專利名稱：用于樣品中蘋(píng)果源性成分檢測(cè)的引物及方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用于樣品中蘋(píng)果源性成分檢測(cè)的寡核苷酸引物，用于測(cè)定樣品中蘋(píng)果源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，用于快速檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的PCR檢測(cè)試劑盒，以及樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物和探針在檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國(guó)是世界最大的蘋(píng)果栽培國(guó)，也是蘋(píng)果汁生產(chǎn)和出口大國(guó)。蘋(píng)果汁作為僅次于橙汁的世界第二大果汁飲料，是目前全球消費(fèi)量增長(zhǎng)最快的果汁之一。近年來(lái)，隨著人民生活水平的提高，我國(guó)蘋(píng)果汁的銷量不斷增長(zhǎng)，品種和類型不斷增多，品牌五花八門。但是，受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，一些不法廠商在果汁成分及含量標(biāo)示上弄虛作假，假冒偽劣產(chǎn)品充斥市場(chǎng)。如在1995年，由于國(guó)際市場(chǎng)上蘋(píng)果汁的短缺，蘋(píng)果汁價(jià)格在高位波動(dòng)，而梨汁甚至糖漿等價(jià)格較低，因此摻入梨汁甚至糖漿等的蘋(píng)果汁充斥市場(chǎng)。這不僅直接損害了消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)利益，而且極有可能危害消費(fèi)者健康，同時(shí)也侵犯了商標(biāo)持有企業(yè)的合法權(quán)益，最終不僅破壞我國(guó)市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)秩序，擾亂社會(huì)誠(chéng)信體系，而且影響我國(guó)商品在國(guó)際市場(chǎng)上的形象，損害我國(guó)進(jìn)出口貿(mào)易利益。此外，隨著人們生活方式的改變，我國(guó)食品過(guò)敏的發(fā)病率日漸增高，食品過(guò)敏的受重視程度越來(lái)越高，對(duì)各類食源性過(guò)敏源的檢測(cè)也顯得越來(lái)越重要。類甜蛋白 Thaumatin-Like Protein(TLP)作為其中一種重要的過(guò)敏源，逐漸受到越來(lái)越多的關(guān)注。 TLP目前已從多種食物中提取出來(lái)，如梨、蘋(píng)果、桃、小麥、番茄和馬鈴薯等，它是植物在受到病原微生物侵害時(shí)體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的病程相關(guān)蛋白(I3Rs)家族的重要成員之一，參與多種真菌抗性反應(yīng)過(guò)程，還是部分人群的重要過(guò)敏原。目前市場(chǎng)上蘋(píng)果汁飲料中的類甜蛋白成分可能因?yàn)闃?biāo)識(shí)不清或摻偽造假，造成部分人群對(duì)其過(guò)敏而侵犯消費(fèi)者權(quán)利。因此，果汁飲料中的過(guò)敏源成分類甜蛋白檢測(cè)具有理論和現(xiàn)實(shí)意義。目前蘋(píng)果汁摻假方式主要有兩種第一種是在蘋(píng)果汁中摻入一些價(jià)格更廉的果汁，比如白葡萄汁或者梨汁；第二種是向蘋(píng)果汁中加入水和糖漿等成分，增加其體積。而現(xiàn)有的蘋(píng)果汁真?zhèn)舞b別方法有糖類辨別法、有機(jī)酸辨別法、果膠物質(zhì)鑒定法、酚類物質(zhì)鑒定法、酮類物質(zhì)鑒定法、氨基酸鑒別法、無(wú)機(jī)元素辨別法等特定成分辨別法以及高效液相色譜技術(shù)、氣相色譜、穩(wěn)定性同位素質(zhì)譜法、MALDI-T0MS法、熱裂解質(zhì)譜法、近紅外光譜技術(shù)、紫外光譜技術(shù)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等儀器分析法等。上述這些方法的應(yīng)用，對(duì)果汁市場(chǎng)的監(jiān)督與管理起到了一定的作用。但是，上述技術(shù)很大程度上會(huì)受到品種、產(chǎn)地、收獲季節(jié)、原料環(huán)境、 加工條件、貯運(yùn)包裝方式等很多因素的影響，具有一定的局限性。另外，影響理化或儀器鑒偽技術(shù)取樣代表性的因素非常多，要保證其方法的可靠性，就需要大量的檢測(cè)樣本和科學(xué)的數(shù)理模型分析技術(shù)，使得上述方法在實(shí)際應(yīng)用上受到很大的限制。國(guó)際蘋(píng)果汁加工業(yè)中深加工產(chǎn)品越來(lái)越多、新技術(shù)層出不窮，而我國(guó)蘋(píng)果加工業(yè)還存在著原料不足、農(nóng)殘超標(biāo)等尚需解決的問(wèn)題，蘋(píng)果汁摻偽鑒別方法也是影響我國(guó)蘋(píng)果汁行業(yè)健康發(fā)展的制約因素之一。當(dāng)前，急需一種能不受添加手段影響，從果汁原料本質(zhì)上予以檢測(cè)的鑒偽技術(shù)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)方法進(jìn)行食品鑒別正成為國(guó)際上倍受關(guān)注的研究方向。分子生物學(xué)技術(shù)以其方便、準(zhǔn)確、迅速、簡(jiǎn)潔的特點(diǎn)，從基因水平分析食品原料和產(chǎn)品的特性和來(lái)源，靈敏度更高、特異性更強(qiáng)，其結(jié)果為證明食品的真?zhèn)翁峁┝苏鎸?shí)、可靠的依據(jù)，近年來(lái)逐漸用于食品種類鑒別、產(chǎn)品溯源等的鑒偽。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道能夠快速、簡(jiǎn)單、特異且靈敏地檢測(cè)果汁、食品、藥品以及營(yíng)養(yǎng)品等樣品中蘋(píng)果源性成分的方法以及試劑盒。