專利名稱：預(yù)防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及預(yù)防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗(細(xì) 胞苗)及其制備方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)是世界上第一水禽生產(chǎn)大國(guó)，具有得天獨(dú)厚的水域、地理資源優(yōu)勢(shì)。養(yǎng)鴨業(yè)是 我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分，在我國(guó)的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有著非常重要的地位，然而鴨病 的肆虐不但制約著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)向規(guī)?；?、集約化方向的邁進(jìn)，而且影響著我國(guó)禽類產(chǎn)品的 進(jìn)出口等國(guó)際化多邊貿(mào)易的發(fā)展，同時(shí)會(huì)給國(guó)家和地區(qū)帶來(lái)巨大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和人類生命 財(cái)產(chǎn)損失。鴨病毒性肝炎是鴨群的常見疾病，對(duì)雛鴨有著較大的危害。鴨病毒性肝炎的防 控直接影響著我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，一直以來(lái)都是我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)所關(guān)注的重中之重。鴨病毒性肝炎(Duck virus hepatitis, DVH)是由鴨甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)引起的一種雛鴨的急性高度致死性傳染病，主要侵害4周以 內(nèi)的雛鴨，特別是1周以下的雛鴨最易感染，死亡率較高。鴨病毒性肝炎為小RNA病毒科 Avihepatovirus病毒屬，無(wú)囊膜不分節(jié)段的正鏈RNA病毒，無(wú)血凝性，對(duì)酸、熱有較強(qiáng)抵抗 力。該病毒RNA全長(zhǎng)7729 7799，只有一個(gè)開放閱讀框，翻譯產(chǎn)生一個(gè)含2254aa的多 聚蛋白。因DHAV抗原性差異，DHAV可分為三個(gè)基因型，分別為DHAV-1，DHAV-2 (Taiwan) 和DHAV-3 (Korea)，三個(gè)亞型之間無(wú)血清學(xué)交叉反應(yīng)，目前在我國(guó)流行的主要為DHAV-I和 DHAV-2。目前鴨病毒性肝炎在世界多數(shù)養(yǎng)鴨國(guó)家均有發(fā)生和流行，我國(guó)許多養(yǎng)鴨的省市均 有該病的流行。對(duì)鴨病毒性肝炎的防控中，目前疫苗己研制成三種氫氧化鋁DHV雞胚化弱 毒苗(組織苗)、氫氧化鋁DHV雞胚化弱毒滅活苗(組織苗)及氫氧化鋁DHV雞胚化強(qiáng)毒滅 活苗(組織苗)。從病原入手，進(jìn)一步研究分子致病機(jī)理和病毒變異機(jī)理，開發(fā)相應(yīng)疫苗是 防控該病的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其制備方法。本發(fā)明提供了鴨甲型肝炎病毒1 型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD 株，CGMCC No. 3746。鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No. 3746是2009年4月，劉 文軍、周遠(yuǎn)成在山東省濰坊市鴨場(chǎng)的發(fā)病鴨體內(nèi)分離獲得的一株鴨病毒性肝炎I型病毒 (DHAV-I)，已于2010年4月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCCNo. 3746。鴨甲型肝炎病毒1型又稱鴨肝炎病毒1型。本發(fā)明保護(hù)鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No. 3746在制備1型鴨病毒性 肝炎疫苗(細(xì)胞苗)中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No. 3746滅活得到的1型
3鴨病毒性肝炎疫苗(細(xì)胞苗)。本發(fā)明還保護(hù)一種制備DHAV-SD株病毒液的方法，包括如下步驟將鴨甲型肝炎 病毒1型DHAV-SD株CGMCC No. 3746在宿主細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)后破碎細(xì)胞，得到的上清即為 病毒液；所述宿主細(xì)胞為BHK21細(xì)胞或DF-I細(xì)胞。所述將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No. 3746在宿主細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)后 破碎細(xì)胞，收集上清液的方法可包括如下步驟①將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No. 3746接種所述宿主細(xì)胞，進(jìn)行培 養(yǎng)后通過(guò)凍融破碎細(xì)胞，收取上清，即為生產(chǎn)用種毒；②將生產(chǎn)用種毒接種所述宿主細(xì)胞， 進(jìn)行培養(yǎng)后通過(guò)凍融破碎細(xì)胞，收取上清，即為制苗用種毒；③將制苗用種毒接種所述宿主 細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后通過(guò)凍融破碎細(xì)胞，收集上清液。所述步驟①、步驟②和步驟③中接種所述宿主細(xì)胞時(shí)MOI均可為0. 001，培養(yǎng)時(shí) 間均可為48 72小時(shí)；所述步驟①、步驟②和步驟③中培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為48小時(shí)；所述步 驟③中，可通過(guò)5000rpm (Thermo legend RT離心機(jī)，角轉(zhuǎn)子#3332)離心30 40min收集
