專利名稱：檢測多種魚類病原的基因芯片及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋生物的病原的分子生物學檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測多種魚類 病原的基因芯片及其檢測方法。
背景技術(shù)：
目前，病原微生物檢測方法的報道有很多，除了傳統(tǒng)的生理生化檢測之外，還有免 疫學檢測如間接熒光抗體技術(shù)、核酸印跡雜交及PCR檢測等方法。傳統(tǒng)的生化鑒定操作繁 瑣、且需要數(shù)天才能得到結(jié)果；免疫學方法熒光抗體技術(shù)從制樣到完成檢測只需3 4h，缺 點是免疫檢測需要制備抗血清；探針雜交技術(shù)也存在特異性和靈敏度的問題；常規(guī)PCR方 法一次只能檢出一種致病微生物，而對多種病原感染的樣品則顯的無從下手。新近發(fā)展起來的基因芯片技術(shù)達到在同一個支持物上對多種病原同時進行檢測 和鑒定的目的，不但大大縮短了檢測時間，而且能夠提高靈敏度和準確率，彌補了其它分子 生物學檢測手段的不足。國內(nèi)在基因芯片技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)動物疾病檢測上也進行了嘗試， 但尚未見應(yīng)用該技術(shù)同時對魚類病毒類、原生動物類和魚立克次氏體等多種病原微生物進 行檢測的相關(guān)基因芯片應(yīng)用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測多種魚類病原的基因芯片及其檢測方法，用于檢測 淋巴囊腫病毒、流行性造血器官壞死癥病毒、魚細胞腫大病毒、石斑魚虹彩病毒、病毒性神 經(jīng)壞死病毒RGNNV型、病毒性神經(jīng)壞死病毒BFNNV型、病毒性神經(jīng)壞死病毒SJNNV型、病毒 性神經(jīng)壞死病毒TPNNV型、病毒性神經(jīng)壞死病毒TNV型、傳染性造血器官壞死癥病毒、病毒 性出血敗血癥病毒、傳染性胰臟壞死病病毒、獅魚病毒性腹水病毒、傳染性鮭魚貧血病毒、 淀粉卵渦邊蟲、三代蟲和魚立克次氏體共17類魚類病原，以彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的技術(shù)方案包括一、基因芯片的構(gòu)建1、基因芯片上的探針選擇本發(fā)明共提供了兩大類探針，1)質(zhì)控體系的探針，包括表面化學質(zhì)控的探針、陰性 對照質(zhì)控的探針以及雜交陽性外對照質(zhì)控探針和整個流程監(jiān)控的陽性內(nèi)對照質(zhì)控的探針， 同時提供各探針對應(yīng)的正向引物及反向引物；2)用于檢測淋巴囊腫病毒等17類魚類病原 微生物的探針，同時提供各探針對應(yīng)的正向引物及反向引物。質(zhì)控體系各成員，包括表面化學質(zhì)控、陰性對照質(zhì)控、雜交陽性外對照質(zhì)控、整個 流程監(jiān)控的陽性內(nèi)對照質(zhì)控的探針引物序列及各病原微生物的探針及其序列信息如下(1)表面化學質(zhì)控QCl探針P序列、正向引物F序列和反向引物A序列分別對應(yīng)于 表1中的序號1、2和3 ；陰性對照質(zhì)控QC4探針P序列對應(yīng)于表1中序號4 ；雜交陽性外對 照質(zhì)控QC2探針P序列、正向引物F序列和反向引物A序列分別對應(yīng)于表1中序號5、6和 7 ；整個流程監(jiān)控的陽性內(nèi)對照質(zhì)控QC3探針P序列、正向引物F序列和反向引物A的序列分別對應(yīng)于表1中序號8、9和10 ；表1 質(zhì)控體系的探針及引物序列信息 其中“F”表示正向引物序列；“A”表示反向引物序列；“P”表示探針序列；(2)淋巴囊腫病毒探針序列P、正向引物序列F1、反向引物序列Al、正向引物序列 F2和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號1、2、3、4和5 ；(3)流行性造血器官壞死癥病毒探針序列P、正向引物序列F1、反向引物序列Al、 