專利名稱：應(yīng)用基因芯片檢測腫瘤組織篩查腫瘤血清標(biāo)志物的方法
應(yīng)用基因芯片檢測腫瘤組織篩查腫瘤血清標(biāo)志物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用基因芯片篩查腫瘤血清標(biāo)志物的方法。背景技術(shù)：
腫瘤標(biāo)志物(tumor marker, TM)是指在腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細胞的基因表達而合成、分泌的，或因機體對腫瘤反應(yīng)而異常產(chǎn)生和(或)升高的反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)。腫瘤標(biāo)志物可分為癌胚抗原類、酶類、激素類、糖蛋白類、癌基因類和細胞表面腫瘤抗原類等六大類，前四類為血清腫瘤標(biāo)志物，后兩類為細胞腫瘤標(biāo)志物。這些物質(zhì)可在腫瘤患者體液、排泄物或組織中檢測出來。其中，較好的腫瘤血清標(biāo)志物與病程及治療預(yù)后相關(guān)，特異度、敏感度較強，可作為監(jiān)測病程、評估療效、預(yù)防復(fù)發(fā)的重要監(jiān)測指標(biāo)，對指導(dǎo)腫瘤的臨床監(jiān)測和治療有重要意義。然而，目前尋找腫瘤血清標(biāo)志物仍是富有挑戰(zhàn)性的難題。(Radpour R, Barekati Z,Kohler C,et al. New trends in molecular biomarker discovery for breastcancer. Genet Test Mol Biomarkers. 2009 ； 13 (5) :565-71.)近年來，研究人員針對各種腫瘤的蛋白質(zhì)及核酸進行高通量篩查分析。以腫瘤組織為研究對象，基因芯片為尋找腫瘤組織標(biāo)志物提供可能，但這些組織標(biāo)志物在血清中不一定存在，更不用說其血清濃度伴隨腫瘤的發(fā)展而變化。以腫瘤患者血清為研究對象，蛋白組學(xué)研究有助于尋找到大量的血清異常指標(biāo)，但目前因缺乏相配套的后續(xù)定量及驗證體系，使研究陷入瓶頸狀態(tài)。(Makawita S, Diamandis EP.The bottleneckin the cancer biomarker pipeline and protein quantification through massspectrometry-based approaches current strategies for candidate verification. ClinChem. 2010 ；56 (2) :212-22.)因此，創(chuàng)建有效便捷的尋找腫瘤血清標(biāo)志物的新方法意義重大。眾所周知，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展(包括腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等)與腫瘤血管生成過程密切相關(guān)，監(jiān)測其血管生成過程能在很大程度上監(jiān)視腫瘤的發(fā)生發(fā)展。比如嬰幼兒血管瘤具有與血管生成過程密切相關(guān)的獨特的自然病程它常于出生后數(shù)天出現(xiàn)，短期內(nèi)迅速增生，進展極快，經(jīng)歷一年左右的增生期后，血管瘤逐漸穩(wěn)定，進入數(shù)年的退化期，它已經(jīng)被作為研究人類血管生成過程的獨一無二的天然窗口(Calicchio ML, Collins Τ, Kozakewich HP. Identification of signaling systems in proliferating and involuting phase infantilehemangiomas by genome-wide transcriptional profiling. Am J Pathol. 2009 ；174(5) :1638_1649· & Pr￡im￡mik K, Chun CZ, Garnaas MK, et al. Dusp-5 andSnrk-1 coordinately function during vascular development and disease. Blood. 2009 ；113(5) :1184-1191.)。目前認為，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的復(fù)雜過程中，可能存在著一個相互協(xié)調(diào)的共表達的基因群體。研究這一基因群體的動態(tài)變化，有助于了解腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制，從而尋找到與病程密切相關(guān)的血清標(biāo)志物。基因芯片(主要指DNA微陣列)的大規(guī)模、高通量系統(tǒng)篩查恰恰滿足了這一要求，并能避免對已報道因子進行血清檢測，消除指Willff (Scott CP, Vanffye J, McDonald MD, et al. Technical analysis of cDNA microarrays. PLoS ONE. 2009，4 :e4486.)。但它也帶來兩個關(guān)鍵性難題1、基因芯片結(jié)果信息量巨大，存在較大個體差異，并伴有假陽性和假陰性結(jié)果，如何從紛繁復(fù)雜的基因芯片結(jié)果中便捷準(zhǔn)確地篩選出有意義且易于成功驗證的基因呢？這是基因芯片研究中普遍存在的信息挖掘問題(Dong G, Loukinova Ε, Chen Ζ, et al. MolecularProfiling of Trnasformed and Metastatic Murine Squamous Carcinoma Cells byDifferential Display and cDNA Microarray Reveals Altered Expression of MultipleGenes Related to Growth,Apoptosis,Angiogenesis,and the NF_kB Signal Pathway. Cancer Research, 2001,61 :4797-4808.)。2、近年來尋找腫瘤組織標(biāo)志物成為腫瘤研究的重要熱點，但如何從腫瘤組織基因芯片結(jié)果篩查出血清標(biāo)志物，目前尚未見可靠的解決方法。(Chatterjee SK, Zetter BR. Cancer biomarkers knowing thepresent and predicting the future. Future Oncol·2005，1 :37_50. & Meuwis MA, Fillet M, Chapelle JP, et al. New biomarkers of Crohn' s disease serum biomarkersand development of diagnostic tools.Expert Rev Mol Diagn. 2008,8 :327-37.)