因此，本領(lǐng)域需要一種快速、特異性好、靈敏度高的樣品中蘋(píng)果源性成分的檢測(cè)方法以及用于快速檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的試劑盒，進(jìn)行果汁、食品、藥品以及營(yíng)養(yǎng)品等樣品中蘋(píng)果源性成分的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供快速檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供快速測(cè)定樣品中蘋(píng)果源性成分的PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于，提供用于快速檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的PCR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的還一個(gè)目的在于，提供樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物和探針在檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分中的應(yīng)用。針對(duì)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)，所述引物對(duì)是根據(jù)類甜蛋白基因內(nèi)含子和核糖體DNA的ITS區(qū)序列在不同植物物種中具有差異性的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述引物對(duì)選自No2-F TTCAATGTCGATGATGAAGAG (SEQ ID NO 1)和 No2-R :AGACTTCCTACTTTCACGTTTAAC(SEQ ID NO :2) ；No3_F :GGAATATGAACGAAAGAGCG(SEQ ID NO 3)禾口 No3-R :AACGACTCTCGGCAACGGAT(SEQ ID NO :4)；以及 Rpll6_F 5'AATCTATGGAATCGTGGGATTC 3，(SEQ ID NO :5) ^P Rpl 16-R 5，CATTATAGCGTTCTACCAAAACG 3，(SEQ ID NO 6)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)是SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)是SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)是SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供樣品中蘋(píng)果源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法，所述方法包括使用針對(duì)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)，所述引物對(duì)是根據(jù)類甜蛋白基因內(nèi)含子和核糖體DNA的ITS區(qū)序列在不同植物物種中具有差異性的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的樣品中蘋(píng)果源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法中所使用的特異性引物對(duì)選自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2 ；SEQ IDNO :3和SEQ ID NO 4 ；以及 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR方法為STOR熒光染料法。在本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR方法為Taqman熒光探針?lè)?。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的Taqman熒光探針?lè)ㄖ校?還使用特異性的探針。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所使用的探針序列為No3-P :FAM-TGCGT CGTCGTCTTCGATAA-TAMAR(SEQ ID NO :7)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的樣品中蘋(píng)果源性成分PCR檢測(cè)方法還進(jìn)一步包括提取樣品總DNA的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述DNA提取步驟，通過(guò)檢測(cè)植物本身所具有的內(nèi)源參照基因葉綠體trn基因，來(lái)測(cè)試樣品總DNA的提取質(zhì)量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述內(nèi)參基因植物葉綠體trn基因的通用引物序列為 Nol-F :CTTGATTTTACCAAAGATGATGA(SEQ IDNO :8)和 No I-R :TTCTTCGCATGTACCCGCAG(SEQ ID NO 9)。在本發(fā)明的樣品中蘋(píng)果源性成分PCR檢測(cè)方法中，所使用的對(duì)照樣品包括梨汁、 桃汁、橙子、獼猴1 、番茄等。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)和植物通用擴(kuò)增引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所使用的蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，所使用的植物通用擴(kuò)增引物為SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所使用的蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4，所使用的植物通用擴(kuò)增引物為 SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所使用的蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)為SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6，所使用的植物通用擴(kuò)增引物為SEQ ID NO 8 禾口 SEQ IDNO :9。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供樣品中蘋(píng)果源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法，所述方法包括使用本發(fā)明的針對(duì)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)的組合。