正向引物序列F2和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號6、7、8、9和10 ；(4)魚細胞腫大病毒探針序列P、正向引物序列F1、反向引物序列Al、正向引物序 列F2和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號11、12、13、14和15 ；(5)石斑魚虹彩病毒探針序列P、正向引物序列F、反向引物序列Al和反向引物序 列A2分別對應(yīng)于表2中序號16、17、18和19 ；石斑魚虹彩病毒另一個探針序列P3、正向引 物序列F3和反向引物序列A3分別對應(yīng)于表2中序號20、21和22 ；(6)病毒性神經(jīng)壞死病毒RGNNV型特征基因探針序列P1、正向引物序列Fl和反向 引物序列Al分別對應(yīng)于表2中序號23、24和25 ；病毒性神經(jīng)壞死病毒RGNNV型特征基因 探針序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號26、27和28 ；(7)病毒性神經(jīng)壞死病毒BFNNV型特征基因探針序列P1、正向引物序列Fl和反向 引物序列Al分別對應(yīng)于表2中序號29、30和31 ；病毒性神經(jīng)壞死病毒BFNNV型特征基因 探針序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號32、33和34 ；(8)病毒性神經(jīng)壞死病毒SJNNV型特征基因探針序列P1、正向引物序列Fl和反向 引物序列Al分別對應(yīng)于表2中序號35、36和37 ；病毒性神經(jīng)壞死病毒SJNNV型特征基因 探針序列P2、、正向引物序列F2和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號38,39和40 ；(9)病毒性神經(jīng)壞死病毒TPNNV型特征基因探針序列P1、正向引物序列Fl和反向 引物序列Al分別對應(yīng)于表2中序號分別對應(yīng)于表2中序號41、42和43 ；病毒性神經(jīng)壞死 病毒TPNNV型特征基因探針序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2 中序號44,45和46 ；
(10)病毒性神經(jīng)壞死病毒TNV型特征基因探針序列P、正向引物序列F1、正向引物 序列F2和反向引物序列A分別對應(yīng)于表2中序號47、48、49和50 ；(11)傳染性造血器官壞死癥病毒N基因探針序列P1、正向引物序列Fl和反向引 物序列Al分別對應(yīng)于表2中序號51、52和53 ；傳染性造血器官壞死癥病毒N基因探針序 列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號54,55和56 ；傳染性造 血器官壞死癥病毒G基因探針序列P3、正向引物序列F3和反向引物序列A3分別對應(yīng)于表 2中序號57、58和59 ；傳染性造血器官壞死癥病毒G基因探針序列P4、正向引物序列F4和 反向引物序列A4分別對應(yīng)于表2中序號60、61和62 ；(12)病毒性出血敗血癥病毒G基因探針序列P1、正向引物序列Fl和反向引物序 列Al分別對應(yīng)于表2中序號63、64和65 ；病毒性出血敗血癥病毒G基因探針序列P2、正向 引物序列F2和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號66、67和68 ；(13)傳染性胰臟壞死病病毒特征基因探針序列P1、正向引物序列Fl和反向引物 序列Al分別對應(yīng)于表2中序號69、70和71 ；傳染性胰臟壞死病病毒特征基因探針序列P2、 正向引物序列F2和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號72、73和74 ；(14)獅魚病毒性腹水病毒特征基因探針序列P1、正向引物序列Fl和反向引物序 列Al分別對應(yīng)于表2中序號75、76和77 ；獅魚病毒性腹水病毒特征基因探針序列P2、正向 