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，建立一種尋找腫瘤血清標(biāo)志物的有效便捷的新方法。為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用腫瘤組織基因芯片篩查腫瘤血清標(biāo)志物的方法，包括以下步驟(1)以基因芯片檢測增生期腫瘤組織與退化期腫瘤組織的差異表達基因，從共同差異表達基因中篩選編碼分泌蛋白的基因；(2)分析步驟(1)所獲基因編碼的分泌蛋白，篩出可分泌入血中、具潛在血清標(biāo)志物意義的蛋白，即為潛在腫瘤血清標(biāo)志物；(3)對步驟( 所獲得的潛在腫瘤血清標(biāo)志物在腫瘤組織及血清中的表達情況進行檢測驗證，以獲得腫瘤血清標(biāo)志物，所述檢測方法包括ELISA檢測、實時定量RT-PCR、免疫組織化學(xué)及Western blotting法。所述腫瘤是指血管瘤。步驟(1)中所述差異表達基因優(yōu)選差異表達2倍以上的基因；步驟(1)中所述基因芯片優(yōu)選人全基因組表達譜寡核苷酸基因芯片?；蛐酒?Gene Chip)的概念現(xiàn)已泛化到生物芯片(biochip)、微陣列 (Microarray)、DNA芯片(DNA chip)，甚至蛋白芯片。但一般說來，基因芯片通常指DNA芯片，即DNA微陣列芯片(DNA microarray)，其基本原理是將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。本發(fā)明中的“基因芯片”就是指DNA微陣列芯片。至今為止生物信號平行分析最成功的形式是以一種尼龍膜為基質(zhì)的“cDNA微陣列”，用于檢測生物樣品中基因表達譜的改變。該類基因芯片檢測組織細胞中各基因在mRNA這一穩(wěn)定的基因表達水平的數(shù)量，故也稱為基因表達譜芯片。本發(fā)明的優(yōu)點在于，改進基因芯片檢測和分析方法以解決上述兩大難題一方面，以同一患者同一腫瘤病灶的增生早期和消退前期組織標(biāo)本進行自身對照，既減少樣本量， 又在一定程度上消除無意義的差異表達基因，提高結(jié)果的可信度。另一方面，針對其中編碼分泌蛋白的基因進行篩查，分析這些基因的功能，進一步篩出可分泌入血中、具潛在血清標(biāo)志物意義的基因，從而系統(tǒng)全面、有效便捷地篩出可能的血管瘤血清標(biāo)志物。分泌蛋白是指在細胞內(nèi)合成并分泌至細胞外發(fā)揮作用的一類蛋白質(zhì)，如酶、抗體、 細胞因子、神經(jīng)肽、部分激素等。它僅占人體蛋白的十分之一(KleinRD，Gu Q,Goddard A,et al.Selection for genes encoding secreted proteins andreceptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996,93 :7108-13.),是一類功能非常重要的蛋白，參與了細胞的生長發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、信號傳導(dǎo)、細胞分化凋亡、血管生成、腫瘤發(fā)生等多種過程。從腫瘤細胞內(nèi)基因表達合成并分泌于血清的腫瘤標(biāo)志物，均屬分泌蛋白。更重要的是，該分泌型標(biāo)志物蛋白的血清濃度與瘤體體積、其基因表達量及其蛋白分泌活躍程度等因素相關(guān)，這為后期分析該血清標(biāo)志物與腫瘤臨床表現(xiàn)、病程及治療預(yù)后的相關(guān)性提供了理論基礎(chǔ)，有望成為具臨床意義的血清監(jiān)測指標(biāo)。本發(fā)明針對分泌蛋白篩選腫瘤血清標(biāo)志物，創(chuàng)新性實踐了從腫瘤組織的差異表達基因中尋找血清標(biāo)志物的捷徑一方面分泌蛋白僅占人體蛋白的十分之一，將篩選范圍縮小約10倍，大大減少了工作量；另一方面經(jīng)進一步功能分析，篩選出少數(shù)幾個潛在的血清標(biāo)志物，將大大提高血清學(xué)驗證的成功率，最終篩出有意義的腫瘤血清標(biāo)志物。在以往腫瘤基因芯片研究中，從瘤體組織的基因檢測結(jié)果中難以有效準(zhǔn)確地篩選定位出潛在的血清標(biāo)志物。本方法不但跨越了從組織到血清的障礙，而且克服了基因芯片結(jié)果篩選過程中工作量大，準(zhǔn)確率低，所篩基因意義不明確的難題。依照本方法公開的基因篩查技術(shù)方案，能有效便捷地從成百上千個腫瘤組織差異表達基因中，較為準(zhǔn)確地篩查定位出潛在的腫瘤血清標(biāo)志物，并且易于實驗驗證，成功率較高。它適用于實體或非實體性腫瘤(只要能提取腫瘤基因進行基因芯片檢測即適用)，能系統(tǒng)全面、有效便捷地篩查腫瘤血清標(biāo)志物，并能避開已報道因子，消除指標(biāo)選擇上的偏倚，從而篩選出1個或多個潛在的腫瘤血清標(biāo)志物，進行進一步檢測驗證。

