專利名稱:一種免疫毒素及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域,具體的說,涉及一種免疫毒素,以及含有這種免疫毒素的 載體、轉(zhuǎn)化的菌株和用途。
背景技術(shù):
器官移植是20世紀(jì)醫(yī)學(xué)的重大成就之一,是多種臟器終末性疾病目前唯一的治 療手段。僅我國每年新增的肝、腎及心臟功能衰竭患者就達(dá)數(shù)百萬,其中大部分可通過器官 移植延長(zhǎng)生命。從供體器官來源來分,器官移植可分為同種同基因移植(如自體移植、孿生 子之間的移植)、同種異基因移植、以及異種移植。目前絕大多數(shù)臟器移植均為同種異基因 移植。由于人體主要組織相容抗原(MHC抗原)的高度多樣性,不可避免地造成供體臟器抗 原與受體免疫系統(tǒng)不相容,手術(shù)后產(chǎn)生嚴(yán)重排斥反應(yīng)。急性排斥反應(yīng)是最常見的一種移植排斥反應(yīng),屬于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的細(xì)胞免疫現(xiàn) 象,是移植物的HLA抗原刺激受者T淋巴細(xì)胞使之分化增殖,產(chǎn)生大量具有特異性的致敏淋 巴細(xì)胞,可直接殺傷或通過釋放各種淋巴因子殺傷靶細(xì)胞,排斥移植物?,F(xiàn)認(rèn)為體液免疫也 參與急性排斥反應(yīng)。組織病理學(xué)改變?yōu)檠軆?nèi)膜損傷和纖維素樣壞死伴單核細(xì)胞浸潤(rùn)。急 性排斥反應(yīng)經(jīng)過及時(shí)正確的處理,80-90%能被逆轉(zhuǎn)。T淋巴細(xì)胞是特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)最重要的功能細(xì)胞,在免疫識(shí)別、免疫反應(yīng)啟 動(dòng)、效應(yīng)階段,以及免疫調(diào)節(jié)的過程中,無不起著重要的作用。器官移植排斥反應(yīng)基本上屬 于特異性免疫應(yīng)答反應(yīng),移植免疫學(xué)研究表明,T細(xì)胞是急性移植排斥的主要效應(yīng)細(xì)胞。環(huán) 孢霉素A、0KT3等現(xiàn)代免疫移植劑及通過廣泛作用于T細(xì)胞而發(fā)揮抗移植排斥作用。但是, 由于這些藥物作用不具有特異性,因而增加了感染和惡性腫瘤發(fā)生的幾率,在一定程度上 抵消了移植的治療效果。雖然免疫耐受是移植研究的終極目標(biāo),但是開發(fā)特異性作用于活 化T細(xì)胞的免疫抑制劑成為移植研究的更現(xiàn)實(shí)目標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),IL-2是免疫系統(tǒng)中重要的信號(hào)分子,其受體表達(dá)是同種抗原反應(yīng)性T 細(xì)胞活化的關(guān)鍵步驟。⑶25是IL-2受體的alpha鏈。一般情況下,靜止T細(xì)胞和B細(xì)胞不 表達(dá)⑶25。但是在發(fā)生排斥的病人,外周血T細(xì)胞和移植物局部浸潤(rùn)T細(xì)胞表達(dá)⑶25明 顯增加,排斥前和排斥過程中活化的T細(xì)胞分泌的游離的IL-2Ra在血清中增加;而且,抗 ⑶25抗體體外可以抑制MHC不匹配淋巴細(xì)胞的混合反應(yīng)及CTL產(chǎn)生。⑶25抗體能夠干擾 IL-2結(jié)合到其高親和受體上,有效地與IL-2競(jìng)爭(zhēng),抑制IL-2啟動(dòng)的T細(xì)胞增殖反應(yīng),從而 選擇性地抑制了免疫應(yīng)答,防止了同種異體排斥反應(yīng)。因此,CD25抗體是一種可用于預(yù)防 器官移植排斥反應(yīng)的抗體。然而,單獨(dú)使用單抗的治療效果并不理想,人們很快開發(fā)出了以單抗或細(xì)胞因子 為導(dǎo)向部分,與經(jīng)修飾的毒蛋白相連,對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷作用的免疫毒素。第一代免疫毒素是通過化學(xué)偶聯(lián),以二硫鍵將完整的單抗與經(jīng)過修飾的毒蛋白相連而合成。經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)的 免疫毒素需要單獨(dú)制備抗體和毒素,異源性高,毒性強(qiáng),并且分子量很大( 200kDa),導(dǎo)致 其穿透實(shí)體腫瘤的能力很差,從而大大影響了其在腫瘤治療中的應(yīng)用。第二代的免疫毒素 是由完整的單抗與經(jīng)修飾的或不完整的毒素組成。由于毒素蛋白經(jīng)修飾毒性降低,動(dòng)物較 容易耐受,但缺陷依然存在。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,重組免疫毒素應(yīng)用而生,利用DNA 重組技術(shù),將異源的scFv基因與經(jīng)削減的毒素基因融合并克隆到合適的載體上,在大腸桿 菌中翻譯出單鏈嵌合蛋白,因此又稱為基因工程免疫毒素。將免疫毒素克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá) 載體中,在大腸桿菌中得到高效轉(zhuǎn)錄和翻譯,而且表達(dá)周期短,具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、易 于控制和大規(guī)模生產(chǎn)的特點(diǎn)??贵w攜帶毒素導(dǎo)向具有特異抗原的腫瘤組織,與靶細(xì)胞上的 抗原結(jié)合,毒素內(nèi)化,催化性地使核糖體失活,抑制蛋白合成,殺死細(xì)胞。因此,本領(lǐng)域仍需 要提供一種高效低毒的免疫毒素。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種分離的多肽,包含抗人單克隆抗體 ⑶25的單鏈抗體ScFv,以及與所述單鏈抗體ScFv偶聯(lián)的免疫毒素PE38KDEL,以彌補(bǔ)現(xiàn)有技 術(shù)的不足。本發(fā)明需要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種編碼上述多肽的DNA分子。本發(fā)明需要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種表達(dá)上述DNA分子的載體。本發(fā)明需要解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供一種被上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明需要解決的第五個(gè)技術(shù)問題是提供一種預(yù)防和/或治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病 的藥物組合物。本發(fā)明需要解決的第六個(gè)技術(shù)問題是提供一種多肽在制備預(yù)防和/或治療T細(xì)胞 介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明第一方面提供了一種分離的多肽,該多肽包含抗人單克隆抗體CD25的單 鏈抗體ScFv,以及與所述單鏈抗體ScFv偶聯(lián)的免疫毒素PE38KDEL,所述單鏈抗體ScFv具 有重鏈可變區(qū)-接頭-輕鏈可變區(qū)的結(jié)構(gòu),其中所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :1所示的氨 基酸序列,所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列;所述免疫毒素PE38KDEL 具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。單克隆抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法來制得。