引物序列F2和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號78、79和80 ；(15)傳染性鮭魚貧血病毒特征基因1探針序列P1、正向引物序列Fl和反向引物 序列Al分別對應(yīng)于表2中序號81、82和83 ；傳染性鮭魚貧血病毒特征基因1探針序列P2、 正向引物序列F2和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號84、85和86 ；(16)淀粉卵渦邊蟲特征基因1探針序列P1、正向引物序列Fl和反向引物序列Al 分別對應(yīng)于表2中序號87、88和89 ；淀粉卵渦邊蟲特征基因1探針序列P2、正向引物序列 F2和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號90、91和92 ；淀粉卵渦邊蟲特征基因2探針 序列P3、正向引物序列F3和反向引物序列A3分別對應(yīng)于表2中序號93,94和95 ；淀粉卵 渦邊蟲特征基因2探針序列P4、正向引物序列F4和反向引物序列A4分別對應(yīng)于表2中序 號 96,97 和 98 ；(17)三代蟲特征基因1探針序列P1、正向引物序列Fl和反向引物序列Al分別對 應(yīng)于表2中序號99、100和101 ；三代蟲特征基因1探針序列P2、正向引物序列F2和反向引 物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號102、103和104 ；三代蟲特征基因2探針序列P3、正向引 物序列F3和反向引物序列A3分別對應(yīng)于表2中序號105、106和107 ；三代蟲特征基因2探 針序列P4、正向引物序列F4和反向引物序列A4分別對應(yīng)于表2中序號108、109和110 ；(18)魚立克次氏體特征基因探針序列P1、正向引物序列Fl和反向引物序列Al分 別對應(yīng)于表2中序號111、112和113 ；魚立克次氏體特征基因探針序列P2、正向引物序列F2 和反向引物序列A2分別對應(yīng)于表2中序號114、115和116。表2 病源的探針以及相關(guān)的引物序列表3 檢測多種魚類病原的基因芯片上探針的陣列布局 其中每一個單元格代表一組探針(三個探針重復點)；除空白對照質(zhì)控“雙蒸水” 外，每一個單元格里的數(shù)字對應(yīng)探針信息表1或2的相應(yīng)數(shù)字序號的探針，例如“表1 :1”表 示該芯片此處點制的是探針信息表1中序號為1的表面化學質(zhì)控QCl探針；“表2 :1”表示 該芯片此處點制的是探針信息表2中序列為1的淋巴囊腫病毒(LCDV)基因的探針。其中 灰色背景的探針為質(zhì)控系統(tǒng)的基因探針組。二、基因芯片的應(yīng)用利用上述構(gòu)建的基因芯片作為檢測17類魚類病原微生物的應(yīng)用包括以下步驟(1)待測樣品準備
按照DNA抽提方法對待檢樣品的DNA進行提取，按照Trizol法對待檢樣品的RNA 進行提取。檢測DNA病原以提取的DNA為模板，檢測RNA病原以經(jīng)反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模 板；(2)地高辛標記PCR產(chǎn)物地高辛標記的PCR 反應(yīng)體系包括10 X Buffer 2. 5 μ 1，DIG PCR Mix 0. 5 μ 1 (PCR DIG標記混合物，Roche，德國，含0. 7mmol/L DIG-11-dUTP, 1. 3mmol/L dTTP,2mmol/L dATP, dCTP, dGTP), 5U/ μ 1 rTaq 酶 0. 25 μ 1，無菌去離子水 18. 75 μ 1，10 μ mol/L 正反向引物各 1 μ 1，5ng/ul模板1 μ，該反應(yīng)體系總體積25 μ L。地高辛標記的PCR 反應(yīng)程序94°C 4min，1 個循環(huán)；94 °C 30s，57°C 30s, 72 °C 45s，35個循環(huán)；72°C IOmin, 1個循環(huán)；4°C保存。