專利名稱：一種檢測己烯雌酚的方法及其專用化學發(fā)光免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測己烯雌酚的方法及其專用化學發(fā)光免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
目前動物性食品安全已成為全世界關(guān)注的焦點，其中獸藥殘留問題是影響動物 性食品安全的最主要因素之一，由于動物樣本成分復雜，待測物濃度較低，而且大多數(shù)取 樣量很少，這就對分析方法的選擇性和靈敏度提出了更高的要求?；瘜W發(fā)光免疫分析 (Chemiluminescence analysis,CL1A)技術(shù)將高靈敏的化學發(fā)光技術(shù)與高特異性的免疫反 應結(jié)合起來，具有靈敏度高、特異性強、線性范圍寬、操作簡便、不需要十分昂貴的儀器設(shè)備 等特點。CLIA不需要外來光源，具有比熒光免疫分析更高的信噪比，比常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸附 檢測方法的抗背景干擾能力強，其靈敏度比ELISA高1至2個數(shù)量級，檢測范圍可達6個數(shù) 量級，自動化程度高，提高了分析方法的精密度，CLIA已經(jīng)成為一種先進的痕量或超痕量物 質(zhì)的檢測技術(shù)。CLIA在獸醫(yī)學、醫(yī)學、食品分析等方面將會有更廣闊的應用前景。己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)是一種人工合成的雌激素，因其能促進蛋 白合成，加快增重和骨骼鈣化，并減少飼料消耗，被作為動物促生長劑應用于畜禽生產(chǎn)和水 產(chǎn)養(yǎng)殖等方面。但許多科學試驗證實了己烯雌酚是一種致癌物質(zhì)，并具有以生殖毒性為主 的嚴重毒副作用對人和動物的健康危害較大，現(xiàn)在歐美、中國等許多國家已禁止將其用于 動物飼料中，但在畜牧生產(chǎn)上的常有非法應用的情況，導致其在畜禽產(chǎn)品中殘留，危害公眾 健康。目前，動物組織中己烯雌酚殘留的檢測方法主要采用氣相色譜法、液相色譜法、氣相 色譜_質(zhì)譜法、液相色譜_聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測己烯雌酚的方法及其專用化學發(fā)光免疫試劑
品.ο本發(fā)明所提供的檢測己烯雌酚的化學發(fā)光免疫試劑盒，包括己烯雌酚特異性抗 體、包被原和標準品溶液；所述包被原為己烯雌酚半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)式如 式I所示
權(quán)利要求
一種檢測己烯雌酚的化學發(fā)光免疫試劑盒，包括己烯雌酚特異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為己烯雌酚半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)式如式I所示FSA00000216119500011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括發(fā)光 液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液、包被緩沖液、封閉液和酶標抗抗體；所述試劑盒由己烯雌酚特異性抗體、包被原、標準品溶液、發(fā)光液、濃縮洗滌液、濃縮復 溶液、包被緩沖液、封閉液和酶標抗抗體組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化學發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述己烯雌酚特異性抗體為己烯雌酚單克隆抗體或己烯雌酚多克隆抗體； 所述己烯雌酚單克隆抗體是由保藏號為CGMCC No. 3775的對己烯雌酚的單克隆雜交瘤 細胞株DES分泌的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的化學發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述標準品溶液 中標準品的濃度為ο μ g/L、0. 5 μ g/L、1 μ g/L、5 μ g/L、10 μ g/L或50 μ g/L，所述標準品為 己烯雌酚；所述發(fā)光液由C液和D液組成，發(fā)光液C液為過氧化氫；發(fā)光液D液為魯米諾溶液； 所述濃縮洗滌液是將0. 05g疊氮鈉防腐劑和IOOmL濃度為0. 02M、pH為7. 4的磷酸鹽 緩沖液混合得到溶液；所述濃縮復溶液是將0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 05mol/L、pH為7. 4的磷酸 鹽緩沖液混合得到的溶液；所述包被緩沖液是PH值為9. 