專利名稱：玉米絲黑穗病室內(nèi)快速接種鑒定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種玉米絲黑穗病室內(nèi)快速接種鑒定的方法，屬于玉米抗病性鑒定技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
玉米絲黑穗病是世界性的重要玉米病害。在國外最早報(bào)道見于1875年，亞、非、歐 洲各國家均有不同程度發(fā)生，給玉米生產(chǎn)帶來一定的經(jīng)濟(jì)損失(王遠(yuǎn)路，200 。該病在我 國各玉米產(chǎn)區(qū)均有不同程度的發(fā)生，其中以北方春播區(qū)、西南丘陵山地區(qū)受害較重，一般發(fā) 病率在5% 10%之間，個(gè)別重病地塊發(fā)病率可達(dá)60% 70%以上。可通過加強(qiáng)田間管理降低玉米絲黑穗病發(fā)病率，也可采用種子包衣等藥劑防治措 施使發(fā)病程度得到控制，但這些方法受氣候和人為操作影響較大，穩(wěn)定性不足，成本高，易 造成感病和嚴(yán)重的減產(chǎn)，藥物使用不當(dāng)容易對玉米造成毒害，易污染環(huán)境，而且不同的品種 間對玉米絲黑穗病的抗性存在極顯著的差異。防治該病最有效的方法是種植抗病玉米品 種，而抗病品種的選育依賴于抗病種質(zhì)資源，為此需加強(qiáng)對玉米種質(zhì)資源進(jìn)行該病的抗性 評價(jià)，進(jìn)而選育抗病玉米自交系。由于玉米絲黑穗病從種子萌發(fā)到七葉期都能侵染，并且各時(shí)期表現(xiàn)不同的特征， 因此該病的抗性鑒定方法較多。主要包括質(zhì)壁分離法、接種后在乳熟期進(jìn)行鑒定、乳酚油 棉蘭染色玉米生長錐鑒定法、丁布含量測定方法、葉片褪綠斑的有無鑒定法、通過觀察生長 錐中菌絲進(jìn)行鑒定、PCR技術(shù)的玉米絲軸黑粉菌侵染率。其中，乳熟期進(jìn)行田間菌土法鑒定 是目前通用的鑒定方法(Kruger W，1962)，具體方法為從上一年秋季的典型病株上采集病 癭，裝布袋、置通風(fēng)處越冬；播種前一周將病癭上的菌粉抖落，用40目的篩子篩出冬孢子， 按0. 質(zhì)量比與曬過的細(xì)土混合配成菌土 ；播種時(shí)先播種子，覆蓋菌土 100g，上面再上一 層覆土，等玉米生長到乳熟期進(jìn)行病株率調(diào)查。雖然鑒定結(jié)果相對準(zhǔn)確可靠，但是存在一 定的局限性用地量大，需要時(shí)間長，要求材料純度高，鑒定群體量大一般不少于50株，同 時(shí)需在多年多點(diǎn)多個(gè)環(huán)境進(jìn)行鑒定。通過觀察生長錐中菌絲進(jìn)行鑒定目前有6種常用的 染色法，并且，張寶艷O008)比較了姬姆薩氏色素(Giemsa)、考馬斯亮蘭組織透明染色、番 紅0-Κ0Η、苯胺藍(lán)-甘油、曲利苯蘭酒精-乳酚酸和苯胺藍(lán)-乳酚油染色法對玉米絲黑穗病 菌不同生長發(fā)育階段的染色效果。結(jié)果表明，在一定的染液濃度條件下，6種染色方法均可 進(jìn)行冬孢子、芽管、先菌絲、擔(dān)子、擔(dān)孢子等寄主組織內(nèi)部菌體的原位染色。曲利苯蘭組織 透明染色方法更穩(wěn)定、簡捷和易于觀察，能觀察玉米絲黑穗病菌的整個(gè)生長發(fā)育階段，因此 適宜胞間菌絲的染色。此法對絲黑穗的鑒定也比較準(zhǔn)確，每次鑒定的量少，并且，據(jù)檀國慶 (2009)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)玉米在接種后有帶菌現(xiàn)象，即植物體內(nèi)有菌絲存在但在乳熟期不發(fā)病。因 此，這種狀況就很難判斷。