例如,單克隆抗體可 用雜交瘤方法(由Kohler等,Nature, 256 =495(1975)首先提出)制得,或用重組DNA方 法(美國專利No. 4,816,567)制得。單克隆抗體也可用例如Clackson等,Nature, 352 624-628(1991)和 Marks 等,J. Mol. Biol.,222 :581_597 (1991)所述的技術(shù)從噬菌體抗體庫 中分離獲得。本發(fā)明所用的術(shù)語“單鏈Fv”或〃 ScFv"或“sFv”抗體包括抗體的VH和VL區(qū), 其中這些區(qū)在一條多肽鏈中。通常,F(xiàn)v多肽還包括VH和VL區(qū)間的多肽接頭,該接頭可 使ScFv形成結(jié)合抗原所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于ScFv綜述可見Pluckthim在《單克隆抗體藥理 學(xué)》(The Pharmacology of Monoclonal antibodies), 113 卷,Rosenburg 禾口 Moore 編輯, Springer-Verlag, New York,269—315 頁(1994)。
本發(fā)明中的綠膿桿菌外毒素(PE),是66KD的單鏈蛋白,氨基末端構(gòu)成Ia區(qū),為細(xì) 胞結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)域,Ib (365-404),是介于II與III區(qū)之間的小分子,功能不清楚,但去除后不 影響毒素的活性。第253-364氨基酸組成II區(qū),負(fù)責(zé)毒素的轉(zhuǎn)位。III區(qū),405-613,具有 ADP核糖基化活性。PE及衍生物到達(dá)細(xì)胞,在受體或抗體受體介導(dǎo)下內(nèi)吞,在胞內(nèi)蛋白水解 酶的作用下I、II區(qū)被去除,III區(qū)轉(zhuǎn)移入內(nèi)質(zhì)網(wǎng),再轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)。將PE的I區(qū)去除,再將 PE分子的羧基REDLK突變?yōu)镵DEL,即PE38KDEL,其細(xì)胞毒生物學(xué)活性可提高6_10倍。本發(fā)明提供了一種多肽,該多肽是由單鏈抗體ScFv和免疫毒素PE38KDEL通過共 價(jià)鍵或接頭來連接。它們的前后次序或位置可以互換。本發(fā)明還提供了編碼上述多肽的DNA分子,含有該DNA分子以及與所述序列操作 性相連的表達(dá)調(diào)控序列的表達(dá)載體,以及被所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明另一方面還提供了制備上述多肽的方法,該方法包括a)提供表達(dá)載體, 該表達(dá)載體含有上述DNA分子序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列;b)用步驟a) 所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞;c)在適合所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主 細(xì)胞;和d)分離純化獲得所述多肽。本發(fā)明的多肽可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)手段來獲得。首先,可根據(jù)本發(fā)明提 供的序列信息用化學(xué)合成或PCR等常規(guī)獲得上述DNA分子。然后,用本領(lǐng)域熟知的各種方法 通過選擇合適的酶切位點(diǎn)將該DNA分子插入表達(dá)載體中使其與表達(dá)調(diào)控序列操作性相連。 “表達(dá)調(diào)控序列”通常指參與控制核苷酸序列表達(dá)的序列,其包括與目標(biāo)核苷酸序列操作性 相連的啟動(dòng)子和終止信號(hào),通常還包括核苷酸序列適當(dāng)翻譯所需的序列?!安僮餍韵噙B”是 指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。本發(fā)明中所用的表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種市售的表達(dá)載體。隨后, 用上述獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞?!八拗骷?xì)胞” 一般包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。 常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì) 胞,昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是許多可購得的無限增殖細(xì)胞系。這 些無限增殖細(xì)胞系包括但不局限于,中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、Vero細(xì)胞、海拉細(xì)胞、幼倉 鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如H印G2)和其它許多細(xì)胞系。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法有很多種,所用的轉(zhuǎn)化程序取決于待轉(zhuǎn)化的宿 主。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域所知的,其包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 染、磷酸鈣沉淀、Polybrene (1,5- 二甲基-1,5- 二氮i^一亞甲基聚甲溴化物)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原 生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染以及將DNA直接顯微注射到胞核中。然后,在適合多肽表達(dá)的條件下,培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞。然后用常規(guī)的免疫球 蛋白純化步驟,如蛋白A-S印harose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水 層析、分子篩層析或親和層析等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明 的多肽。本發(fā)明另一方面還提供了一種預(yù)防和/或治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的藥物組合物, 該組合物藥學(xué)上有效量的上述多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。在較佳的實(shí)施方案中,該藥 物組合物中還可含有與本發(fā)明的多肽聯(lián)用的其它化療藥物和放療藥物。本文所用的術(shù)語 “藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)分子本體和組合物適當(dāng)?shù)亟o予動(dòng)物或人時(shí),它們不會(huì)產(chǎn)生不利 的、過敏的或其它不良反應(yīng)。本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明的多肽相容,即能與其共混而不會(huì)在通常情況下大幅度降低單克隆抗體或藥物組合物的藥效??勺鳛樗?學(xué)上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉, 如玉米淀粉和土豆淀粉;纖維素及其衍生物,如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維 素;西黃蓍膠粉末;麥芽;明膠;滑石;固體潤(rùn)滑劑,如硬脂酸和硬脂酸鎂;硫酸鈣;植物油, 如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘 露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化劑,如Tween ;潤(rùn)濕劑,如月桂基硫酸鈉;著色劑;調(diào)味劑; 壓片劑、穩(wěn)定劑;抗氧化劑;防腐劑;無熱原水;等滲鹽溶液;和磷酸鹽緩沖液等。本發(fā)明的藥物組合物可用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病,包括移植排斥,移植物抗機(jī) 體或機(jī)體抗移植物。
