專利名稱：禽流感和新城疫混合病毒樣顆粒、制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽流感和新城疫混合病毒樣顆粒，及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian Influenza, Al)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的禽類(家禽和野禽)的一種感染和/或疾病綜合征，發(fā)生在雞、鴨、鵝、鴿子等禽類和鳥類身上，但主要侵害火雞和雞，哺乳動物如豬、馬、海豹、人等也可感染。根據(jù)禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)株的致病性、禽的種類、環(huán)境、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件以及并發(fā)疾病等因素，感染后的禽只表現(xiàn)為無癥狀感染、輕度的上呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋量下降到急性的致病性死亡等多種形式， 直接影響雞體的健康及其產(chǎn)品質(zhì)量，是現(xiàn)代化養(yǎng)禽業(yè)難以對付的重要禽類呼吸道傳染病之一，與馬立克氏病、傳染性法氏囊病、白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥等一樣，也是嚴(yán)重威脅家禽的重要免疫抑制病。被世界動物衛(wèi)生組織列為A類動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。自從1955年證實(shí)了 1878年意大利暴發(fā)的雞瘟是由A型流感病毒引起的流感以來到2001年，全球共報道了 19起高致病性禽流感疫情，其中火雞發(fā)生5起，雞14起。進(jìn)入本世紀(jì)以來，高致病性禽流感疫情也不斷發(fā)生。2001年中國香港發(fā)生H5W亞型流感；2003 年初，歐洲大陸相繼暴發(fā)禽流感，2003年2月荷蘭發(fā)生H7N7亞型、2003年4月比利時發(fā)生 H7N7亞型、2003年5月德國發(fā)生H7N7亞型禽流感。2003年末2004年初，亞洲各國相繼暴發(fā)禽流感，疫情共涉及10個國家或地區(qū)。2003年12月，韓國發(fā)生禽流感，2004年1月，日本、越南、臺灣、泰國、柬埔賽、印度尼西亞、巴基斯坦、老撾和中國等國家和地區(qū)先后發(fā)生禽流感，其中日本、臺灣發(fā)生了 H5N2亞型禽流感，其他國家和地區(qū)發(fā)生了 H5W亞型禽流感。這些疫情的暴發(fā)，不但給亞洲各國養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性打擊，而且嚴(yán)重影響到人民的身體健康， 越南、泰國等國家先后發(fā)生了禽流感感染人類，造成死亡的嚴(yán)重后果。2004年2月，禽流感又在美洲大陸發(fā)生，其中美國發(fā)生了 H7N7禽流感，4月份加拿大也發(fā)生了禽流感。目前，高致病性禽流感特別是H5W禽流感還在亞洲和北美部分國家和地區(qū)蔓延。我國目前流行的高致病性禽流感主要是H5m亞型禽流感。目前國內(nèi)生產(chǎn)的用于預(yù)防禽流感的疫苗大部份是采用傳統(tǒng)的雞胚法培養(yǎng)增殖活病毒，經(jīng)化學(xué)試劑滅活后生產(chǎn)成疫苗。這種技術(shù)又分為兩類不同的制備法一是直接用野生型病毒感染雞胚制備，另一類是先采用反向遺傳技術(shù)改造野生病毒的遺傳性，然后用“拯救”改造的新病毒來感染雞胚，增殖病毒，生產(chǎn)疫苗。這些流感疫苗制備技術(shù)有其優(yōu)點(diǎn)，但亦存在著很大的缺陷。尤其是流感病毒與眾不同的特性，例如高頻率突變，雙重及多重亞型病毒之間遺傳物質(zhì)重組及抗原漂移等—— 使這些疫苗的長期安全性及有效性受到了極大挑戰(zhàn)，甚至產(chǎn)生了 “無效疫苗”，難以應(yīng)付新的突變型流感病毒的傳染。除此以外，這些疫苗制劑還存在著以下不足(1)生產(chǎn)周期長 從獲得新的亞型病毒株到疫苗生產(chǎn)上市，耗時5-8個月，難以遏制新的疫情大爆發(fā)。(2)生產(chǎn)條件高為預(yù)防人為的污染環(huán)境及生產(chǎn)的活病毒的泄漏擴(kuò)散，整套生產(chǎn)必須按規(guī)定在生物安全三級實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，病毒的滅活必須保證完全，徹底。(3)無法區(qū)別被免疫過的雞只與受病毒感染的雞只。新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一種禽類急性、 高度傳染性疫病，對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，被世界衛(wèi)生組織(OIE)列為A類烈性傳染病。自1擬6年首發(fā)于印度尼西亞和英國新城M以來，在80多年中，新城疫已在世界上發(fā)生過三次大流行。第一次是1擬6年起源于東南亞，經(jīng)亞洲向歐洲緩慢移動，經(jīng)30年時間傳播到世界各地。第二次大流行是二十世紀(jì)六十年代末始于中東，由于家禽的集約化養(yǎng)殖和大規(guī)模世界貿(mào)易，傳播非常迅速，到1973年波及世界大多數(shù)國家，給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴(yán)重?fù)p失。