上面的每種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性，如利用在苗期侵染葉片所產(chǎn)生的褪綠斑點(diǎn) 來鑒定抗病性的方法僅適用于自交系且判斷不準(zhǔn)確；而乳熟期鑒定結(jié)果雖然準(zhǔn)確可靠，但 用地量大，工作效率低，群體不少于50株，同時(shí)需在多個(gè)環(huán)境鑒定，因此需要尋求一種能在室內(nèi)準(zhǔn)確快速鑒定資源抗性的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述存在的問題提供一種玉米絲黑穗病室內(nèi)快速接種鑒定 的方法，達(dá)到建立簡便、快速、有效、準(zhǔn)確的使用少量材料即可進(jìn)行玉米絲黑穗病接種鑒定 的目的。上述的目的通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)玉米絲黑穗病室內(nèi)快速接種鑒定的方法，該方法包括如下步驟(1)制備玉米絲黑穗病菌菌液玉米絲黑穗病菌冬孢子粉在室溫下干燥6-7天， 無菌水清洗，甲醛+高錳酸鉀熏蒸25min，接種至麥芽糖水瓊脂培養(yǎng)基下倒置暗培養(yǎng) 17h，挑取已經(jīng)萌發(fā)的單個(gè)冬孢子，接種至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，下倒置暗培養(yǎng)15d，將 培養(yǎng)好的絲黑穗病菌的菌落刮出，轉(zhuǎn)入2%的蔗糖溶液中下振蕩暗培養(yǎng)48h，調(diào)整菌 液濃度為 6. 2X105cfu/ml ；(2)培養(yǎng)玉米幼苗挑選發(fā)育良好玉米種子，放入鋪好濾紙的發(fā)芽盒中，噴水后放 入人工氣候箱中，20°C下進(jìn)行暗培養(yǎng)，直至芽長到3cm ；(3)接種玉米絲黑穗病菌將步驟O)中培養(yǎng)的玉米幼苗的中胚軸部位侵入步驟 (1)中制備好的玉米絲黑穗病菌菌液中，放入真空干燥器中，蓋上蓋子，打開真空泵，壓力為 6X10—2帕處理25-35min將玉米幼苗取出，接種溫度為25°C /15°C變溫處理；(4)接種后幼苗的培養(yǎng)在接種后苗移栽到土壤，保證土壤濕度穩(wěn)定在20% ；(5)接種效果的檢測接種IOd后，取接種部位下Icm下的玉米莖部組織，CTAB法 提取DNA，依據(jù)玉米絲黑穗病菌基因組上SR3序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR的方法進(jìn)行接種效果 的檢測。所述的玉米絲黑穗病室內(nèi)快速接種鑒定的方法，步驟(5)中所述的引物為引物 1 :5-GCAGCCTCAGCATTACTC-3'，引物 2:5' -ATACACCTGTGACGGCTG-3 ‘，PCR 反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù) 變性95°C 3min，變性95°C 30s，退火溫度56°C 40s，延伸72°C 40s，循環(huán)37次，終延伸72°C 延伸lOmin，最后4°C保存。有益效果1.適應(yīng)范圍廣本發(fā)明的玉米絲黑穗病室內(nèi)快速接種鑒定方法適用于玉米種質(zhì) 對玉米絲黑穗病的抗性鑒定及遺傳研究，本發(fā)明對絲黑穗病菌接種濃度、接種部位、接種溫 度、土壤濕度等接種條件，進(jìn)行了詳細(xì)的研究，確立了適宜的范圍，建立了玉米絲黑穗病接 種室內(nèi)快速接種鑒定方法，本發(fā)明的玉米絲黑穗病室內(nèi)快速接種鑒定的方法具有適用范圍 廣的特點(diǎn)，適用于幾乎所有的玉米種質(zhì)。2.本發(fā)明所需樣本數(shù)量少，操作比較簡便。本發(fā)明只需少量玉米材料，效率高，成 本低廉。本發(fā)明步驟簡單，不需將玉米播種至田間，接種鑒定周期短，鑒定效率高。3.本發(fā)明易于掌握，不受環(huán)境條件影響，重復(fù)性高。本發(fā)明使用玉米幼苗中胚軸為 接種部位，容易獲得，在室內(nèi)進(jìn)行檢測，條件可控，適于對大量玉米種質(zhì)對玉米絲黑穗病的 抗性檢測及遺傳研究。