在一個(gè)實(shí)時(shí)方案中，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，還包括使用內(nèi)參基因植物葉綠體trn基因通用引物序列SEQ ID NO 8和SEQ ID NO :9，通過(guò)檢測(cè)植物本身所具有的內(nèi)源參照基因葉綠體trn基因，來(lái)測(cè)試樣品總DNA的提取質(zhì)量。在本發(fā)明的樣品中蘋(píng)果源性成分的PCR檢測(cè)方法中，還進(jìn)一步包括對(duì)PCR擴(kuò)增條件進(jìn)一步優(yōu)化的步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化的步驟中，使用不同的退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述PCR擴(kuò)增條件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C，lmin。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供快速檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)和使用說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括用于樣品DNA 提取的試劑和用于PCR反應(yīng)的試劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)中包括對(duì)用于樣品中蘋(píng)果源性成分PCR擴(kuò)增的條件的描述。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒的說(shuō)明書(shū)中給出的PCR擴(kuò)增條件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C，lmin。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供本發(fā)明的用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)在檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分中的應(yīng)用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)SEQ ID NO :1 禾口 SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 ；或 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 在檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分中的應(yīng)用。本發(fā)明以蘋(píng)果的DNA為檢測(cè)基礎(chǔ)，根據(jù)類甜蛋白基因內(nèi)含子和核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間區(qū)(ITQ序列在不同植物物種中具有差異性的特點(diǎn)，克隆了蘋(píng)果的類甜蛋白基因內(nèi)含子及其核糖體DNA的ITS 1-5.8S-ITS2區(qū)序列。根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)引物，利用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)樣品中的蘋(píng)果源性成分。實(shí)時(shí)熒光定量PCR即在常規(guī)PCR方法的基礎(chǔ)上，加入熒光標(biāo)記的探針或者熒光染料，隨著PCR產(chǎn)物的積累，探針或染料發(fā)出的熒光信號(hào)增強(qiáng)，而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每產(chǎn)生一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。因此可以實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程，并最終檢測(cè)出待測(cè)樣品的初始拷貝數(shù)， 從而可檢測(cè)待測(cè)樣品中所含蘋(píng)果源性成分。本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法采用完全閉管檢測(cè)，無(wú)需PCR后處理，避免了交叉污染和假陽(yáng)性。本發(fā)明的方法巧妙地運(yùn)用了 PCR技術(shù)的DNA高效擴(kuò)增、核酸雜交的特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的快速和敏感性，具有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的按照引物序列制成的試劑盒，用于此類產(chǎn)品的定性、定量檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果穩(wěn)定可靠且避免交叉污染造成假陽(yáng)性的優(yōu)點(diǎn)。使用本發(fā)明的PCR檢測(cè)方法和PCR 檢測(cè)試劑盒，既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)，其簡(jiǎn)單、快速、特異且靈敏的特點(diǎn)適合用于國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上蘋(píng)果汁及其相關(guān)飲料的真?zhèn)舞b別和過(guò)敏源成分的檢測(cè)等。


圖1是顯示待測(cè)樣品DNA提取效果的凝膠電泳圖，其中使用植物通用引物檢測(cè)，各泳道的樣品如下=M =DNA分子量標(biāo)記(2000bp) ；1 雪花梨；2 匯源梨汁；3 茹夢(mèng)牌梨汁；4 海太梨汁；5 匯源梨果肉飲料；6 匯源混合果蔬汁飲料；7 國(guó)光蘋(píng)果；8 光明果誘100% ； 9 匯源蘋(píng)果汁；10 樂(lè)活滋100% ；11 匯源蘋(píng)果果肉飲料；12 水蜜桃；13 匯源桃汁；14 茹夢(mèng)牌桃汁；15 海太桃汁；16 匯源桃果肉飲料；17 橙子；18 獼猴桃；19 番茄；20 空白對(duì)照(無(wú)菌水)。圖2是顯示通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)蘋(píng)果汁中蘋(píng)果的類甜蛋白基因的結(jié)果，其中熒光曲線1-11依次為陽(yáng)性對(duì)照(國(guó)光蘋(píng)果)、光明果誘100%、匯源蘋(píng)果汁、樂(lè)活滋100%、匯源蘋(píng)果果肉飲料、匯源梨汁、茹夢(mèng)牌梨汁、桃汁、橙汁、獼猴桃汁、番茄汁及空白對(duì)照。圖3是顯示實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)蘋(píng)果汁中蘋(píng)果的ITS區(qū)序列的結(jié)果，其中熒光曲線 1-11依次為陽(yáng)性對(duì)照(國(guó)光蘋(píng)果)、光明果誘100%、匯源蘋(píng)果汁、樂(lè)活滋100%、匯源蘋(píng)果果肉飲料、梨汁、桃汁、橙汁、獼猴桃汁、番茄汁及空白對(duì)照。
