗猝倒病病原菌絲核菌(Rhizoctonia sp.，編號(hào) Csl)接種到PD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)7d,采用無菌紗布過濾獲得菌體，將其與培養(yǎng)基質(zhì)充分混 勻，即為帶菌培養(yǎng)基質(zhì)。先在育苗杯中放置1/2的無菌培養(yǎng)基質(zhì)，再在每個(gè)育苗杯中施20g 帶菌培養(yǎng)基質(zhì)；將黑松苗移栽到育苗杯中，短小芽孢桿菌HRlO菌株接種方法同實(shí)施例2，設(shè) 不接病原菌為對(duì)照(CK)，以校正發(fā)病率，每處理20個(gè)重復(fù)，7天后觀察并統(tǒng)計(jì)松苗的發(fā)病和 死亡情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，短小芽孢桿菌HRlO提高松苗抗猝倒病的能力(表6)。HRlO與Csl 混合接種的松苗猝倒病的發(fā)病率僅為15%，死亡率為10% ；而單接種病原菌Csl的黑松其 猝倒病發(fā)病率高達(dá)80 %，死亡率為65 %。
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表6不同接種處理對(duì)黑松猝倒病發(fā)病率和死亡率的影響
權(quán)利要求
一種外生菌根輔助細(xì)菌短小芽孢桿菌HR10，其分類命名為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，其保藏編號(hào)是CCTCC NoM2010143，保藏日期2010年6月12日。
2.權(quán)利要求1所述的外生菌根輔助細(xì)菌短小芽孢桿菌在促進(jìn)黃色須腹菌(Rhizopogen luteous)生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的外生菌根輔助細(xì)菌短小芽孢桿菌在促進(jìn)黑松生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的外生菌根輔助細(xì)菌短小芽孢桿菌與黃色須腹菌 (Rhizopogenluteous)互作在促進(jìn)黑松生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的外生菌根輔助細(xì)菌短小芽孢桿菌在防治由絲核菌 (Rhizoctoniasp.)引起的松苗猝倒病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株外生菌根輔助細(xì)菌短小芽孢桿菌HR10，其分類命名為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，其保藏編號(hào)是CCTCC NoM 2010143，保藏日期2010年6月12日。本發(fā)明的短小芽孢桿菌HR10為植物根際促生細(xì)菌，不僅對(duì)黑樹生長(zhǎng)具有直接的促進(jìn)作用，而且還能夠促進(jìn)外生菌根真菌黃色須腹菌的生長(zhǎng)，其與黃色須腹菌雙接種對(duì)黑松也具有明顯的促生效果；短小芽孢桿菌HR10對(duì)松樹苗木猝倒病病原絲核菌具有抑制作用；溫室防治試驗(yàn)表明，短小芽孢桿菌HR10菌株能有效防治松樹苗木猝倒病。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101914474SQ20101023882
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者侯亮亮, 劉輝, 葉建仁, 吳小芹, 盛江梅 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)