(3)預(yù)雜交和雜交(4)加入堿性磷酸酶標記的地高辛抗體(5)顯色(6)結(jié)果判讀顯色結(jié)束后的芯片可根據(jù)雜交點出現(xiàn)的位置人工肉眼判讀，若顯示藍色或藍紫色 雜交點，則表示該樣品相對應(yīng)的病原檢測結(jié)果呈陽性，若不顯示任何顏色，則表示該樣品相 對應(yīng)的病原檢測結(jié)果呈陰性。本發(fā)明所述的共檢芯片檢測方法有如下優(yōu)點(1)本發(fā)明實現(xiàn)了在同一尼龍膜上對多種魚類病原微生物同時進行檢測(共檢 性)和鑒定的目的，大大縮短了檢測時間；(2)本發(fā)明的檢測方法成本低，整個過程不涉及有毒試劑，對操作人員和環(huán)境都安全；(3)質(zhì)控體系的構(gòu)建使得在芯片檢測中有假陽性或假陰性結(jié)果出現(xiàn)時，能及時的 找到問題環(huán)節(jié)，迅速地對實驗錯誤進行判斷和更正，實現(xiàn)了對整個實驗流程的有效監(jiān)控，能 更好的保證特異性；(4)操作簡單、結(jié)果明顯。整個檢測過程不涉及復雜的儀器或設(shè)備，檢測結(jié)果清晰 明顯，直接用眼睛觀察就可以判斷。綜上，本發(fā)明的具有比普通PCR檢測方法更高的特異性和靈敏性，可以替代魚類 病原微生物之前的相關(guān)檢測方法如電鏡觀察法、TE染色法、病理切片法、抗體檢測法、核酸 探針雜交法和PCR檢測法等。同時本發(fā)明具有高通量的特點，是現(xiàn)有魚類病原微生物鑒定 技術(shù)的突破。
具體實施例方式實施例1 基因芯片的構(gòu)建1、基因芯片上的探針選擇(1)特征基因的確定針對質(zhì)控體系及魚類常見的病原微生物，通過查閱相關(guān)文獻確定擬檢測的特征基 因。質(zhì)控體系分為5部分，分別是表面化學質(zhì)控、雜交陽性外對照質(zhì)控、整個流程監(jiān) 控的陽性內(nèi)對照質(zhì)控、陰性質(zhì)控以及空白質(zhì)控。表面化學質(zhì)控以牛肌動蛋白基因為 特征基因，用來監(jiān)控核酸在片基上的固定；雜交陽性外對照質(zhì)控以牛珠蛋白基因為特 征基因，用來監(jiān)控雜交步驟；整個流程監(jiān)控的陽性內(nèi)對照質(zhì)控以鲆鰈魚類宿主的內(nèi)參基因 β-肌動蛋白基因為特征基因；陰性質(zhì)控選用人神經(jīng)元烯醇化酶基因為特征基因；空白對 照則用雙蒸水。對于淋巴囊腫病毒、流行性造血器官壞死癥病毒、魚細胞腫大病毒、石斑魚虹彩病 毒、病毒性神經(jīng)壞死病毒RGNNV型、病毒性神經(jīng)壞死病毒BFNNV型、病毒性神經(jīng)壞死病毒 SJNNV型、病毒性神經(jīng)壞死病毒TPNNV型、病毒性神經(jīng)壞死病毒TNV型、傳染性造血器官壞死 癥病毒、病毒性出血敗血癥病毒、傳染性胰臟壞死病病毒、獅魚病毒性腹水病毒、傳染性鮭 魚貧血病毒、淀粉卵渦邊蟲、三代蟲和魚立克次氏體等17類魚類病原微生物，主要以核衣 殼蛋白基因(VP gene)，主要衣殼蛋白基因(MCP gene)，腺苷三磷酸酶基因(ATPasegene)， DNA 聚合酶基因(DNA polymerase gene)，RNA 聚合酶基因(RNA polymerase gene)，糖蛋白 基因(glycoprotein gene)和核蛋白基因(nucleoprotein gene)等為特征基因。(2)探針引物設(shè)計根據(jù)已確定的特征基因開展相關(guān)核酸序列的檢索。序列檢索借助Entrez檢索系 統(tǒng)，利用GenBank數(shù)據(jù)庫完成。選取種屬特異性保守區(qū)設(shè)計引物，并在引物擴增區(qū)設(shè)計檢測 探針用于靶基因的鑒別。本發(fā)明使用常用的微陣列引物設(shè)計軟件AlleleID6.0，按照引物和 探針的設(shè)計要求進行設(shè)計。質(zhì)控體系及每一種病原微生物中特征基因探針序列和正反向引 物序列見表1和表2。2、基因芯片制作將設(shè)計好的引物和探針進行商業(yè)性合成(如上海生物工程有限公司)。