上清液。所述宿主細(xì)胞為BHK21細(xì)胞時(shí)，在所述接種前可先進(jìn)行如下擴(kuò)增培養(yǎng)(1)將凍存的BHK21細(xì)胞37°C水浴融化，800rpm離心5min，取沉淀；用細(xì)胞培養(yǎng)液 懸浮沉淀，得到2X IO5細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，37°C,5% CO2靜置培養(yǎng)至每毫升含有1 X IO6細(xì) 胞；(2)在步驟(1)的基礎(chǔ)上消化細(xì)胞，然后重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，使每毫升含有2 X IO5細(xì) 胞，然后在如下條件下培養(yǎng)至每毫升含有IXlO6細(xì)胞pH7.4，溶解氧飽和度為50%、37°C， 100轉(zhuǎn)/min(Wheaton公司Micro-stir 磁力攪拌器，攪拌器貨號(hào)356907 ；攪拌桿貨號(hào) 356886)。所述細(xì)胞培養(yǎng)液具體可為95體積份的DMEM和5體積份的胎牛血清混合，加入雙 抗(青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml)。本發(fā)明還保護(hù)一種制備1型鴨病毒性肝炎疫苗(細(xì)胞苗)的方法，是將以上任一 所述方法制備的DHAV-SD株病毒液作為制苗用病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到1型鴨病 毒性肝炎疫苗。所述滅活的方法具體如下在所述DHAV-SD株病毒液中加入甲醛，使甲醛的體積 百分含量為0. 1%，37°C滅活24小時(shí)，得到滅活后病毒液。所述乳化的方法具體如下將3 體積份油相、1體積份水相和(質(zhì)量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的終濃度 為0.01% (質(zhì)量百分含量)，得到鴨病毒性肝炎疫苗；所述油相的制備方法如下將94體積 份白油和6體積份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂 酸鋁；所述水相的制備方法如下將4體積份吐溫-80和96體積份滅活后的病毒液混勻。本發(fā)明提供的疫苗免疫雛鴨時(shí)，采用單次免疫的方式，推薦免疫劑量為0. 2ml。本 發(fā)明提供的疫苗免疫種鴨時(shí)，采用單次免疫的方式，推薦免疫劑量為1ml。本發(fā)明提供了一株有優(yōu)良免疫原性的鴨肝炎病毒強(qiáng)毒株。將該毒株接種到敏感 細(xì)胞上，收獲細(xì)胞液，滅活后乳化，可以得到一種安全、有效、可控的鴨病毒性肝炎滅活疫苗 (細(xì)胞苗)，有利于鴨病毒性肝炎的防控。本發(fā)明可以有針對(duì)性的防治鴨病毒性肝炎的感染 與爆發(fā)，同時(shí)簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，可規(guī)模化生產(chǎn)并應(yīng)用于臨床。


圖1為DHAV PCR檢測(cè)結(jié)果；泳道1為陰性對(duì)照，2為DHAV陽(yáng)性對(duì)照，3為DHAV SD 株，4 為 Marker5000。圖2為DHAV病毒粒子電鏡觀察結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的試驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。以 下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1、鴨肝炎病毒SD毒株的發(fā)現(xiàn)和鑒定一、鴨肝炎病毒SD毒株的發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明人從野外某鴨場(chǎng)(2009年4月，在山東省濰坊市的鴨場(chǎng)，由劉文軍、 周遠(yuǎn)成發(fā)現(xiàn))的發(fā)病鴨體內(nèi)分離獲得了一株鴨病毒性肝炎I型病毒(DHAV-I)，將其命名為 DHAV-SD株，已于2010年4月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCCNo. 3746。二、鴨肝炎病毒SD毒株的鑒定1、病毒形態(tài)DHAV-SD株的病毒粒子呈二十面體對(duì)稱，直徑約40nm。電鏡觀察結(jié)果見圖2。2、分子生物學(xué)鑒定 提取DHAV-SD株的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，根據(jù)GENBANK發(fā)表的DHAV全基因序列 (FJ496340)設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物(Pl和P2)，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為348bp的目 的條帶。PCR產(chǎn)物的電泳圖見圖1。測(cè)序結(jié)果如序列表的序列1所示。