圖1 :CD25(sFv)引物設(shè)計(jì)圖,CD25-1、_2、_3、_4 引物擴(kuò)增 ScFv ;圖 2 :PE38KDEL 引物設(shè)計(jì)圖,PE38-1、_2、_3、_4 引物擴(kuò)增 PE38KDEL ;圖 3 :CD25-PE38KDEL 引物設(shè)計(jì)圖,用引物 CD25-1、PE38-4over_lapping PCR 擴(kuò)增 CD25-PE38KDEL ;圖4 重組表達(dá)載體構(gòu)建圖。圖5 :CD25-PE38KDEL免疫毒素對(duì)HUT-102細(xì)胞的殺傷活性結(jié)果。圖6 ⑶25-PE38KDEL免疫毒素對(duì)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用結(jié)果。圖7 :CD25-PE38KDEL治療組與PBS對(duì)照組分別清除CD25+T細(xì)胞的對(duì)比結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解,列舉這些實(shí)施例只 是為了起說明作用,而并不是用來限制本發(fā)明。實(shí)施例1⑶25單鏈抗體及其免疫毒素基因的克隆1.實(shí)驗(yàn)材料1. 1 菌株大腸桿菌 TGl 和 BL21 (DE3)。1. 2序列抗CD25單抗的重鏈和輕鏈,按照文獻(xiàn)Design of humanizedantibodies :from anti-Tac to Zenapax. Methods. 2005May ;36(1) :69_83 艮 的序列合成。1. 3工具酶及試劑盒限制性內(nèi)切酶購自Promega公司。Taq DNApolymerase購自 上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司和華舜公司,DNA回收試劑 盒購自華舜公司,PCR擴(kuò)增試劑盒購自生工公司。pGEM-T vector購自美國Promega公司。1. 4DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bpMarker為華美公司產(chǎn)品。1. 5PCR引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1. 6細(xì)菌培養(yǎng)試劑胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉為英國0X0ID公司產(chǎn)品。1. 7主要實(shí)驗(yàn)儀器PCR 儀德國 Mastercycler gradient, Nethller-HinZ GmbH 產(chǎn)品;復(fù)日 FR-980 生 物電泳圖像分析系統(tǒng)上海復(fù)日生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)研制所產(chǎn)品;UV-2401PC紫外分光光度計(jì)(上 海分析儀器總廠,UV755B型);_80°C低溫冰箱美國REVCO, Asheville, N, C產(chǎn)品;細(xì)菌培
6養(yǎng)搖床上海離心機(jī)械研究所產(chǎn)品2.實(shí)驗(yàn)方法2. 1引物設(shè)計(jì)選擇抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的適當(dāng)位置,分別設(shè)計(jì)4條特異性引 物,用來克隆單鏈抗體和免疫毒素的抗體部分;選擇PE40毒素的適當(dāng)位置分別設(shè)計(jì)4條引 物,用來克隆PE38KDEL毒素和免疫毒素的毒素部分。引物序列如下
引物
CD25引物 輕鏈引物
1:5’ ACGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCACCCTGT(SEQ ID NO 5) 2 5‘ACCAGAGCCACCACCGCCAGAGCCACCACCACCTTTGACCTCCACCTT (SEQ ID NO 6)重鏈
3:5’ -TCTGGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGTGGTTCTCAGGTGCAGCTG(SEQ ID NO 7) 4:5’ -CAGCGCGGCCAGGCTGCCGCC AGAGGAGACGGTGACCAGGGT(SEQ ID NO 8) PE38引物
1:5’ -CCCTGGTCACCGTCTCCTCTGGCGGCAGCCTGGCCGC GCT G_3’ (SEQ ID NO 9)
2:5’ -GTCGCCGCTGTCCGCCGGGCCGTTGGCCGCGCCGGCCTC-3,(SEQ ID NO 10) 3:5’ -GAGGCCGGCGCGGCCAACGGCCCGGCGGACAGCGGCGAC-3,(SEQ ID NO 11) 4 :5’ -GTCGCCGCTGTCCGCCGGGCCGTTGGCCGCGCCGGCCTC-3,(SEQ ID NO 12) 引物所處的位置如圖1、2和3所示。
2.2重疊PCR PCR均采用熱啟動(dòng),⑶25重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的擴(kuò)增條件是 940C 5min,94°C lmin,58°C lmin,72°C lmin,72°C 5min,30 個(gè)循環(huán)。PE 毒素序列中由于 GC 含量高達(dá)70%以上,用普通的PCR很難擴(kuò)增,因此選用Takara公司專門用來擴(kuò)增GC含量高 的 DNA 聚合酶,其 PCR 條件是 94°C lmin,94°C 30s, 60°C 50s, 72°C lmin,72°C 5min,30 個(gè)循環(huán)。2.3質(zhì)粒的構(gòu)建2. 3. 1連接反應(yīng)1)分別取適量以DNA回收試劑盒回收DNA片段、經(jīng)匹配末端限制 性內(nèi)切酶線性化的載體DNA(兩者末端濃度比為1 1-1 2) ;2)加連接緩沖液1.0 μ 1、 T4DNA連接酶1 μ 1,加水至10 μ 1 ;3) 16°C連接過夜;4)鋪板,形成具有相應(yīng)抗生素抗性的