將帶正電的尼龍膜(Roche德國)剪成2. 5cmX3. 5cm大小，于2X SSC中浸泡2min， 取出放置在濾紙上自然晾干，然后固定在玻片上備用；將合成回的濃度為ΙΟΟμΜ的表面化 學質(zhì)控探針、雜交陽性外對照探針、整個流程監(jiān)控的陽性內(nèi)對照探針、陰性對照探針、病原 微生物中各特征基因探針以及空白對照探針分別取1 μ 1，在金屬浴中95°c熱變性2min，立 即置于冰水中冰浴Imin ；每微升寡核苷酸探針加入0. 1 μ 1濃度為lmg/ml的二甲苯青做指 示劑，然后按預(yù)先設(shè)定好的陣列布局加到384孔板中；手動點樣儀(V&P Scientific, Inc. SAN DIEGO.美國)在尼龍膜上點樣；將點好的膜芯片置于紫外交聯(lián)儀(Ultra-violet Products Ltd英國)中，正面朝 上，交聯(lián)3min，使探針牢固地固定在尼龍膜上；膜放入雜交袋，封口保存。3、基因芯片檢測本發(fā)明所述的基因芯片檢測方法包括以下步驟(1)待測樣品準備(2)地高辛標 記PCR產(chǎn)物(3)預(yù)雜交和雜交⑷加入堿性磷酸酶標記的地高辛抗體(5)顯色(6)結(jié)果判
讀(1)待檢樣品準備按照DNA抽提方法對待檢樣品的核酸進行提取，將提取的DNA 稀釋或濃縮至5ng/ μ 1作為模板；按照Trizol法對待檢樣品的RNA進行提取，將以DNAasel 處理過的RNA用隨機引物反轉(zhuǎn)錄至cDNA，稀釋或濃縮至5ng/ul即可作為模板。(2)地高辛標記 PCR 擴增PCR 反應(yīng)體系10 X PCR Buffer 2. 5 μ 1, DIG PCR Mix(PCR DIG 標記混合物，Roche，德國，含 0. 7mmol/L DIG-11-dUTP, 1. 3mmol/L dTTP, 2mmol/L dATP, dCTP, dGTP) 0. 5 μ 1，rTaq 酶(5U/μ 1)0. 25 μ 1，無菌去離子水 18. 75 μ 1， 10ymol/L正反向引物各1 μ 1，模板1 μ，該反應(yīng)體系總體積25 μ L ；PCR反應(yīng)程序 940C 4min, 1 個循環(huán)；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 45s, 35 個循環(huán)；72°C IOmin, 1 個循環(huán)；4°C 保存。所得的PCR擴增產(chǎn)物用于后續(xù)雜交。(3)預(yù)雜交和雜交按照膜芯片面積的大小配制預(yù)雜交液(0. 2ml/cm2)，每Iml 預(yù)雜交液中含5XSSC 0. 5ml，50 %去離子甲酰胺0. 5ml，封閉劑(Blocking Reagent II )10mg，20% N-十二烷基肌氨酸鈉5 μ 1，10% SDS 2μ1。預(yù)雜交液在60 80°C水浴中 溶解5 lOmin，不斷晃動。將制備好的膜芯片置于雜交帶中，按比例加入合適體積的預(yù)雜 交液，封口，在42°C水浴中孵育2h進行預(yù)雜交；用相同體積的預(yù)雜交液加入DIG標記的PCR 產(chǎn)物制備樣品雜交液(0. 2ml/cm2)在42°C水浴中孵育Ih進行雜交。(4)加入堿性磷酸酶標記的地高辛抗體雜交結(jié)束后取出膜，用2XSSC/0. 1% SDS 室溫洗膜兩次，每次5min ；在42°C水浴中用3mL0. 1XSSC/0. 1% SDS洗兩次，每次15min ； 將膜放進 2mLbuffer 1(0. lmol/LTris Base，0. 15mol/LNaCl, ρΗ7· 5)中室溫洗 2min ；用 0. 3mlbufferII (ImLbuffer II 含 5mg封閉劑和 ImLbuffer I)室溫封閉 30min ；剪開雜交袋 的一角，在袋中加入1/50體積的100X堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體(1 100)，在室溫 震蕩30min ；(5)顯色將膜取出，用bufferI洗兩次，每次15min ；再用buffer 111(0. Imo 1/ LTris Base，0. Imol/LNaCI, ρΗ9· 5,0. 05mol/LMgCl2 · 6Η20)洗 2min ；膜置于袋中，封口， 再剪開一角加入顯色液(NBT-BCIP，Iml顯色液中含buffer III Iml ；NBT 4. 5ul ；BCIP 3. 5ul)，置于暗處顯色10 30min，可短暫取出觀察，勿搖晃。待樣品顯色而本底剛好不顯