結(jié)果表明DHAV-SD 毒株為DHAV陽(yáng)性。上游引物Pl :5，-CAAAGCCCATCCACTGTTTT-3，；下游引物P2 5，-CACTAGGGCTGGGTCATTGT-3，。提取DHAV-SD毒株的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行全序列測(cè)定。毒株的全序列如序列表 的序列2所示，與GENBANK發(fā)表的DHAV全基因序列具有序列差異。3、血凝性DHAV-SD株對(duì)雞、兔、豬、豚鼠紅細(xì)胞均不凝集。4、對(duì)細(xì)胞的半數(shù)感染量(TCID5tl)DHAV-SD 株第 16 代的細(xì)胞毒為 107· 1TCID5ciAiL27 代的細(xì)胞毒為 107_29TCID5(1/ml。5、對(duì)雞胚的半數(shù)感染量(EID5tl)DHAV-SD 株第 13 代的滴度為 107_25EID5。/0. 2ml。6、對(duì)雛鴨的致病力測(cè)定DHAV-SD株3代對(duì)雛鴨的致病力測(cè)定，滴度為104 45ID5(1/ml，103 9LD5(1/ml。ID50為半 數(shù)感染量，LD5tl為半數(shù)致死量。7、穩(wěn)定性將DHAV-SD株在細(xì)胞傳32代，每0. Iml病毒含量均為IO7TCID5tl以上，DHAV-SD毒株在32代以內(nèi)是穩(wěn)定的，可以作為疫苗生產(chǎn)用種毒。8、免疫原性DHAV-SD株F1 F32均具有良好的免疫原性，利于疫苗的研究。9、特異性將DHAV-SD株稀釋至104TCID5(1/ml，與等量抗鴨肝炎病毒特異性血清混合，室溫放 置1小時(shí)后，接種SPF雞胚10個(gè)，觀察120小時(shí)。在24 120小時(shí)內(nèi)不引起特異性死亡， 且至少存活8個(gè)。實(shí)施例2、鴨病毒性肝炎滅活疫苗(細(xì)胞苗)的制備一、雞胚成纖維細(xì)胞系DF-I的培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞系DF-I 購(gòu)自北京中原公司(ATCC細(xì)胞系編號(hào)為CRL_12203)。細(xì)胞培養(yǎng)液9體積份的DMEM和1體積份的FBS混合，加入雙抗(青霉素100U/ ml，鏈霉素 100U/ml)。1、細(xì)胞復(fù)蘇將DF-I細(xì)胞凍存管從液氮中取出，迅速在37°C水浴鍋中加溫，使細(xì)胞液融化。將 凍存管在臺(tái)式離心機(jī)中SOOrpm離心5min，棄上清。將細(xì)胞沉淀在3ml培養(yǎng)基中吹打均勻 (6cm直徑培養(yǎng)皿中)，放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中，37°C、5% CO2靜置培養(yǎng)。2、細(xì)胞傳代使用電動(dòng)吸引器，沿培養(yǎng)皿壁吸去廢液。PBS清洗1-2次，吸去廢液。沿培養(yǎng)皿壁 加入胰酶，37°C消化。待到細(xì)胞形態(tài)變圓，吸去胰酶，用DMEM培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，使細(xì)胞均勻 懸浮于培養(yǎng)基中，得到細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液均勻分為幾份，加入到新的培養(yǎng)皿中，加入新 的DMEM培養(yǎng)基，置于37°C培養(yǎng)。3、細(xì)胞凍存將細(xì)胞培養(yǎng)液置于離心管中，SOOrpm離心5min。小心棄上清，用細(xì)胞凍存液重 懸細(xì)胞。將重懸好的細(xì)胞分裝，每只凍存管不超過(guò)1.5ml。凍存管先置于4°C、30min，然 后-20°C、2h，然后-80°C過(guò)夜，然后放入液氮罐中保存。二、病毒液的制備和TCID5tl的測(cè)定1、病毒液的制備DHAV-SD株接種DF-I細(xì)胞；細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)(約48小時(shí))，收獲細(xì)胞液， 反復(fù)凍融3次，收取上清(病毒液)。2、病毒液的TCID5tl測(cè)定(1)準(zhǔn)備細(xì)胞取生長(zhǎng)良好的DF-I細(xì)胞，消化后用10 % FBS DMEM制備細(xì)胞懸液；調(diào)整細(xì)胞濃度 為5 X IO5個(gè)/ml，然后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0. Iml/孔。37°C、5 % CO2培養(yǎng)使其鋪滿單層。(2)準(zhǔn)備病毒將步驟1制備的病毒液進(jìn)行10倍梯度稀釋。(3)病毒液的TCID5tl測(cè)定96孔板中細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，將培養(yǎng)液吸出，加入病毒稀釋液，每個(gè)梯度8-16孔，每 孔0. lml,37°C,5% CO2培養(yǎng)96小時(shí)后觀察病變孔數(shù)并記錄。各個(gè)稀釋度的CPE結(jié)果見表 1。
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表1各個(gè)稀釋度的CPE結(jié)果
權(quán)利要求
鴨甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV SD株，其保藏號(hào)為CGMCC No.3746。
2.鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCCNo. 3746在制備1型鴨病毒性肝炎疫苗中的應(yīng)用。