單克??;2. 3. 2感受態(tài)細(xì)菌的制備1)挑取單一菌落于5ml液體LB培養(yǎng)基,37°C振蕩培養(yǎng) 過夜,制備過夜菌;2)按1 100將過夜菌接種到LB液體培養(yǎng)基,37°C振蕩培養(yǎng)約3h,OD值 為0. 3-0. 6時(shí)停止培養(yǎng);3)菌液加入1. 5ml Ependorf管,1. 5ml/管,離心,lkrpm, Imin,沉 淀細(xì)菌,棄上清;4)加入冰預(yù)冷的IOOmM CaCl2溶液,200μ 1/管,冰浴30min ;5)離心沉淀 細(xì)菌,lkrpm, Imin,棄上清,加入冰預(yù)冷的IOOmM CaCl2溶液,100 μ 1/管;6)冰浴Ih以上, 備用。2. 3. 3轉(zhuǎn)化1)取一個(gè)Ependorf管,加入DNA連接物2 μ 1、感受態(tài)細(xì)菌100μ 1,冰 浴Ih ;2)42°C熱休克3min,冰浴2min ;3)加液體LB培養(yǎng)基200 μ 1,37°C振蕩培養(yǎng)45min ;4) 取100 μ 1涂布于含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基,晾干;5) 37°C倒置培養(yǎng)過夜;2. 3. 4重組質(zhì)粒的提取1)挑取數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)化的單菌落,每個(gè)菌落分別接種于5ml含 50 μ g/ml的抗生素LB液體培養(yǎng)基,37°C振蕩培養(yǎng)過夜;2)離心收獲細(xì)菌,IOkrpm, Imin ;3)質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒;4)電泳檢測(cè)質(zhì)粒質(zhì)量,測(cè)0D260/0D280決定質(zhì)粒含量。2. 3. 5重組質(zhì)粒的酶切鑒定1)取Ependorf管,依次加入約5 μ 1 IOX酶切緩沖 液、2yg質(zhì)粒、Ιμ 酶1、1μ1酶2,以滅菌去離子水補(bǔ)充至50 μ 1 ;2)置37°C,lh;3)瓊脂 糖凝膠電泳檢測(cè);3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3. IDNA 的擴(kuò)增采用常規(guī)PCR技術(shù)順利擴(kuò)增了 CD25的單鏈抗體及用來構(gòu)建免疫毒素的抗體部分。 PCR擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期吻合。同時(shí)擴(kuò)增PE38序列。擴(kuò)增序列大小與預(yù)期吻合。將上述PCR 產(chǎn)物膠回收,取CD25-l-linker和linker_PE38KDEL膠回收產(chǎn)物進(jìn)行重疊(over-lapping) PCR。3. 2序列測(cè)定和分析將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEM -T載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl,用藍(lán)白斑篩選陽 性克隆測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的克隆保存,用于表達(dá)載體的構(gòu)建。另外,CD25重鏈可變區(qū) 序列顯示在SEQ ID NO :1中,CD25輕鏈可變區(qū)序列顯示在SEQ IDNO 2中,PE38KDEL毒素 序列顯示在SEQ ID NO :3中。單鏈抗體(ScFv)基因結(jié)構(gòu)是由抗體基因的VH和VL通過非共價(jià)鍵或二硫鍵連接 而成,保留原有的抗原結(jié)合能力[King DJ 等.Biochem J,1993,290 (Pt3) =723-728 ;Huston JS 等.Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85 :5879_5884],鼠源性抗體的 VH 和 VL 的基因分 別是由4個(gè)相對(duì)保守的骨架區(qū)(FR)和3個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)組成,CDR區(qū)編碼的氨 基酸相互作用共同構(gòu)成抗原結(jié)合位點(diǎn),也決定了每種抗體的特異性。FR區(qū)呈β片層排 列,堿基組成和排列順序比較穩(wěn)定,因此可以根據(jù)FRl和FR4的堿基組成和排列順序擴(kuò)增 VH和VL基因的寡核苷酸引物,用編碼易折疊的寡核苷酸接頭將二者連接成VH-Iinker-VL 即 ScFv [ColcherD 等.Ann N Y Acid Sci, 1999,880 263-280 ;Zu Putlitz J 等· Biochem BiophysRes Commun, 1999, 24 (255) :785_791],將此基因克隆入原核或真核表達(dá)載體中并 在原核或真核細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá),其產(chǎn)物即為ScFv。通用的連接肽有很多,連接肽必須能使 輕、重鏈可變區(qū)自由折疊,使抗原結(jié)合位點(diǎn)處于適當(dāng)?shù)臉?gòu)型。同時(shí)Linker盡可能減少蛋白 酶的攻擊,并防止單鏈抗體的聚集。Linker長(zhǎng)度以14-25個(gè)氨基酸殘基為適,目前最常用 的連接肽是由Huston根據(jù)X線晶體衍射分析抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)和計(jì)算機(jī)輔助分析結(jié)果設(shè)計(jì) 的具有剛性結(jié)構(gòu)的 15肽序列(G4S) 3 [Mansfield E 等.Blood,1997,90 (5) =2020-2027], Glockshuber等單鏈抗體在大腸桿菌中表達(dá),并能自發(fā)折疊成天然構(gòu)象,而其抗原的親和力 幾乎和原來的完整抗體一樣,其穩(wěn)定性比通過二硫鍵相連的Fv片段提高近60倍。ScFv的 研究為進(jìn)一步制備鼠_人嵌合基因工程抗體和人源化重構(gòu)抗體奠定了基礎(chǔ)。將ScFv與毒 素連接構(gòu)成融合蛋白的研究意義重大,是近幾年研究的熱門課題。由于ScFv分子量小,免疫原性小,特異性強(qiáng),親和力較高,組織穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn) [Niv R等.Int J Cancer,2001,94 :864-872],在其基因3,端接上與毒素、酶、細(xì)胞因子,構(gòu) 成重組免疫毒素,可以作為良好的導(dǎo)彈,對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用[Van der Poel HG等.J Urol, 2002,168 :266_272 ;Matsumoto H等.Anticancer Res, 2002, 22 :2001_2007]。對(duì)于一 個(gè)特定的scFv,其穩(wěn)定性主要是由VH-VL間相互作用的性質(zhì)和強(qiáng)度以及連接肽的類型決定 的。柔性的連接肽使各個(gè)scFv中的VL和VH與附近抗體分子的VH和VL或其它的粘性表面之間不斷的結(jié)合和解離,因而易于發(fā)生聚合和沉淀等現(xiàn)象[Reiter Y等ProteinEng. 1995, 12 1323-1331]。制備免疫毒素的抗體最好屬于IgG類,因?yàn)镮gM類抗體難于毒素偶聯(lián),偶 聯(lián)后的免疫毒素產(chǎn)量和活性均低。⑶25的抗原是理想的靶點(diǎn),因此將抗⑶25抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過 連接肽(G4S) 3連接起來,構(gòu)建⑶25的單鏈抗體,然后又用連接肽將⑶25的單鏈抗體與 PE38KDEL毒素連接,構(gòu)建天然的新的免疫毒素CD25-PE38KDEL,為下一步研究腫瘤的靶向