16色時取出膜，在蒸餾水中浸泡30min終止顯色，自然晾干。(6)結(jié)果判讀在檢測的魚類病原微生物中，每種病原有一條以上目標基因探針 作為檢測點，一條以上探針為陽性，則判讀為陽性點；每個目標基因有三個重復檢測點，兩 個以上為陽性即判讀為陽性點。顯色結(jié)束后的芯片可根據(jù)雜交點出現(xiàn)的位置人工肉眼判 讀，若顯示藍色或藍紫色雜交點，則表示該樣品相對應(yīng)的病原檢測結(jié)果呈陽性；若不顯示任 何顏色，則表示該樣品相對應(yīng)的病原檢測結(jié)果呈陰性，即顏色作為檢測病原的定性數(shù)據(jù)。實施例2 基因芯片的效果驗證1、質(zhì)控體系中各質(zhì)控的效果驗證利用上述基因芯片檢測方法的步驟(1)待測樣品準備、(2)地高辛標記PCR產(chǎn) 物、(3)預(yù)雜交和雜交、(4)加入堿性磷酸酶標記的地高辛抗體、(5)顯色、(6)結(jié)果判讀；分 別以赤點石斑魚、鮭魚、牙鲆、大菱鲆、大黃魚、鱖魚、虹鱒、獅魚八種魚鰓的總DNA及小牛胸 腺DNA為模板，對檢測魚類多種病原的基因芯片的表面化學質(zhì)控QC1、雜交陽性外對照質(zhì)控 QC2、整個流程監(jiān)控的內(nèi)對照質(zhì)控QC3、陰性對照質(zhì)控QC4的引物及其對應(yīng)的探針進行驗證。魚類基因芯片的制備方法、魚樣品核酸的提取、RNA反轉(zhuǎn)錄、DIG標記純化和定量、 預(yù)雜交和雜交、雜交后處理、芯片結(jié)果判讀等方法與上述采用的方法基本相同。對于購自上 海生工的小牛胸腺DNA，需在5mL雙蒸水中溶解2. 5mg DNA，用一次性注射器通過小號針頭 反復吹打溶液20次，配制成500 μ g/mL的小牛胸腺DNA溶液，將該溶液稀釋成5ng/ μ 1作 為PCR反應(yīng)模板。結(jié)果表明(1)根據(jù)牛肌動蛋白的基因保守區(qū)設(shè)計的表面化學質(zhì)控QCl引物 對(對應(yīng)表1 :2、3)，只以小牛胸腺DNA溶液為模板擴增出與實驗設(shè)計大小相符的目的片 段，而與魚類宿主(赤點石斑魚、鮭魚、牙鲆、大菱鲆、大黃魚、鱖魚、虹鱒、獅魚)沒有交叉反 應(yīng)；根據(jù)牛β-肌動蛋白的基因保守區(qū)設(shè)計的表面化學質(zhì)控QCl探針(對應(yīng)表1 :1)只與小 牛胸腺DNA的PCR產(chǎn)物有特異性的雜交陽性信號。從而證實了該引物對作為魚類芯片表面 化學質(zhì)控QCl引物對的可行性。(2)根據(jù)牛HBB基因設(shè)計的雜交陽性外對照質(zhì)控QC2弓丨物(對應(yīng)表1 :6、7)，只以 小牛胸腺DNA溶液為模板擴增出與實驗設(shè)計大小相符的目的片段，而與魚類宿主(赤點石 斑魚、鮭魚、牙鲆、大菱鲆、大黃魚、鱖魚、虹鱒、獅魚)沒有交叉反應(yīng)；根據(jù)牛HBB基因設(shè)計 的雜交陽性外對照質(zhì)控QC2探針(對應(yīng)表1 :5)只與小牛胸腺DNA的PCR產(chǎn)物有特異性的 雜交陽性信號。從而證實了該對引物作為魚類芯片雜交陽性外對照質(zhì)控QC2引物對的可行 性、驗證了探針(對應(yīng)表1 :5)作為魚類芯片雜交陽性外對照質(zhì)控QC2探針的特異性。(3)利用用蝶形目、鱸形目和鮭目魚類β-actin基因的保守區(qū)設(shè)計整個流程監(jiān)控 的內(nèi)對照質(zhì)控QC3的引物PF-actin (表1 :9、10)，均能以赤點石斑魚、鮭魚、牙鲆、大菱鲆、 大黃魚、鱖魚、虹鱒、獅魚八種魚鰓的總DNA為模板，成功地擴增出與實驗設(shè)計分子量大小 相符的目的產(chǎn)物；經(jīng)DIG標記后成功地與魚類膜芯片進行雜交，結(jié)果在相應(yīng)的探針檢測點 出現(xiàn)陽性信號。從而證實了這兩對引物作為魚類芯片整個流程監(jiān)控的內(nèi)對照質(zhì)控QC3引物 對的可行性、驗證了探針(對應(yīng)表1 :8)作為魚類芯片整個流程監(jiān)控的內(nèi)對照質(zhì)控QC3探針 的特異性。(4)根據(jù)人神經(jīng)元烯醇化酶基因設(shè)計的陰性對照質(zhì)控QC4探針(表1 :4)不與上 述任何種類的PCR產(chǎn)物有雜交反應(yīng)，從而證實該探針用于作為檢測多種魚類病原的基因芯