具體實(shí)施例方式通過(guò)實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但是本發(fā)明并不僅僅局限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1本實(shí)施例為通過(guò)使用植物通用引物測(cè)試樣品總DNA的提取質(zhì)量。通過(guò)檢測(cè)植物本身所具有的內(nèi)源參照基因葉綠體trn基因，可以測(cè)試樣品總DNA 的提取質(zhì)量。本實(shí)施例中所使用的用于檢測(cè)樣品中植物源性成分的植物葉綠體trn基因通用引物序列為 SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO :9。在本實(shí)施例中，檢測(cè)了雪花梨、匯源梨汁(北京匯源食品飲料有限公司，中國(guó))、海太梨汁(海太，韓國(guó))、匯源梨果肉飲料(北京匯源食品飲料有限公司，中國(guó))、茹夢(mèng)牌梨汁 (大湖(天津)新鮮食品果汁有限公司，中國(guó))、樂(lè)天梨汁(樂(lè)天，韓國(guó))、國(guó)光蘋(píng)果、光明蘋(píng)果汁(光明乳業(yè)股份有限公司乳品工廠，中國(guó))、匯源蘋(píng)果汁(北京匯源食品飲料有限公司， 中國(guó))、大湖蘋(píng)果汁(大湖(天津)新鮮食品果汁有限公司，中國(guó))、樂(lè)活滋100%蘋(píng)果汁 (北京樂(lè)活滋科技發(fā)展有限公司，中國(guó))、水蜜桃、匯源桃汁(北京匯源食品飲料有限公司， 中國(guó))、匯源桃果肉飲料(北京匯源食品飲料有限公司，中國(guó))、茹夢(mèng)牌桃汁(大湖(天津) 新鮮食品果汁有限公司，中國(guó))、海太桃汁(海太，韓國(guó))、橙子、獼猴桃、番茄的總DNA的提取質(zhì)量，并使用鴨肉作為陰性對(duì)照。如圖1所示，用植物通用引物擴(kuò)增待測(cè)樣品的DNA時(shí)均能在約159bp處出現(xiàn)條帶，表明所有待測(cè)樣品DNA提取成功。實(shí)施例2本發(fā)明的發(fā)明人首次通過(guò)PCR克隆并測(cè)序了蘋(píng)果的類甜蛋白基因部分序列。本實(shí)施例為通過(guò)PCR克隆測(cè)序獲得蘋(píng)果的類甜蛋白基因部分序列。根據(jù)類甜蛋白基因內(nèi)含子在不同植物品種中具有差異性的特點(diǎn)，采用蘋(píng)果類甜蛋白基因序列(Genbank No. AY792604)設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增蘋(píng)果。按照Wizard Gel Extraction Kit (!Iomega，美國(guó))的操作說(shuō)明對(duì)蘋(píng)果PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、回收。按TaKaRa pMD 19-T Vector試劑盒(TaKaRa，日本)的說(shuō)明書(shū)將純化產(chǎn)物與pMD19_T Vector連接，連接體系 10 μ L，其反應(yīng)組分為:pMD19-T Vector 1 μ L、PCR 產(chǎn)物 2 μ L、ddH20 2 μ L,Solution I 5 μ L，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。將連接體系置于室溫(22-37°C)反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后，立即置于冰上。加連接產(chǎn)物于50 μ LTOP感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30min，42°C準(zhǔn)確熱激90s，立即置于冰上2min，然后加入800 μ L已滅過(guò)菌的腦心浸液，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)lh。5000r/min低速離心lmin，棄600 μ L上清，將沉淀混勻，取100 μ L混合液涂于 Amp+、X-Gal和IPTG處理的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)后置于4°C冰箱中4h。挑取單菌落白斑，在含有終濃度200 μ g/mL的Amp的腦心浸液中在37°C、200r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。(1)陽(yáng)性克隆鑒定挑取單個(gè)白色克隆，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，體系為25yL，其組份為反應(yīng)IOXBuffer 2. 5μ L.dNTPs 1 μ L、上下游引物各0. 5 μ L、Taq酶0. 2 μ L，挑取單菌落作為模板，加水補(bǔ)至25 μ L。反應(yīng)程序?yàn)?4°C 5min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。(2)測(cè)序確定陽(yáng)性克隆后，挑取該菌落，在含有終濃度200 μ g/mL Amp的5 μ L腦心浸液中在37°C、200r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。取ImL菌液送生物公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。PCR克隆測(cè)序得到的蘋(píng)果類甜蛋白基因部分序列如下GCAAACAGGCAATTAAGACATATTCAATGTCGATGATGAAGAGCCAAGTAGCTTCCCTCCTCGGCCTCA CCTTGGCCATCCTCTTCTTCTCAGGTAATATTATACAAACTTCTCATTATATTTTTTGTTCTTTTTGTTTCCTATTA GTCTCTAGTATATTGTATGCATGCCTGCCTGATGCAAATATGAGAGGGGTTAGTCCGCACTATATTGTAATACTGTT AAACGTGAAAGTAGGAAGTCTAAGAGAGAATAACGATGATGGATAATTCTGTGACGTCCACTAATAATTTTATTAAA ACAAGGAGTACTAGTACTTTTTAAAAGGATACCGTAAAAGTTCTCAATCCGGCCACATATAAGTGAACTAACCAATG CGGCTAACATGAGATTAGATATATTTATAATTGTATGTAGATTTTTCAGTATCAATATTCTTAGTATCTAGTTCTAT GTTGAACATAAATGCAGGTGCACATGCAGCGAAAATCACTTTCACAAACAACTGCCCCAACACTGTCTGGCCAGGAA CCTTAACC(SEQ ID NO 10)。實(shí)施例3