治療奠定基礎(chǔ)。發(fā)明人采用常見的over-lapPCR技術(shù)將兩個(gè)DNA片段連在一起。由于PE38KDEL DNA中GC含量很高,這給PCR擴(kuò)增帶來很大困難,用常用的DNA聚合酶和PCR常規(guī)條件很難 擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的片段,于是選用專門用來擴(kuò)增GC含量高的DNA序列的DNA聚合酶,成功地?cái)U(kuò) 增了 PE38KDEL和CD25-PE38KDEL。DNA基因重組技術(shù)的使用,使制備單鏈抗體和單鏈抗體 免疫毒素在二周內(nèi)即可實(shí)現(xiàn),大大縮短了導(dǎo)向藥物的制備時(shí)間,成本較低,操作方便,改善 培養(yǎng)條件,大腸桿菌能表達(dá)并裝配和折疊具有高生物活性的免疫毒素。實(shí)施例2 免疫毒素CD25-PE38KDEL的表達(dá)純化免疫毒素原核表達(dá)載體構(gòu)建成功后,轉(zhuǎn)化BL21,挑選高表達(dá)陽性克隆,原核表達(dá), 收集細(xì)菌,用His-Ni++和分子篩純化,用蛋白電泳和Iowry酚法鑒定純化效果。1.實(shí)驗(yàn)材料1. 1 菌株大腸桿菌 TGl 和 BL21 (DE3)。1. 2細(xì)菌培養(yǎng)試劑LB培養(yǎng)基氯化鈉、胰蛋白胨、酵母提取物購自英國OXOID公
司ο1. 3IPTG購自上海華舜生物有限公司。1. 4Chelating sepharose Fast Flow and Superdex75resin 購 自 AmershamPharmacia Biotech(USA)01. 5主要儀器設(shè)備AKTA FPLC (Amersham pharmacia biotech) ;Vertical electrophoresissystem(Pharmacia Hoefer Biotech Inc,San Francisco CA,U. S. A,mini VE 型)Electrophoresis Power Supply (amersham Pharmacia biotech, EPS601 型);Mini Trans-Blot Cell (BI0-RAD 公司);UV-2401PC 紫外分光光度計(jì)(SHIMADZU)2.實(shí)驗(yàn)方法2. 1免疫毒素CD25-PE38KDEL的誘導(dǎo)表達(dá)當(dāng)發(fā)明人成功構(gòu)建了免疫毒素⑶25-PE38KDEL的原核表達(dá)載體后,轉(zhuǎn)化大腸桿 菌BL21,在LB培養(yǎng)基中表達(dá),37°C擴(kuò)增,待0D600在0. 6 0. 8之間時(shí),用IPTG誘導(dǎo)(終 濃度為lmmol) 4小時(shí),分別在誘導(dǎo)前后取樣。4000轉(zhuǎn)/min離心30min,棄上清收集細(xì)菌菌 體。-20°C保存,進(jìn)行下一步的純化工作。2. 2 免疫毒素 CD25-PE38KDEL 的純化1)將收集的細(xì)菌菌體用50mmol Tris (pH7. 5) (lg菌體用20液體重懸)重懸, 4°C超生破碎菌體,高速離心(10000轉(zhuǎn)/min) 30min收集可溶性上清和包涵體,取小樣進(jìn) 行SDS-PAGE蛋白電泳;2)將高速離心得到的包涵體用8M尿素、0. IMNaH2PO4^O. OlTris (pH 8. 0)室溫變性2小時(shí),10000轉(zhuǎn)/min離心30min,收集上清;3)將收集的上清用0. 45um的濾膜過濾準(zhǔn)備用His-Ni++金屬鏊合柱純化;4)裝IOml的His-Ni++金屬鏊合柱,用5個(gè)柱 體積的水沖洗后,用5柱體積的平衡液(8M尿素、0. 1M0. IM NaH2P04、0. OlTrisUOmmol咪唑 PH 8.0)平衡,上樣(流速為2ml/min) ;5)上樣完備后,再用5柱體積的平衡液(8M尿素、 0. IM NaH2P04、0. OlTrisUOmmol咪唑pH 8. 0)平衡,然后用5小時(shí)將8M尿素的平衡液逐步 減為OM尿素的平衡液,此為蛋白的柱上復(fù)性過程;6)蛋白柱上復(fù)性完成后,用5柱體積的 洗脫液(0.02M PB,0.5M咪唑)洗脫,收集蛋白峰。蛋白電泳檢測(cè)其純化情況;7)將洗脫收 集的蛋白再進(jìn)行分子篩(20mmolPB)純化,收集蛋白峰,進(jìn)行電泳,確定對(duì)應(yīng)的目的蛋白。
2. 3免疫毒素CD25-PE38KDEL的濃度測(cè)定和純度鑒定 對(duì)純化的蛋白采用SDS-PAGE蛋白電泳和280nm紫外讀數(shù)法和Iowry酚法檢測(cè)純 度和濃度。2. 3. 1蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)1)15%凝膠電泳,制膠后按預(yù)定順序加樣,每孔加15μ 1,在甘氨酸電泳緩沖液中 初始以60V電壓進(jìn)行電泳;2)當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時(shí)將電壓改為150V,直至溴酚藍(lán)跑出膠的 底部。取出凝膠在染色液中室溫染色4小時(shí);3)在脫色液中脫色,每隔1小時(shí)換脫色液一 次,充分脫色后,干膠。2. 3. 2蛋白濃度測(cè)定1)根據(jù)紫外測(cè)定值,稀釋樣品至合適濃度,用Lowry酚法測(cè)免疫毒素蛋白濃度,配 置標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(lmg/ml),從1000 μ g/ml開始稀釋為1000,500,250,125,62. 5 ;2)樣品 也大概從1000 μ g/ml開始稀釋5個(gè)濃度。3)以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo),光密度(OD75tl) 值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3. 1免疫毒素CD25-PE38KDEL的誘導(dǎo)表達(dá)將構(gòu)建好的免疫毒素表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,待0D600在0. 6 0. 8之間 時(shí),加入IPTG,37°C誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí),4°C離心收集細(xì)菌,將誘導(dǎo)前后的細(xì)菌裂解,取樣進(jìn)行 SDS-PAGE電泳,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后有明顯的誘導(dǎo)條帶,而且蛋白分子量大小與預(yù)期蛋白分子量一 致。將收集的菌體重懸后在冰水中超聲碎菌,高速離心收集上清和包涵體,蛋白電泳顯示其 表達(dá)形式以包涵體為主。3. 2 免疫毒素 CD25-PE38KDEL 的純化根據(jù)蛋白電泳顯示免疫毒素主要是以包涵體形式表達(dá)。對(duì)于包涵體變性,常用的 變性劑主要有尿素(8M)、鹽酸胍(GdnHCl 6-8M),通過離子間的相互作用,破壞包涵體蛋白 間的氫鍵而增溶蛋白。采用8M尿素變性包涵體(室溫2小時(shí)),離心收集上清,過濾后用 His-Ni++金屬鏊合柱純化,將目的蛋白結(jié)合到親和柱上,緩慢地去除平衡液中的尿素,即為 柱上復(fù)性的過程,最后用洗脫液洗脫收集蛋白峰,將收集的蛋白在用分子篩純化,最后將純 化的免疫毒素⑶25-PE38KDEL及其突變體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。3. 3免疫毒素CD25-PE38KDEL及其突變體的純度和濃度測(cè)定將收集的蛋白洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳,發(fā)現(xiàn)其純度大于90%,可以滿足實(shí)驗(yàn)要 求。結(jié)合蛋白電泳、280nm紫外讀數(shù)法和Iowry酚法定量蛋白濃度,它們濃度在0. 24-0. 5mg/ ml之間。本實(shí)施例成功地構(gòu)建了免疫毒素⑶25-PE38KDEL的原核表達(dá)載體,并進(jìn)行了表達(dá)純化。使用的表達(dá)載體是pET32a,得到的蛋白是融合蛋白,其主要是以包涵體為主。包涵體 變性、復(fù)性是本部分的難點(diǎn)。目前,對(duì)于包涵體變性,常用的變性劑主要有尿素(8M)、鹽酸胍(GdnHC16-8M),通 過離子間的相互作用,破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。