6的濃度為0. 03mol/L的碳酸鹽緩沖液； 所述封閉液是將0. Olg疊氮化鈉、IOg牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 03mol/L、pH值 為7. 4磷酸鹽溶液混合得到的溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的化學發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述包被原是按照如下方法制備得到的a、將每18mg己烯雌酚半抗原、2. 5mL 二甲基 甲酰胺、15 μ L三正丁胺和9 μ L氯甲酸異丁酯混合反應30min，得到的產(chǎn)物溶液稱為A液； 將每15mg載體蛋白溶于ImL 50%的二甲基甲酰胺水溶液(體積百分含量)中，調(diào)節(jié)pH至 9，得到的產(chǎn)物溶液稱為B液；b、將A液加入到B液，4V反應4h后，再經(jīng)過透析得到包被原； 所述己烯雌酚半抗原的結(jié)構(gòu)式如式II所示
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的化學發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述己烯雌酚半抗原是按照如下方法制備得到的I、先將每IlOmg己烯雌酚、200mg無水碳酸鈉、50 μ L 4-溴丁酸乙酯和5mL丙酮混合得 到混合物，II、將步驟I得到的混合物進行60°C回流提取4h，抽干反應液，得到殘留物，III、 再將步驟II得到的殘留物溶解于5mL甲醇-氫氧化鉀混合液后進行80°C回流提取lh，抽 干反應液，再次得到殘留物，IV、向步驟III得到的殘留物中加入SmL水得到混合液，調(diào)節(jié) PH為3，離心收集沉淀；V、向步驟IV的沉淀加入5mL氯仿抽提，將有機相用硫酸鈉干燥得到 殘留物；VI、將步驟V得到的殘留物溶于沸氯仿，再加入石油醚重結(jié)晶，干燥后得到的產(chǎn)物 即為己烯雌酚半抗原；所述甲醇-氫氧化鉀液為將88mg氫氧化鉀溶解于5mL甲醇得到的溶 液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的化學發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述載體蛋白為鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白，優(yōu)選為卵清蛋白；所述酶標記抗抗體為酶標記羊抗鼠抗抗體。
8.一種檢測己烯雌酚的方法，包括以下步驟1)樣品前處理將每2g動物組織勻漿與IOmL乙腈-丙酮溶液混勻lmin，以3000g轉(zhuǎn)速離心5min，取 上清液；將每2mL所述上清液用氮氣干燥，再加入ImL復溶液溶解，再向其中加入ImL正己 烷混合，3000g離心5min，取下層溶液稀釋5倍即為待測樣本溶液；所述乙腈_丙酮溶液為 將乙腈和丙酮按體積比為80 20混合獲得；所述動物組織為豬肉或雞肉；所述復溶液為 將所述濃縮復溶液用0. 05mol/L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液稀釋10倍得到的；2)利用權(quán)利要求1-7中任一所述的檢測己烯雌酚的化學發(fā)光免疫試劑盒檢測步驟1) 中的樣本溶液。
9.由保藏號為CGMCCNo. 3775的對己烯雌酚的單克隆雜交瘤細胞株DES分泌的己烯雌 酚單克隆抗體。
10.保藏號為CGMCCNo. 3775的對己烯雌酚的單克隆雜交瘤細胞株DES。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測己烯雌酚的方法及其專用化學發(fā)光免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測己烯雌酚的化學發(fā)光免疫試劑盒，包括己烯雌酚特異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為己烯雌酚半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)式如式I所示。本發(fā)明的檢測方法，具有樣品前處理過程簡單、操作簡便、費用低廉、特異性高、靈敏度高、精確度高等特點，能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。
文檔編號C12N5/20GK101936985SQ20101024428
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月3日
發(fā)明者史為民, 吳聰明, 張素霞, 曹興元, 湯樹生, 沈建忠, 王戰(zhàn)輝, 程林麗 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學