本實(shí)施例為通過(guò)使用蘋(píng)果的類甜蛋白基因的引物序列經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的類甜蛋白基因序列。STOR熒光染料法STOR Green是高靈敏的 DNA熒光染料，在各種分析中至少可檢出20pg DNA。STOR Green染料與雙鏈DNA的親和力非常高，在PCR反應(yīng)中與產(chǎn)物dsDNA結(jié)合后熒光信號(hào)會(huì)增強(qiáng)800-1000倍且對(duì)分子生物學(xué)中常用的酶沒(méi)有抑制作用。SYBR Green PCR反應(yīng)體系為Faststart UniversalSYBR Green Master (Roche) 12. 5 μ L ；上下游引物(10 μ mol/L)各 0. 5 μ L ；DNA 模板 5 μ L (約 50ng)，用無(wú)菌水補(bǔ)至總體系為25 μ L0采用Bio-RadiQTM5多色實(shí)時(shí)PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增及結(jié)果分析，擴(kuò)增條件如下95°C預(yù)變性IOmin ；95°C 10s,58°C 30s,40個(gè)循環(huán)，在PCR反應(yīng)后進(jìn)行熔解曲線分析。引物序列為:SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。所使用的檢測(cè)主要儀器微量移液器(10μ LUOOy LUOOOy L Eppendorf)、熒光定量 PCR 儀 (Mastercycler 印 realplex4 Eppendorf)、高速臺(tái)式離心機(jī)(Picol7 Thermo)、高速粉碎機(jī)(IKA-WEARKE GERMANY)、凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius)、電泳儀(DYY22C型，北京六一儀器廠)、核酸蛋白分析儀(DYY-6C，北京六一儀器廠)、冷凍干燥機(jī)(Modulyod Freeze Dryer Thermo)、制冰機(jī)(XB70GRANT)等。檢測(cè)主要試劑Taq酶、dNTPs、10XPCR Buffer、溴化乙錠、DNA Ladder Marker(2000) (Takara)購(gòu)自上海生工公司；TaciMan Universal SYBR Green Master 購(gòu)自 Roche 公司；引物(SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2)由上海奧科生物科技有限公司合成等。檢測(cè)主要步驟IDNA 提取待測(cè)果汁樣品為光明果誘100%、匯源蘋(píng)果汁、樂(lè)活滋100%、匯源蘋(píng)果果肉飲料、匯源梨汁、茹夢(mèng)牌梨汁、桃汁、橙汁、獼猴桃汁和番茄汁。取30mL樣品至一潔凈培養(yǎng)皿中，抽真空凍干；稱取0. 2g冷凍干物質(zhì)至一潔凈 50mL 離心管中，加入 5mLCTAB 裂解液(2% CTAB (ff/V), 0. lmol/LTris-HCl, 20mmol/L EDTA,
1.4mol/LNaCl)，65°C 2h，間期不斷混勻幾次；8000rpm 15min,取ImL上清液至1支潔凈
2.OmL離心管中，加入700 μ L氯仿，劇烈混勻30s, 14500rpm IOmin,分別取650 μ L上清液至潔凈 2. OmL 離心管中，加入 1300 μ L CTAB 沉淀液(0. 5% CTAB (ff/V), 0. 04mol/LNaCl)， 劇烈混勻30s，室溫靜置Ih ;14500rpm 20min，棄上清液，加入350 μ L 1. 2Μ NaCl，劇烈振蕩 30s，再加入350 μ L氯仿，劇烈混勻30s, 14500rpm IOmin ；分別取上清液320 μ L，加入0. 8 倍體積異丙醇，混勻后，-200C lh，14500rpm 20min，棄上清液，加入500 μ L 70%乙醇，混勻后，14500rpm 20min，棄上清液，晾至風(fēng)干，加入30 μ L ddH20溶解，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)所用引物SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系F aststart Universal SYBR Green Master 12. 5μ L上游引物(10ymol/L)0·5μ L下游引物(10ymol/L)0·5μ L
模板 DNA 5μ L加ddH20至總體積為25 μ L注每次PCR檢測(cè)均設(shè)立相應(yīng)的空白對(duì)照(用配制反應(yīng)體系的超純水代替DNA模板，檢測(cè)試劑是否受到污染)；4實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)95 "C IOmin95 "C IOs58 "C 30s40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。注不同儀器應(yīng)將PCR各試劑及反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。如圖2所示，利用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)樣品中蘋(píng)果的類甜蛋白基因序列時(shí)，國(guó)光蘋(píng)果、光明果誘100%、匯源蘋(píng)果汁、樂(lè)活滋100%、匯源蘋(píng)果果肉飲料PCR擴(kuò)增片段的熔解曲線峰值均在74. 82士 1. 0°C，而梨汁、桃汁、橙汁、獼猴桃汁、番茄汁及空白對(duì)照均無(wú)此熔解曲線峰值，表明該引物能有效檢測(cè)出樣品中的蘋(píng)果源性成分。