去垢劑如強(qiáng)的陰離子去垢劑 SDS,可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵,可以增溶幾乎所有的蛋白。問題是由于SDS無法徹底的去 除而不允許在制藥過程中使用。極端pH:可以破壞蛋白的次級(jí)鍵從而增溶蛋白。如有人在 pH> 9.0溶解牛生長(zhǎng)激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這 些方法只適合于少部分蛋白的增溶。變性劑的使用濃度和作用時(shí)間一般在偏堿性的環(huán)境 中,如pH8. 0-9. 0,尿素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定,一般不要超過pHl. 0。有些蛋白只能用鹽酸胍 如IL-4。增溶時(shí)一般室溫過夜,但鹽酸胍在37度1小時(shí)便可以使多數(shù)蛋白完全變性溶解。復(fù)性通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊 結(jié)構(gòu),同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過程開始,到2M 左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言,可以從4M開始,到1.5M時(shí)復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。復(fù)性中常 采用的方法有稀釋復(fù)性直接加入水或緩沖液,放置過夜,缺點(diǎn)是體積增加較大,變性劑 稀釋速度太快,不易控制。透析復(fù)性好處是不增加體積,逐漸降低外透液濃度來控制變性 劑去除速度,易形成沉淀,且不適合大規(guī)模操作,無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。超濾復(fù)性在生產(chǎn) 中較多的使用,規(guī)模較大,易于對(duì)透析速度進(jìn)行控制,缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況,且 有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。柱上復(fù)性是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中 應(yīng)用的一種復(fù)性方法,如華北制藥的G-CSF復(fù)性是通過柱上復(fù)性進(jìn)行的。常用于復(fù)性的層 析方法有SEC、HIC等。復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過程控制相關(guān)外, 還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān),有些蛋白非常容易復(fù)性,如牛胰RNA酶有12對(duì)二 硫鍵,在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上,而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)?其進(jìn)行復(fù)性的方法如IL-11,很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點(diǎn)幾。一般說來,蛋白質(zhì)的 復(fù)性效率在20%左右。影響復(fù)性效率的因素有蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度,變性劑的起始濃度和去 除速度、溫度、PH、氧化還原電勢(shì)、離子強(qiáng)度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等[Giovane, C.等.J.Mol.Recognit. 1999,12 :141-152 ;Ben Khal ifa 等,J. Mol. Recognit. 2000,13 127-139 ;Christensen, L. L. Anal.Biochem. 1997,249 153-164 ;Lilie, H.等·Curr. Opin. Biotechnol. 1998,9 :497_501]。復(fù)性效果的檢測(cè)根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要,可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等 方面對(duì)蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測(cè)。1、凝膠電泳一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠 電泳可以檢測(cè)變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì),或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)有二硫鍵的 蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對(duì)情況。2、光譜學(xué)方法可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性 光譜(CD)等,利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測(cè),但一般只用于復(fù)性研 究中的過程檢測(cè)。3、色譜方法如IEX、RP-HPLC、CE等,由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不 同,4、生物學(xué)活性及比活測(cè)定一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測(cè)定,較好的反映了復(fù)性 蛋白的活性,值得注意的是,不同的測(cè)活方法測(cè)得的結(jié)果不同,而且常常不能完全反映體 內(nèi)活性。5、黏度和濁度測(cè)定復(fù)性后的蛋白溶解度增加,變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露, 一般水溶性很差,大多形成可見的沉淀析出。6、免疫學(xué)方法如ELISA、TOSTERN等,特別 是對(duì)結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn),比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)[Fischer,B.等,.Arzneimittelforschung. 1992,42 1512—1515 ;Buchner, J.等.Anal. Biochem. 1992,205 263-270 ;Rogl, H.等,F(xiàn)EBS Lett. 1998,423 21-26 ;Mihic, S. J.等· BioTechniques. 1996, 20 804-808 ;Werner, Μ. H.等· FEBS Lett. 1994,345 125-130 ;Batas, B.等· Biotechnol. Bioeng. 1996,50 16-23]。根據(jù)目前包涵體變性、復(fù)性存在的問題,本發(fā)明者選擇價(jià)格便宜的尿素為變性 劑,復(fù)性方法采用柱上復(fù)性[Colangeli R.等.J. Chromatography B 1998,714:223-235; Rapid and efficient purification and refolding of a(His)6-tagged recombinant protein produced in E. coli as inclusion bodies,18-1134-37, Amersham Pharmacia Biotech]。