附圖1是本發(fā)明的步驟框圖。附圖2是接種濃度各自交系變化分析圖。附圖3是土壤濕度各自交系變化分析圖。附圖4是接種部位各自交系變化分析圖。附圖5是接種方法各自交系變化分析圖。附圖6是接種溫度各自交系變化分析圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 玉米絲黑穗病室內(nèi)快速接種鑒定的方法，該方法包括如下步驟(1)制備玉米絲黑穗病菌菌液玉米絲黑穗病菌冬孢子粉在室溫下干燥6-7天，無 菌水清洗，24ml甲醛+12g高錳酸鉀熏蒸25min，接種至麥芽糖水瓊脂培養(yǎng)基，28°C下倒置 暗培養(yǎng)17h，挑取已經(jīng)萌發(fā)的單個(gè)冬孢子，接種至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基二8°C下倒置暗培養(yǎng) 15d，將培養(yǎng)好的絲黑穗病菌的菌落刮出，轉(zhuǎn)入2%的蔗糖溶液中下振蕩暗培養(yǎng)48h， 調(diào)整菌液濃度為6. 2X105cfu/ml ；(2)培養(yǎng)玉米幼苗挑選發(fā)育良好玉米種子，放入鋪好濾紙的發(fā)芽盒中，噴水后放 入人工氣候箱中，20°C下進(jìn)行暗培養(yǎng)，直至芽長到3cm ；(3)接種玉米絲黑穗病菌將步驟O)中培養(yǎng)的玉米幼苗的中胚軸部位侵入步驟 (1)中制備好的玉米絲黑穗病菌菌液中，放入真空干燥器中，蓋上蓋子，打開真空泵，壓力為 6X10—2帕處理25-35min將玉米幼苗取出，接種溫度為25°C /15°C變溫處理；(4)接種后幼苗的培養(yǎng)在接種后苗移栽到土壤，保證土壤濕度穩(wěn)定在20% ；(5)接種效果的檢測接種IOd后，取接種部位下Icm下的玉米莖部組織，CTAB法 提取DNA，依據(jù)玉米絲黑穗病菌基因組上SR3序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR的方法進(jìn)行接種效果 的檢測。所述的玉米絲黑穗病室內(nèi)快速接種鑒定的方法，步驟(1)中所述的麥芽糖水瓊脂 培養(yǎng)基的配比為麥芽糖lg，瓊脂20g，水1000ml，所述的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的配比為葡萄 糖 IOg,馬鈴薯 200g,瓊脂 15-20g,水 IOOOml。所述的玉米絲黑穗病室內(nèi)快速接種鑒定的方法，步驟(5)中所述的引物為引物 1 :5-GCAGCCTCAGCATTACTC-3'，引物 2:5' -ATACACCTGTGACGGCTG-3 ‘，PCR 反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù) 變性95°C 3min，變性95°C 30s，退火溫度56°C 40s，延伸72°C 40s，循環(huán)37次，終延伸72°C 延伸lOmin，最后4°C保存。實(shí)施例2 本試驗(yàn)選用經(jīng)多年接種鑒定已知抗性的的高抗(HR)、抗病(R)、中抗(MR)、感病 (S)和高感(HS)各2個(gè)玉米自交系為試驗(yàn)材料，試驗(yàn)材料的田間發(fā)病率及絲黑穗的抗感性 見表1。表1試驗(yàn)材料的田間發(fā)病率及絲黑穗的抗感性玉米自交系田間發(fā)病率％抗病性齊3190. 00HRSH150. 00HRMol71. 64R綜311. 40RB735. 60MRHC6. 70MRX17834. 40S金黃96B24. 20S黃早四76. 81HS昌7-293. 25HS采用正交設(shè)計(jì)，人工接種研究的因素包括絲黑穗病菌接種濃度、土壤濕度、接種部 位、接種方法、接種溫度，本試驗(yàn)的水平為3。選擇L18(37)正交表，正交試驗(yàn)方案見表2。同 時(shí)進(jìn)行田間接種鑒定作為對照。表2正交試驗(yàn)計(jì)劃表