實(shí)施例4與根據(jù)實(shí)施例3所述的方法相同，只是以待測(cè)樣品DNA為模板，采用類甜蛋白基因的引物序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2以及植物通用擴(kuò)增引物對(duì)SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。實(shí)施例5本實(shí)施例為通過(guò)使用蘋(píng)果的ITS基因的引物序列經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的序列。Taqman熒光探針?lè)?TaqMan技術(shù)是一種對(duì)單管PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)的技術(shù)，在普通PCR擴(kuò)增系統(tǒng)中，加入一個(gè)與靶基因序列特異互補(bǔ)的雙熒光標(biāo)記探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。定量步驟①確定CT值(C表示循環(huán)數(shù)(Cycle)，T表示熒光域值(Threshold)， 即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；②利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定。獲得未知樣品的CT值后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，即起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。 反應(yīng)體系為TaqMan Universal probe Master 12.5yL;探針(10 μ mol/L) 0. 5 μ L ；上、下游引物(10 μ mol/L)各0. 5 μ L ；模板DNA 5 μ L ；加ddH20至總體積為25 μ L。反應(yīng)程序?yàn)?950C IOmin ；95°C 15s ；60°C Imin0所使用的檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的ITS基因引物序列為上游引物SEQ ID NO 3;下游引物SEQ ID NO :4;探針SEQ ID NO :7。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)。熒光基團(tuán)FAM(6-羧基熒光素(6-carboxy fluo-rescein))和TAMRA連接在探針的5'末端，而淬滅劑 TAMAR(6-羧基羅丹明(6-carboxy tetramethyl rhodamine))則在 3'末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3'端的淬滅劑接近而淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5'外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。所使用的檢測(cè)主要儀器微量移液器(10μ L、100 μ L、1000 μ L Eppendorf)、熒光定量 PCR 儀(ABI7700Applied Biosystems, USA))、高速臺(tái)式離心機(jī)(Picol7 Thermo)、高速粉碎機(jī)(IKA-ffEARKE GERMANY)、凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius)、電泳儀(DYY22C型北京六一儀器廠)、核酸蛋白分析儀(DYY-6C北京六一儀器廠)、冷凍干燥機(jī)(Modulyod Freeze Dryer Thermo)、制冰機(jī) (XB70GRANT)等檢測(cè)主要試劑Taq 酶、dNTPs、10XPCR Buffer、溴化乙錠、DNA LadderMarker (2000) (Takara)購(gòu)自上海生工公司；TaqMan Universal probe Master購(gòu)自ABI公司；引物(上游引物SEQ ID NO :3;下游引物SEQ ID NO :4;探針SEQ ID NO :7。)由上海奧科生物科技有限公司合成等。檢測(cè)主要步驟IDNA 提取待測(cè)果汁樣品為光明果誘100%、匯源蘋(píng)果汁、樂(lè)活滋100%、匯源蘋(píng)果果肉飲料、梨汁、桃汁、橙汁、獼猴桃汁和番茄汁。取30mL樣品至一潔凈培養(yǎng)皿中，抽真空凍干；稱取0. 2g冷凍干物質(zhì)至一潔凈 50mL離心管中，加入5mLCTAB裂解液，65°C 2h，間期不斷混勻幾次；8000rpm 15min，取ImL 上清液至1只潔凈2. OmL離心管中，加入700 μ L氯仿，劇烈混勻30s, 14500rpm IOmin,分別取650 μ L上清液至潔凈2. OmL離心管中，加入1300 μ L CTAB沉淀液，劇烈混勻30s，室溫靜置Ih ;14500rpm 20min，棄上清液，加入350 μ L 1. 2Μ NaCl，劇烈振蕩30s，再加入350 μ L 氯仿，劇烈混勻30s，14500rpm IOmin ；分別取上清液320 μ L，加入0. 8倍體積異丙醇，混勻后，-20°C lh，14500rpm 20min，棄上清液，加入 500 μ L 70 % 乙醇，混勻后，14500rpm 20min,棄上清液，晾至風(fēng)干，加入30 μ L ddH20溶解，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)所用引物和探針引物序列為上游引物SEQ ID NO 3 ；下游引物SEQ ID NO 4 ；探針SEQ ID NO 7 3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系TaqMan Universal probe Master 12. 5 μ L探針(10μ mol/L) 0. 5 μ L上游引物(10ymol/L)0·5μ L下游引物(10ymol/L)0·5μ L模板 DNA 5μ L加ddH20至總體積為25 μ L注每次PCR檢測(cè)均設(shè)立相應(yīng)的空白對(duì)照(用配制反應(yīng)體系的超純水代替DNA模板，檢測(cè)試劑是否受到污染)；4實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)95 "C IOmin95 "C 15s60 °C Imin注不同儀器應(yīng)將PCR各試劑及反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。