圖1為微珠芯片檢測自身對照組織的差異表達基因，其中一對標(biāo)本的芯片掃描截圖(上)和4例差異表達基因散點圖(下)。圖2為血管瘤增生退化期差異表達基因聚類圖，圖示新的血清標(biāo)志物ANG篩選過程(A)表示68個差異表達基因，(B)表示放大顯示含ANG的部分差異表達基因，(C)表示篩出的ANG等4個編碼分泌蛋白的基因。圖3為各組血清ANG濃度均值比較增生期組(ΡΗ，η = 46)高于退化期組(ΙΗ，η =23)，退化期組高于正常對照組(control，!! = 31)，增生期組和退化期組均高于靜脈畸形組(VM，η = 20)。圖4為ROC曲線分析顯示增生組和其他各組的最佳ANG臨界濃度及相應(yīng)的敏感度和特異度Α.表示與正常對照組相比，B.表示與靜脈畸形組相比，C.表示與退化組相比。圖5為實時定量RT-PCR驗證ANG在血管瘤組織中mRNA水平上的表達，實驗結(jié)果顯示增生期組(ΡΗ，η = 6)血管瘤組織中mRNA水平上ANG的表達高于退化期(ΙΗ，η = 5)組和正常對照組(control, η = 5) (P < 0. 001)。圖6為免疫組織化學(xué)染色驗證ANG蛋白在血管瘤組織中的表達，實驗結(jié)果顯示增生期組(上行，η = 26)血管瘤血管內(nèi)皮細胞呈胞漿內(nèi)強陽性表達(胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為免疫組化染色陽性)，退化期組(中行，η = 25)血管瘤血管內(nèi)皮細胞呈胞漿內(nèi)中等陽性表達，正常對照組(下行，n= 1 呈陰性表達，提示增生期血管瘤組織中蛋白水平上ANG 的表達高于退化期組和正常對照組。圖中左列放大200倍，右列放大400倍。圖7 S^festern blotting驗證ANG蛋白在血管瘤組織中的表達，實驗結(jié)果顯示增生期組(ΡΗ，η = 7)血管瘤組織中ANG蛋白定量高于退化期組(ΙΗ，η = 6)和正常對照組 (control, η = 6) (P < 0. 05)。Α.顯示三組蛋白印跡條帶，B.顯示三組蛋白相對定量統(tǒng)計比較，均以β-actin為內(nèi)參。圖8為本方法的技術(shù)路線圖。
具體實施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
做詳細說明。實施例1 篩查血管瘤血清標(biāo)志物依據(jù)圖8所示的技術(shù)路線，設(shè)計如下技術(shù)方案選擇中科院上海健康科學(xué)研究所基因芯片中心提供的人全基因組表達譜寡核苷酸基因芯片，芯片型號為illumina Human-6beadchip (微珠芯片)，共48000轉(zhuǎn)錄本，特異性探針數(shù)量不少于一千萬?；蛐畔碜杂贜CBI RefSeqdatabase (Bui Id 36.2，Release 22)以及Unigene database (Build 199)，所含基因涉及各個分類以及網(wǎng)上查詢所得的熱點基因，并涵蓋已報道的相關(guān)已知基因。經(jīng)檢測4對血管瘤增生、退化期自身對照標(biāo)本，篩得差異表達2倍以上的基因數(shù)目分別為500、79、436、665(圖1)，4例自身對照結(jié)果中有2例以上同時出現(xiàn)的共同差異表達基因為68個(剔除4例中同時出現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)均達2倍以上的自相矛盾的基因)(圖2)， 其中與退化期相比，在增生期上調(diào)的有62個(Diffscore > 20，Ratio > 2，P < 0.01)，下調(diào)的有 6 個(Diffscore < -20，0 < Ratio < 0. 5，P < 0. 01)。