權(quán)利要求
1.一種玉米絲黑穗病室內(nèi)快速接種鑒定的方法，其特征是該方法包括如下步驟(1)制備玉米絲黑穗病菌菌液玉米絲黑穗病菌冬孢子粉在室溫下干燥6-7天，無菌水 清洗，甲醛+高錳酸鉀熏蒸25min，接種至麥芽糖水瓊脂培養(yǎng)基，28°C下倒置暗培養(yǎng)17h，挑 取已經(jīng)萌發(fā)的單個(gè)冬孢子，接種至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基二8°C下倒置暗培養(yǎng)15d，將培養(yǎng)好 的絲黑穗病菌的菌落刮出，轉(zhuǎn)入2%的蔗糖溶液中下振蕩暗培養(yǎng)48h，調(diào)整菌液濃度 為 6. 2X105cfu/ml ；(2)培養(yǎng)玉米幼苗挑選發(fā)育良好玉米種子，放入鋪好濾紙的發(fā)芽盒中，噴水后放入人 工氣候箱中，20°C下進(jìn)行暗培養(yǎng)，直至芽長到3cm ；(3)接種玉米絲黑穗病菌將步驟O)中培養(yǎng)的玉米幼苗的中胚軸部位侵入步驟(1) 中制備好的玉米絲黑穗病菌菌液中，放入真空干燥器中，蓋上蓋子，打開真空泵，壓力為 6X10—2帕處理25-35min將玉米幼苗取出，接種溫度為25°C /15°C變溫處理；(4)接種后幼苗的培養(yǎng)在接種后苗移栽到土壤，保證土壤濕度穩(wěn)定在20%；(5)接種效果的檢測接種IOd后，取接種部位下Icm下的玉米莖部組織，CTAB法提取 DNA，依據(jù)玉米絲黑穗病菌基因組上SR3序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR的方法進(jìn)行接種效果的檢 測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米絲黑穗病室內(nèi)快速接種鑒定的方法，其特 征是步驟(5)中所述的引物為引物1 :5-GCAGCCTCAGCATTACTC-3 ‘，引物2 5 ‘ -ATACACCTGTGACGGCTG-3 ‘，PCR 反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性 95°C 3min,變性 95°C 30s，退火溫度 56°C 40s，延伸72°C 40s，循環(huán)37次，終延伸72°C延伸lOmin，最后4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種玉米絲黑穗病室內(nèi)快速接種鑒定的方法。本發(fā)明的方法包括(1)制備玉米絲黑穗病菌菌液(2)培養(yǎng)玉米幼苗；(3)將步驟(2)中培養(yǎng)的玉米幼苗的中胚軸部位侵入步驟(1)中制備好的玉米絲黑穗病菌菌液中，放入真空干燥器中，蓋上蓋子，打開真空泵，壓力為6X10-2帕處理25-35min將玉米幼苗取出，接種溫度為25℃/15℃變溫處理；(4)在接種后苗移栽到土壤，保證土壤濕度穩(wěn)定在20％；(5)接種10d后，取接種部位下1cm下的玉米莖部組織，CTAB法提取DNA，依據(jù)玉米絲黑穗病菌基因組上SR3序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR的方法進(jìn)行接種效果的檢測。本發(fā)明用于室內(nèi)快速接種鑒定玉米絲黑穗病。
文檔編號C12Q1/02GK102051410SQ201010246839
公開日2011年5月11日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者張亞軍, 張 林, 李新海, 王振華, 邸宏 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)