如圖3所示，利用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)樣品中蘋(píng)果的ITS基因序列時(shí)，國(guó)光蘋(píng)果、光明果誘100%、匯源蘋(píng)果汁、樂(lè)活滋100%、匯源蘋(píng)果果肉飲料均出現(xiàn)PCR擴(kuò)增，而梨汁、桃汁、橙汁、獼猴桃汁、番茄汁及空白對(duì)照均未出現(xiàn)，表明該引物探針能有效檢測(cè)出樣品中的蘋(píng)果源性成分。實(shí)施例6與根據(jù)實(shí)施例5所述的方法相同，只是以待測(cè)樣品DNA為模板，采用ITS基因的引物序列SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4以及探針SEQ ID NO 7和植物通用擴(kuò)增引物對(duì)SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :9，進(jìn)行雙重 PCR 擴(kuò)增。實(shí)施例7本發(fā)明的發(fā)明人首次克隆并測(cè)序了蘋(píng)果和梨的葉綠體rpl 16基因的部分序列。根據(jù)植物葉綠體rpll6基因序列設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增蘋(píng)果和梨的DNA。按照 Wizard Gel Extraction Kit的操作說(shuō)明對(duì)蘋(píng)果和梨的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、回收。按TaKaRa PMD19-T Vector試劑盒的說(shuō)明書(shū)將純化產(chǎn)物與pMD19-T Vector連接，連接體系10yL，其反應(yīng)組分為:pMD19-T Vectorl μ L、PCR產(chǎn)物 2 μ L、ddH20 2 μ L,Solution I 5 μ L，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。將連接體系置于室溫02-37°C)反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后，立即置于冰上。 加連接產(chǎn)物于50 μ LTOP感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30min，42°C準(zhǔn)確熱激90s，立即置于冰上2min，然后加入800 μ L已滅過(guò)菌的腦心浸液，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)lh。5000r/min 低速離心lmin，棄600 μ L上清，將沉淀混勻，取100 μ L混合液涂于Amp+、X_Gal和IPTG處理的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)后置于4°C冰箱中4h。挑取單菌落白斑，在含有終濃度 200 μ g/mL的Amp的腦心浸液37°C、200r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。(1)陽(yáng)性克隆鑒定挑取單個(gè)白色克隆，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，體系為25yL，其組份為反應(yīng)IOXBuffer 2. 5μ L.dNTPs 1 μ L、上下游引物各0. 5 μ L、Taq酶0. 2 μ L，挑取單菌落作為模板，加水補(bǔ)至25 μ L。反應(yīng)程序?yàn)?4°C 5min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。(2)測(cè)序確定陽(yáng)性克隆后，挑取該菌落，在含有終濃度200 μ g/mLAmp的5 μ L腦心浸液中37°C、200r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。取ImL菌液送生物公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。PCR克隆測(cè)序得到蘋(píng)果和梨的葉綠體rpll6基因的部分序列如下梨159TTAATAATCTATGGAATCGTGGGATTCTTTGAAATTTGATCTAATCGATTATAAATTAGAAATTTTTT GTGTTTTAATATATAATTTAACACGTATTTATATAATTTAACACGTATTCTATTTATAGATAATGTCGTTTTGGTA GAACGCTATAATGAATCTTTATTT(SEQ ID NO :11)。蘋(píng)果139TTAATAATATATGGAATCGTGGGATTCTTTGAAATTCGATCTAATCGATTATAAATTAGAAATTTTTT GTGTTTTAATATAGAATTTAACACGTATTCTATTTATAGATAATGTCGTTTTGGTAGAACGCTATAATGAATCTTT ATTT (SEQ ID NO :12)。通過(guò)葉綠體rpll6基因的PCR引物定量檢測(cè)蘋(píng)果和梨混合果汁中蘋(píng)果汁相對(duì)含量，用于定量檢測(cè)混合果汁中蘋(píng)果汁相對(duì)含量的葉綠體rpll6基因的PCR引物為SEQ ID NO 5SEQ ID NO :6。以此對(duì)引物擴(kuò)增混合果汁的DNA，蘋(píng)果成分所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為159bp，梨汁成分所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為139bp。通過(guò)在2. 5%的瓊脂糖或5%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，可以區(qū)分兩種PCR片段，并根據(jù)兩種PCR片段的相對(duì)豐度定量確定混合汁中蘋(píng)果和梨所占的比例。實(shí)施例8本實(shí)施例提供快速檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的試劑盒。所述試劑盒包括引物對(duì)SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和引物對(duì)SEQ IDNO :8、SEQ ID NO :9，以及使用說(shuō)明書(shū)，其中引物對(duì)SEQ ID NO 5,SEQID NO :6是用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)，SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :9是植物通用擴(kuò)增引物，所述使用說(shuō)明書(shū)中給出了 PCR擴(kuò)增條件，該條件為95°C，IOmin ；95°C，15s ；58°C，30s。 