之后通過Genebank數(shù)據(jù)庫檢索匯總這68個基因的功能信息和相關(guān)參考文獻，搜索與分泌蛋白相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵詞，如secrete (分泌)、paracrine (旁分泌)、blood(血液)、 serum(血清)等，共篩查得4個有意義的編碼分泌蛋白的基因，包括ANG、CXCL14、CCL19、 PTCDS，其中血管生長素(angiogenin，ANG)是一個關(guān)鍵的分泌型血管生成因子，能在內(nèi)皮細胞內(nèi)合成，可分泌入外周血中，具潛在的血清標(biāo)志物的意義，已在同日遞交的另一份發(fā)明專利申請“血管生長素作為血管瘤血清標(biāo)志物的應(yīng)用”中公開。經(jīng)檢測增生、退化期血管瘤、靜脈畸形及正常對照4組血清A因子濃度，發(fā)現(xiàn)增生期組血清ANG濃度高于退化期組(P < 0. 01)，退化期組高于正常對照組(P < 0. 001)，增生期組和退化期組均高于靜脈畸形組(P值分別小于0. 001,0. 01)(圖3)。ROC曲線分析顯示血清ANG濃度與血管瘤增生退化病程密切相關(guān)，且特異性敏感性強(表1，圖4)。表1. ROC曲線分析顯示增生組和其他各組的最佳ANG臨界濃度及相應(yīng)的敏感度和特異度
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用基因芯片檢測腫瘤組織篩查腫瘤血清標(biāo)志物的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)以基因芯片檢測增生期腫瘤組織與退化期腫瘤組織的差異表達基因，從共同差異表達基因中篩選編碼分泌蛋白的基因；(2)分析步驟(1)所獲基因編碼的分泌蛋白，篩出可分泌入血中、具潛在血清標(biāo)志物意義的蛋白，即為潛在腫瘤血清標(biāo)志物；(3)對步驟( 所獲得的潛在腫瘤血清標(biāo)志物在腫瘤組織及血清中的表達情況進行檢測驗證，以獲得腫瘤血清標(biāo)志物，所述檢測方法包括ELISA檢測、實時定量RT-PCR、免疫組織化學(xué)及 Western blotting 法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用基因芯片檢測腫瘤組織篩查腫瘤血清標(biāo)志物的方法，其特征在于，所述腫瘤是指血管瘤。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用基因芯片檢測腫瘤組織篩查腫瘤血清標(biāo)志物的方法，其特征在于，步驟(1)中所述差異表達基因是指差異表達2倍以上的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用基因芯片檢測腫瘤組織篩查腫瘤血清標(biāo)志物的方法，其特征在于，步驟(1)中所述基因芯片為人全基因組表達譜寡核苷酸基因芯片。
全文摘要
本發(fā)明公開了應(yīng)用基因芯片檢測腫瘤組織篩查腫瘤血清標(biāo)志物的方法，包括以下步驟(1)以基因芯片檢測增生期與退化期腫瘤組織的差異表達基因，從中篩選編碼分泌蛋白的基因；(2)分析所獲基因編碼的分泌蛋白，篩出可分泌入血中、具潛在血清標(biāo)志物意義的蛋白；(3)對潛在腫瘤血清標(biāo)志物在腫瘤組織及血清中的表達進行檢測驗證，以獲得腫瘤血清標(biāo)志物。本發(fā)明從復(fù)雜的腫瘤組織差異表達基因中針對編碼分泌蛋白的基因簡捷有效地篩選腫瘤血清標(biāo)志物，不但創(chuàng)新性實踐了從腫瘤組織的差異表達基因中尋找血清標(biāo)志物的捷徑，而且克服了基因芯片結(jié)果篩選過程中工作量大，準(zhǔn)確率低，所篩基因意義不明確的難題，對腫瘤血清標(biāo)志物的尋找具重要參考價值。
文檔編號C12Q1/68GK102344956SQ20101024521
公開日2012年2月8日 申請日期2010年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月4日 公開號201010245211.發(fā)明者張莉, 李偉, 林曉曦, 江成鴻, 胡曉潔, 金云波, 陳曉東, 陳輝, 陳達, 馬剛 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院