根據(jù)純化結(jié)果和下一部分的活性檢測(cè)結(jié)果,該方法是成功的。這樣,僅用二步純 化法和His-Ni++柱上復(fù)性得到了目的蛋白,既節(jié)省了時(shí)間又減少了目的蛋白的損失。實(shí)施例3 HUT-102細(xì)胞殺傷試驗(yàn)1.材料和試劑臺(tái)式離心機(jī)Eppendorf公司產(chǎn)品生物安全柜臺(tái)灣造鑫公司產(chǎn)品細(xì)胞培養(yǎng)箱美國Revco,Asheville, N, C產(chǎn)品培養(yǎng)瓶、離心管、移液管、移液器、無菌吸嘴細(xì)胞培養(yǎng)試劑小牛血清為杭州四季青生物工程研究所產(chǎn)品;RPMI-1640培養(yǎng)基和 DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品。磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)及含小牛血清的PBS(PBSS)。測(cè)活細(xì)胞株HUT-102細(xì)胞(ATCC TIB162),含10 %新生小牛血清(NBS)的 RPMI-1640/DMEM(1 1)培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)于25_75cm2方瓶中。培養(yǎng)條件37°C,5% CO2,飽和濕度。2.方法⑶25-PE38KDEL用無酚紅培養(yǎng)液稀釋至2 μ g/mL,并連續(xù)2倍比稀釋。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUT-102細(xì)胞,離心棄上清,無酚紅培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至2X IO5/ ml,然后將細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,0. Iml/孔。CD25-PE38KDEL的序列稀釋液加入上步96孔培養(yǎng)板中,0. Iml/孔,每一濃度設(shè)2 復(fù)孔,培養(yǎng)液為空白對(duì)照,細(xì)胞培養(yǎng)箱反應(yīng)4-6小時(shí)。取各孔上清50 μ 1/孔,轉(zhuǎn)入另一 96孔板相應(yīng)孔中,加入細(xì)胞殺傷檢測(cè)試劑,細(xì)胞 培養(yǎng)箱反應(yīng)30分鐘,酶標(biāo)儀讀取0D490nm。3.結(jié)果分析采用分析軟件Select2. 2擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為工作參考品或待測(cè)樣品的濃 度,縱坐標(biāo)為OD值的平均數(shù),曲線為“S”形,因此選用4參數(shù)方程回歸模型。該軟件給出的回歸方程為Y= (A-B)/[1+(X/C)D]+B根據(jù)該方程,X = +①時(shí),Y = B,即最高限;當(dāng)X = O時(shí),Y = A,即最低限;而當(dāng)X =C時(shí),Y = (A+B)/2,即半數(shù)有效。因此C的數(shù)值即為半數(shù)有效濃度(EC50)。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們用HUT-102細(xì)胞檢測(cè)了 CD25-PE38KDEL免疫毒素的殺傷活性,EC50為30ng/ml,如圖5所示。實(shí)施例4⑶25-PE38KDEL免疫毒素對(duì)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用1.檢測(cè)原理混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(mixed lymphocyte culture,MLC)或稱混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) (mixed lymphocyte reaction, MLR)是來源于兩個(gè)個(gè)體的淋巴細(xì)胞在體外混合培養(yǎng)時(shí),由 于細(xì)胞表面HLA-II類抗原中的D和DP抗原不同,可相互刺激對(duì)方淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化(稱為雙 向MLC),并產(chǎn)生多種淋巴因子,促進(jìn)NK、CTL、LAK等殺傷細(xì)胞活性。若將刺激的一方淋巴細(xì) 胞先用絲裂霉素COiiitomycine C)或放射線照射處理,使該細(xì)胞失去增殖能力,但仍保持刺 激對(duì)方淋巴細(xì)胞增殖能力的試驗(yàn)稱為單向MLC ;如不加上述處理,則雙方互相刺激,稱為雙 向MLC。MLC反應(yīng)可通過3H-TdR摻入率或形態(tài)學(xué)檢測(cè)法以及MTT法檢測(cè)反應(yīng)細(xì)胞的增殖能 力。在淋巴細(xì)胞相互刺激轉(zhuǎn)化的過程中,若以CD25免疫毒素殺傷IL-2受體陽性細(xì)胞,則能 夠抑制MLR。2.材料和試劑2. 1玻璃纖維濾膜及負(fù)壓抽濾裝置,閃爍液及液閃計(jì)數(shù)儀。2. 2 3H-TdR 中科院上海原子核研究所產(chǎn)品,比放射活性30Ci/mmol,放射性濃度 lmCi/mL。2. 3其余材料和試劑與體外刺激活化的人外周血單個(gè)核細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)相同3.實(shí)驗(yàn)方法3.1分別取三位健康志愿者(A、B及C)肝素抗凝靜脈血10mL,用淋巴細(xì)胞分層 液密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),經(jīng)無血清的RPMI-1640洗3次,每次 1000r/min 離心 IOmin03. 2用含20% FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2. OX 105/mL。3. 3 含 20 % FCS 的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)液稀釋 CD25-PE38KDEL 至 1000pg/mL,并繼 續(xù)稀釋至濃度分別為100、10及l(fā)pg/ml。3. 4三個(gè)不同個(gè)體的淋巴細(xì)胞懸液,每?jī)煞N(AB、BC及AC)分為一組,檢測(cè)雙向 MLR,于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中各孔加入每組兩種細(xì)胞懸液各50yL,最弱反應(yīng)對(duì)照(min)加入 同一個(gè)體的單個(gè)核細(xì)胞100 μ 1。3. 5將樣品的稀釋液加入上述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,100 μ 1/孔,最強(qiáng)反應(yīng)對(duì)照(max) 孔(分別為含每組兩種不同的淋巴細(xì)胞的孔)加入含20% FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)液, 100 μ 1/孔,最弱反應(yīng)對(duì)照也加入含20% FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)液,100 μ 1/孔,設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔,37°C,5% 0)2溫箱培養(yǎng)6d。3. 6終止培養(yǎng)前20h每孔加入0. 5 μ Ci3H-TdR03. 7用細(xì)胞收集器將細(xì)胞吸附在玻璃纖維濾紙片上,用生理鹽水充分洗滌,洗去游 離的3H-TdR ;將濾紙片烘干后,用鑷子按其順序分別依次放入盛有閃爍液的塑料管內(nèi);β 閃爍儀自動(dòng)測(cè)定樣品lmin。4.試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果表明,本發(fā)明所提供的CD25-PE38KDEL免疫毒素在0. 01ng/ml表現(xiàn)出抑 制作用,有效抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),如圖6所示。實(shí)施例5 CD25-PE38KDEL免疫毒素對(duì)同種異體移植動(dòng)物模型排斥反應(yīng)的抑制作