17片的特異性。2、實際樣品檢測的效果驗證利用上述基因芯片檢測方法的步驟(1)待測樣品準備、(2)地高辛標記PCR產(chǎn)物、 ⑶預(yù)雜交和雜交、⑷加入堿性磷酸酶標記的地高辛抗體、(5)顯色、(6)結(jié)果判讀；對含 LCDV, TRBIV 的大菱鲆病料，ISKNV 核酸 DNA，RGNNV, IHNV, VHSV, IPNV、YAV, EHNV, LYCIV 的 病毒核酸進行驗證。其中，魚類基因芯片的制備方法、魚樣品核酸的提取、RNA反轉(zhuǎn)錄、DIG 標記純化和定量、預(yù)雜交和雜交、雜交后處理、芯片結(jié)果判讀等方法與上述采用的方法基本 相同。試驗的結(jié)果與分析(1)根據(jù)實驗材料，選擇設(shè)計的9對引物(對應(yīng)于表2 :2、3 ；表2 :7、8 ；表2 :12、 13 ；表 2 :24、25 ；表 2 :52、53 ；表 2 :55、56 ；表 2 :64、65 ；表 2 :70、71 ；表 2 :76、77)PCR 擴增 10 種魚類病原核酸(LCDV、EHNV, TRBIV、LYCIV、ISKNV, RGNNV, IHNV, VHSV, IPNV、YAV)靶序 列。結(jié)果9對均能特異性地擴增出相應(yīng)的目的序列，經(jīng)DIG標記后，測定產(chǎn)物產(chǎn)量約在IOng/ μ 1 40ng/y 1之間。全部種類混合或僅質(zhì)控體系和單個病原種類混合后分別與膜芯片 進行雜交。NBT-BCIP顯色結(jié)果表明質(zhì)控體系顯色正常，各種DIG標記的擴增產(chǎn)物都能與芯 片上相對應(yīng)的寡核苷酸探針發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)陽性結(jié)果。而與其他探針不發(fā)生反應(yīng)，無交叉反 應(yīng)。(2)引物對(對應(yīng)于表2 :2、3 ；表2 :7、8)是針對淋巴囊腫病毒(LCDV)和流行性 造血器官壞死癥病毒(EHNV)主要衣殼蛋白基因(MCP)設(shè)計的引物，與實驗預(yù)期相符，這兩 對引物對均擴增出了預(yù)期設(shè)計大小的DNA片段，而與其他病毒核酸的模板無擴增反應(yīng)；且 與對應(yīng)的探針(對應(yīng)于表2 :1、6)特異性地雜交出陽性信號，從而證實了上述2對引物及其 對應(yīng)的探針作為檢測魚類淋巴囊腫病毒(LCDV)和流行性造血器官壞死癥病毒基因芯片引 物及探針的可行性。(3)弓丨物對(對應(yīng)于表2 :12、13)是針對細胞腫大病毒屬設(shè)計的引物，該引物對分 別以TRBIV、LYCIV和ISKNV為模板也均能特異性的擴增出與實驗設(shè)計大小相符的DNA擴增 產(chǎn)物，而與其他病毒核酸的模板沒有交叉反應(yīng)；且與對應(yīng)的探針(對應(yīng)于表2 :11)特異性 地雜交出陽性信號，從而證實了該引物對及其對應(yīng)的探針作為檢測魚類細胞腫大病毒基因 芯片引物及探針的可行性。(4) RGNNV, IHNV、VHSV、IPNV和YAV是魚類常見的RNA病毒，針對這些病毒設(shè)計的特 異性引物對(對應(yīng)于表 2 :24、25 ；表 2 :52、53 ；表 2 :55、56 ；表 2 :64、65 ；表 2 :70、71 ；表 2 76,77)分別以各自相對應(yīng)的病毒核酸為模板均能特異性地擴增出與實驗設(shè)計大小相符的 核酸擴增帶，而與其他病毒核酸的模板無擴增反應(yīng)；且與對應(yīng)的探針(對應(yīng)于表2:23、51、 54、63、69、75)特異性地雜交出陽性信號，從而證實了該6對引物對及其對應(yīng)的探針分別作 為檢測魚類病毒RGNNV、IHNV, VHSV, IPNV和YAV基因芯片引物及探針的可行性。
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權(quán)利要求