第三次大流行是二十世紀(jì)七十年代末起于中東，1981年到達(dá)歐洲后迅速蔓延到世界各地，這次流行主要為嗜神經(jīng)型，是由種鴿傳播而引起的。九十年代以來，雖沒再發(fā)生世界性大流行，但局部地區(qū)的爆發(fā)和流行時常發(fā)生。新城疫病毒是單股負(fù)鏈RNA病毒中副粘病毒科(Paramyxaviridae)、副粘病毒亞科(Paramyxoviridae)的重要成員，有囊膜，完整的病毒粒子近圓形，表面有纖突。新城疫病毒的基因組長度約1. 51Λ，6個結(jié)構(gòu)基因的排列順序?yàn)?，-NP-P-M-F-HN-L-5，，NDV基因組長度嚴(yán)格遵守“六核苷酸規(guī)律”，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白即血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)、融合蛋白(F)、基質(zhì)蛋白(M)、核蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)以及RNA多聚酶(L)，其中F蛋白是主要的宿主保護(hù)性抗原之一，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)附近的氨基酸序列是決定病毒力的主要因素。疫苗免疫是控制新城疫的有效方法。目前使用的新城疫疫苗包括弱毒疫苗、滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗等?；钜呙缫话阌筛腥九吣蚰乙簝龈啥?，可大規(guī)模飲水免疫， 經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，也可用于噴霧和氣霧，但疫苗返強(qiáng)可能弓I發(fā)疾病。滅活疫苗一般是感染性尿囊液用甲醛滅活后與佐劑混合后制成的油乳劑滅活疫苗?；蚬こ虂唵挝灰呙缡抢弥亟MDNA 技術(shù)在高效表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)NDV免疫原性基因，并輔以佐劑而制成的疫苗。研究表明，用基因工程方法制成的新城疫亞單位疫苗免疫SPF雞均能誘導(dǎo)ND抗體產(chǎn)生，對致死劑量的強(qiáng)毒攻擊具有一定的保護(hù)力，但效果不如弱毒疫苗。病毒樣顆粒(VLP)是含有某種病毒的一個或多個主要結(jié)構(gòu)蛋白，在體外表達(dá)系統(tǒng)中自動組裝成的不包含病毒核酸的空心顆粒，它的形態(tài)和大小與真實(shí)的病毒粒子相同或相似，所以能有效的誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，作為一種新型疫苗顯示出了良好的應(yīng)用前景。典型的H5m AIV粒子呈球形或橢圓形，直徑80 120nm，H5m流感病毒的基因組8個基因片段共編碼11種蛋白，病毒的外殼是一層由脂質(zhì)及脂蛋白構(gòu)成的膜，包裹著病毒的遺傳物質(zhì)及核蛋白。共有4種蛋白質(zhì)，屬于病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白，它們是基質(zhì)蛋白M1， 形成病毒外殼的主體蛋白；核蛋白NP，形成病毒粒子核衣殼，參與病毒粒子形成；紅細(xì)胞凝集素HA，病毒外殼表面膜上的主要糖蛋白，共有16個亞型。是誘發(fā)宿主機(jī)體產(chǎn)生抗體的主要抗原體。神經(jīng)氨酸苷酶NA，亦是病毒外殼表面膜上的一種糖蛋白，共有9個亞型，同樣是誘發(fā)抗體產(chǎn)生的主要抗原體。流感病毒的表面膜蛋白HA和NA是引起機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要誘發(fā)物，而基質(zhì)蛋白Ml是形成病毒外殼的主體，亦可作為組織型免疫應(yīng)答的誘發(fā)物。有關(guān)的研究證明，基質(zhì)蛋白Ml的正確表達(dá)，是保證病毒外殼形成的重要環(huán)節(jié)，而膜蛋白NA的功能之一是把病毒實(shí)體從宿主細(xì)胞表面剝離下來，形成病毒顆粒，因此禽流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Ml、HA和NA是合成新型抗禽流感病毒疫苗的核心。蛋白HA、NA和Ml等3個主要結(jié)構(gòu)蛋白同時表達(dá)就可以自動組裝成空心的沒有病毒基因組的病毒樣顆粒。另外研究證明流感病毒的保守蛋白一NP 蛋白可有效刺激CTL (細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞)反應(yīng)，抑制病毒感染，在病毒樣顆粒中加入NP蛋白將會在一定程度上提高這種新型疫苗的細(xì)胞免疫水平。禽流感病毒和新城疫病毒在雞體內(nèi)互為影響，同時感染會加重病情。故有必要提供一種二價疫苗同時預(yù)防H5m禽流感和新城疫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種疫苗，該疫苗能夠同時預(yù)防H5m禽流感和新城疫。