3.將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCCNo. 3746滅活得到的1型鴨病毒性肝炎疫田ο
4.制備DHAV-SD株病毒液的方法，包括如下步驟將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株 CGMCC No. 3746在宿主細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)后破碎細(xì)胞，收集上清液，該上清液即為DHAV-SD株 病毒液；所述宿主細(xì)胞為BHK21細(xì)胞或DF-I細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株 CGMCC No. 3746在宿主細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)后破碎細(xì)胞，收集上清液的方法包括如下步驟①將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCCNo. 3746接種所述宿主細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后 通過(guò)凍融破碎細(xì)胞，收取上清，即為生產(chǎn)用種毒；②將生產(chǎn)用種毒接種所述宿主細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后通過(guò)凍融破碎細(xì)胞，收取上清，即為制 苗用種毒；③將制苗用種毒接種所述宿主細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后通過(guò)凍融破碎細(xì)胞，收集上清液。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟①、步驟②和步驟③中接種所述 宿主細(xì)胞時(shí)MOI均為0. 001，培養(yǎng)時(shí)間均為48 72小時(shí)；所述步驟①、步驟②和步驟③中 培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為48小時(shí)；所述步驟③中，通過(guò)5000rpm離心30 40min收集上清液。
7.如權(quán)利要求4至6中任一所述的方法，其特征在于所述宿主細(xì)胞為BHK21細(xì)胞；所 述宿主細(xì)胞在所述接種前先進(jìn)行如下擴(kuò)增培養(yǎng)(1)將凍存的BHK21細(xì)胞37°C水浴融化，800rpm離心5min，取沉淀；用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮 沉淀，得到2X IO5細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，37°C、5% CO2靜置培養(yǎng)至每毫升含有1 X IO6細(xì)胞；(2)在步驟(1)的基礎(chǔ)上消化細(xì)胞，然后重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，使每毫升含有2X IO5細(xì) 胞，然后在如下條件下培養(yǎng)至每毫升含有IXlO6細(xì)胞pH7.4，溶解氧飽和度為50%、37°C， 100 轉(zhuǎn) /min。
8.一種制備1型鴨病毒性肝炎疫苗的方法，是將權(quán)利要求4至7中任一所述方法制備 的DHAV-SD株病毒液作為制苗用病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到1型鴨病毒性肝炎疫苗。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述滅活的方法如下在所述DHAV-SD株病 毒液中加入甲醛，使甲醛的體積百分含量為0. 1%，37°C滅活24小時(shí)，得到滅活后病毒液。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述乳化的方法如下將3體積份油 相、1體積份水相和1 % (質(zhì)量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的終濃度為0.01 % (質(zhì)量百分含量)，得到鴨病毒性肝炎疫苗；所述油相的制備方法如下將94體積份白油和 6體積份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂酸鋁；所 述水相的制備方法如下將4體積份吐溫-80和96體積份滅活后的病毒液混勻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其制備方法。本發(fā)明提供了鴨甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD株，CGMCC No.3746。本發(fā)明提供的毒株為具有優(yōu)良免疫原性的鴨肝炎病毒強(qiáng)毒株。將該毒株接種到敏感細(xì)胞上，收獲細(xì)胞液，滅活后乳化，可以得到一種安全、有效、可控的鴨病毒性肝炎滅活疫苗(細(xì)胞苗)，有利于鴨病毒性肝炎的防控。本發(fā)明可以有針對(duì)性的防治鴨病毒性肝炎的感染與爆發(fā)，同時(shí)簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，可規(guī)?；a(chǎn)并應(yīng)用于臨床。
文檔編號(hào)C12N7/00GK101948809SQ20101024730
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者劉文軍, 周遠(yuǎn)成, 孫蕾, 李晶 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所