一種檢測多種魚類病原的基因芯片，其特征在于將淋巴囊腫病毒、流行性造血器官壞死癥病毒、魚細胞腫大病毒、石斑魚虹彩病毒、病毒性神經(jīng)壞死病毒RGNNV型、病毒性神經(jīng)壞死病毒BFNNV型、病毒性神經(jīng)壞死病毒SJNNV型、病毒性神經(jīng)壞死病毒TPNNV型、病毒性神經(jīng)壞死病毒TNV型、傳染性造血器官壞死癥病毒、病毒性出血敗血癥病毒、傳染性胰臟壞死病病毒、獅魚病毒性腹水病毒和傳染性鮭魚貧血病毒的探針；淀粉卵渦邊蟲和三代蟲的探針以及魚立克次氏體的探針點在基因芯片載體上，各探針的序列信息如下
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測多種魚類病原的基因芯片，其特征在于上述的基因芯 片載體上還點制有表面化學質(zhì)控的探針、陰性對照質(zhì)控的探針、雜交陽性外對照質(zhì)控探針 和整個流程監(jiān)控的陽性內(nèi)對照質(zhì)控的探針；探針的序列信息如下
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種檢測多種魚類病原的基因芯片，其特征在于上述的基 因芯片載體為固相載體尼龍膜。
4.權(quán)利要求書1或2所述的一種檢測多種魚類病原的基因芯片的檢測方法，依次包 括以下步驟(1)待檢樣品準備、⑵地高辛標記的PCR擴增、(3)預(yù)雜交和雜交、⑷加入 堿性磷酸酶標記的地高辛抗體、(5)顯色、(6)結(jié)果判讀步驟，其特征在于步驟(2)中的地 高辛標記的PCR擴增體系是無菌去離子水17. 25 μ L，10XPCR buffer 2. 5yL，20mM的 MgCl2 1. 5 μ L，PCR地高辛標記混合物0.5 μ L，各探針對應(yīng)的10 μ M正向引物和10 μ M反向 引物各1 μ L, 5unit/ μ L的rTaq DNA聚合酶0. 25 μ L，待檢樣品DNA 1 μ L，該反應(yīng)體系總體 積 25 μ L ；PCR 擴增程序94°C 4min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 40s, 35 個循環(huán)；72°C延伸 10min，4°C保溫，其中各正向引物和反向引物的序列信息如下
5.如權(quán)利要求4所述的一種檢測多種魚類病原的基因芯片的檢測方法，其特征在于上 述淋巴囊腫病毒IXDV、流行性造血器官壞死癥病毒EHNV、魚細胞腫大病毒、石斑魚虹彩病 毒GIV、病毒性神經(jīng)壞死病毒TNV型病原的正向引物和反向引物存在替補引物，替補引物的 序列信息如下
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測多種魚類病原的基因芯片及其檢測方法。基因芯片的構(gòu)建是將質(zhì)控系統(tǒng)的探針和17種魚類病原的探針點在同一固相載體尼龍膜上制成。17種魚類病原的探針包括用于檢測14種病毒的探針，用于檢測淀粉卵渦邊蟲和三代蟲的探針以及用于檢測魚立克次氏體的探針。本發(fā)明的基因芯片的檢測是應(yīng)用地高辛雜交顯色方法，根據(jù)雜交點是否出現(xiàn)藍色或藍紫色來進行信號判斷。本發(fā)明基因芯片上質(zhì)控體系的構(gòu)建保證了檢測的特異性和靈敏性，并且可在同一尼龍膜上對多種魚類病原微生物進行同時檢測，具有高通量的特點，可以替代之前的魚類病原微生物相關(guān)檢測方法，是現(xiàn)有魚類病原微生物鑒定技術(shù)的突破。
文檔編號C12N15/11GK101906486SQ201010243398
公開日2010年12月8日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月3日
發(fā)明者劉葒, 劉莉, 史成銀, 宋曉玲, 張慶利, 楊冰, 江育林, 秦啟偉, 繩秀珍, 荊曉艷, 陳新華, 黃倢 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所;國家海洋局第三海洋研究所;深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心;中山大學;中國海洋大學