對(duì)于不同儀器，反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。實(shí)施例9本實(shí)施例提供快速檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的試劑盒。所述試劑盒包括引物對(duì)SEQ ID NO =USEQ ID NO :2和引物對(duì)SEQ IDNO :8、SEQ ID NO :9，以及使用說(shuō)明書(shū)，其中引物對(duì)SEQ ID NO :1和SEQID NO :2是用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)，SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9是植物通用擴(kuò)增引物，所述使用說(shuō)明書(shū)中給出了 PCR擴(kuò)增條件，該條件為95 V，IOmin ；95°C,15s ；60 °C, lmin。對(duì)于不同儀器，反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。實(shí)施例10本實(shí)施例提供快速檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的試劑盒。所述試劑盒包括引物SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4以及探針SEQ IDNO 7和引物對(duì)SEQ ID NO 8,SEQ ID NO :9，以及使用說(shuō)明書(shū)，其中引物對(duì)SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4 以及探針SEQ ID NO :7是用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)，SEQ ID NO 8,SEQ ID NO :9是植物通用擴(kuò)增引物，所述使用說(shuō)明書(shū)中給出了 PCR擴(kuò)增條件，該條件為95°C，IOmin ；95°C,15s ；60°C，lmin。對(duì)于不同儀器，反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。雖然已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到， 在不偏離本發(fā)明的范圍或精神的前提下可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改變與修飾。因而，本發(fā)明意欲涵蓋落在附屬權(quán)利要求書(shū)及其同等物范圍內(nèi)的所有這些改變與修飾。
權(quán)利要求
1.用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)，其中所述引物對(duì)選自以下引物對(duì)中的一種或多種SEQ ID N0:1和SEQ ID NO 2 ；SEQ ID N0:3禾口 SEQ ID NO 4 ；以及 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸引物對(duì)，其中所述引物對(duì)為SEQID N0:5和SEQ ID NO :6。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸引物對(duì)，其中所述實(shí)時(shí)熒光PCR方法為STOR熒光染料法，所述引物對(duì)為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸引物對(duì)，其中所述實(shí)時(shí)熒光PCR方法為Taqman熒光探針?lè)ǎ鲆飳?duì)為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4，且所使用的探針為SEQ ID NO :7。
5.樣品中蘋(píng)果源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的特異性寡核苷酸引物對(duì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，還包括使用植物葉綠體trn基因通用引物序列 SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO :9。
7.快速檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的特異性寡核苷酸引物對(duì)和使用說(shuō)明書(shū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括植物葉綠體trn基因通用引物序列 SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO :9。
9.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的特異性寡核苷酸引物對(duì)在檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于樣品中蘋(píng)果源性成分檢測(cè)的寡核苷酸引物。本發(fā)明還涉及用于測(cè)定樣品中蘋(píng)果源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，所述方法包括使用針對(duì)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物。本發(fā)明還涉及用于快速檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物。本發(fā)明還涉及針對(duì)樣品中蘋(píng)果源性成分的特異性寡核苷酸引物在檢測(cè)樣品中蘋(píng)果源性成分中的應(yīng)用。使用本發(fā)明的PCR檢測(cè)方法和PCR檢測(cè)試劑盒，能夠簡(jiǎn)單、快速、特異且靈敏地測(cè)定果汁、食品、藥品以及營(yíng)養(yǎng)品等樣品中是否含有蘋(píng)果源性成分。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102344952SQ20101024050
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月30日
發(fā)明者吳亞君, 鄧婷婷, 陳穎, 韓建勛, 黃文勝 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院