13用l.hu-SPL-SCID 小鼠的建立4-6周齡的SCID小鼠用、射線照射(200rad)后腹腔注射人新鮮脾細(xì)胞(108/ 只),在接種后的數(shù)天內(nèi)小鼠眼眶采血以測(cè)定人脾細(xì)胞在小鼠PBMCs中的比例。選擇人脾細(xì) 胞(Spleens)與鼠PBMCs的比例在5% -20%之間的小鼠選使用。這樣的人化SCID小鼠命 名為hu-SPL-SCID小鼠。2.皮膚移植實(shí)驗(yàn) 將皮膚組織移植到接種了人脾細(xì)胞1 Id后的hu-SPL-SCID小鼠的胸腔背側(cè),每塊 皮膚均分別移植到不同的實(shí)驗(yàn)組。在進(jìn)行了皮膚移植后當(dāng)天給予各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腹腔注射50 u g/d的CD25-PE38KDEL 或PBS對(duì)照(持續(xù)5天)。移植實(shí)施7d后每天用盲法評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)組移植皮膚的存活狀態(tài), 連續(xù)觀察30d,然后每星期觀察一次,80d后處死小鼠。移植皮膚的狀態(tài)可分為0-4級(jí)。0 級(jí)移植皮片完整柔軟有光澤;1級(jí)皮片柔軟但有小面積的色素沉著;2級(jí)皮片柔軟但有 大面積的褪色;3級(jí)皮片變硬;4級(jí)皮片變硬皺縮失去光澤。當(dāng)移植皮片的狀態(tài)被評(píng)定為 3級(jí)以上時(shí)判為移植排斥。3. CD25-PE38KDEL 清除 CD25+T 細(xì)胞的能力⑶25-PE38KDEL發(fā)揮其免疫抑制作用的最重要機(jī)制是控制、清除參與排斥反應(yīng) 的CD25+T細(xì)胞,為了考察各人源化抗體在人化SCID小鼠體內(nèi)的免疫抑制作用,我們按 給小鼠注射⑶25-PE38KDEL,每日眼眶采血,檢測(cè)外周血中人⑶25+T細(xì)胞的數(shù)量,檢測(cè) CD25-PE38KDEL對(duì)CD25+T細(xì)胞的清除能力。4.結(jié)果表1移植物存活時(shí)間
存活時(shí)間
受試動(dòng)物編號(hào)-
PBS對(duì)照組CD25-PE38KDEL治療組
#18d37d#210d51dm8d28d#49d80d#5lid63d CD25-PE38KDEL治療組與PBS對(duì)照組分別清除CD25+T細(xì)胞的對(duì)比結(jié)果如圖7所
7JN o
1權(quán)利要求
免疫毒素CD25 PE38KDEL的制備方法,其特征在于,所述制備方法包括以下步驟,(A)將抗CD25抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過連接肽(G4S)3連接起來,構(gòu)建CD25單鏈抗體ScFv,然后用連接肽將CD25單鏈抗體ScFv與PE38KDEL毒素連接,獲得新的免疫毒素CD25 PE38KDEL序列;(B)構(gòu)建表達(dá)含有步驟A中所述免疫毒素CD25 PE38KDEL序列的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21;(C)將步驟B中的大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)、菌體破壁、離心收集,獲得免疫毒素CD25 PE38KDEL包涵體;(D)將步驟C中獲得的免疫毒素CD25 PE38KDEL包涵體于室溫使用8mol/l尿素溶液變性2小時(shí),離心變性液,將收集的離心上清使用濾膜過濾備用;(E)His Ni++金屬螯合柱用平衡液平衡,將步驟D中過濾備用的離心上清上樣至His Ni++金屬螯合柱,上樣完備后再用平衡液平衡,然后將平衡液中的尿素含量緩慢降至0mol/l;和(F)使用洗脫液洗脫步驟E中的His Ni++金屬螯合柱,將洗脫收集的蛋白再進(jìn)行分子篩純化,最終獲得免疫毒素CD25 PE38KDEL蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟A中所述CD25單鏈抗體ScFv具有 重鏈可變區(qū)-接頭-輕鏈可變區(qū)的結(jié)構(gòu),其中所述重鏈可變區(qū)具有SEQID NO :1所示的氨基 酸序列,所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列,步驟A中所述PE38KDEL毒 素具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟D中使用的8mol/l尿素溶液的配 方為 8mol/l 尿素、0. lmol/lNaH2P04、0· 01mol/l Tris, ρΗ8· 0。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟E中使用的平衡液配方為8mol/l 尿素、0. lmol/lNaH2P04、0. 01mol/l Tris、10mmol/l 咪唑,pH 8. 0。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟F中使用的洗脫液包含0.02mol/l PB和0. 5mol/l咪唑溶液。
6.使用如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的制備方法獲得的免疫毒素CD25-PE38KDEL。
7.一種預(yù)防和/或治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的藥物組合物,其特征在于,所述組合物含有 權(quán)利要求6所述的免疫毒素⑶25-PE38KDEL以及藥學(xué)上可接受的載體。
8.權(quán)利要求6所述的免疫毒素CD25-PE38KDEL或權(quán)利要求7所述的藥物組合物在制備 預(yù)防和/或治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用,其特征在于,其中所述的T細(xì)胞介導(dǎo)疾病為移植排斥反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離的多肽,包含抗人單克隆抗體CD25的單鏈抗體ScFv,以及與所述單鏈抗體ScFv偶聯(lián)的免疫毒素PE38KDEL。本發(fā)明還提供了編碼上述多肽的DNA分子、含有該DNA分子的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和制備方法,并公開了該多肽在制備治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途,以及含有該多肽的藥物組合物。
文檔編號(hào)C12N1/15GK101979593SQ20101024500
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2007年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月26日
發(fā)明者候盛, 寇庚, 李晶, 郭亞軍 申請(qǐng)人:上海中信國健藥業(yè)股份有限公司