本發(fā)明的目的是通過以下內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供一種混合病毒樣顆粒包含流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml，流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA，一個融合膜蛋白，其包含新城疫病毒F蛋白的主要抗原表位的膜外域， 流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；所述含新城疫病毒F蛋白的主要表面抗原的膜外域替換流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的5’端的大致相同長度的膜外域，在所述混合病毒樣顆粒的表面上同時表達(dá)流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA和新城疫病毒的表面抗原F蛋白。本發(fā)明還提供一種禽流感和新城疫二價疫苗，包含所述的混合病毒樣顆粒和佐劑。本發(fā)明還提供一種制備所述混合病毒樣顆粒的方法。利用包含所述含有融合膜蛋白的混合病毒樣顆粒構(gòu)成的疫苗，可同時預(yù)防H5W 禽流感和新城疫，并具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和效果(l)H5m禽流感和新城疫VLP 二價疫苗能引起機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)型應(yīng)答，免疫力強(qiáng)，持續(xù)時間長，能同時預(yù)防H5m禽流感和新城疫。(2)由于病毒樣顆粒不含病毒基因組，這種空殼結(jié)構(gòu)的VLP在免疫動物體內(nèi)就不會發(fā)生病毒基因與宿主染色體基因整合，而且整個生產(chǎn)過程不接觸活的有感染力的病毒， 因此非常安全，對于流感病毒和新城疫病毒兩種病毒來說，都無病毒擴(kuò)散之虞。(3)和一般的基因工程亞單位疫苗比較，因?yàn)椴《緲宇w粒更接近天然病毒的形態(tài)和大小，能刺激機(jī)體產(chǎn)生更好的免疫反應(yīng)，免疫效果更好。(4)可區(qū)別出被人工免疫了的動物與被病毒感染的動物。病毒樣顆粒不含流感病毒NS、PB1、PB2等蛋白，因此進(jìn)行血清測試時，用VLP疫苗免疫的動物，將不會產(chǎn)生特異性抗 NS或PB的抗體，可以區(qū)分是否為野毒感染。對于新城疫來說，用F蛋白之外的任何病毒結(jié)構(gòu)蛋白如M蛋白、P蛋白等作為檢測抗原，都可以區(qū)分是否為野毒感染。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施方式，任何在本發(fā)明基本精神上的改進(jìn)或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的范圍。


圖1是用各自特異性引物PCR擴(kuò)增出的HA(a)、NA(a)、Ml (b)、NP(c)、F/HA(d)基因片段的電泳圖片。
圖2是重組昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒rBacmid-HA(/F/HA)_NA、rBacmid-Ml、 rBacmid-NP 示意圖。圖3是病毒樣顆粒western blot結(jié)果。圖4是病毒樣顆粒中的Ml蛋白和F蛋白的間接免疫熒光結(jié)果。A、M1抗體為RBITC 標(biāo)記顯示橙色熒光，C、抗F蛋白抗體為FITC標(biāo)記顯示綠色熒光，B、D為陰性對照。圖5A是蔗糖密度梯度離心純化后的病毒樣顆粒在電子顯微鏡下的圖象，圖5B是放大圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以Bac-to-Baw昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，利用H5W禽流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml、表面膜蛋HA和NA蛋白(以及任選地，核蛋白NP)，共同自動組裝構(gòu)建出H5W 禽流感病毒的病毒樣顆粒(VLP)。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建H5W禽流感病毒與新城疫病毒的二價 VLP。首先，將新城疫病毒的主要表面抗原基因F的大部分膜外域替換H5W禽流感病毒的HA蛋白基因的一部分膜外域，二者構(gòu)成融合基因(F/HA)，F(xiàn)基因位于融合基因F/HA的 5’端。一般情況下，F(xiàn)基因替換大致相等長度的HA基因的5’端序列，以保障融合基因F/ HA的長度與HA基因長度大致相等。然后，按照形成流感病毒樣顆粒的方法，將H5m禽流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml、核蛋白NP及表面膜蛋白HA和NA的基因，以及表達(dá)新城疫病毒F和流感病毒HA的融合蛋白 F/HA的基因，構(gòu)建于昆蟲桿狀病毒的載體質(zhì)粒內(nèi)，并使其重組入昆蟲桿狀病毒的遺傳物質(zhì) DNA內(nèi)，利用宿主昆蟲細(xì)胞表達(dá)這些外源蛋白，自動組裝成不含禽流感病毒遺傳物質(zhì)的病毒樣顆粒，病毒樣顆粒形成后將釋放入細(xì)胞培養(yǎng)液中。這樣形成的VLP既具有H5W禽流感病毒的主要表面抗原HA，又具有新城疫病毒的主要表面抗原F，為H5W禽流感病毒與新城疫病毒二價VLP。需要指出的是，有研究表明，不同的膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后會被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜的不同微區(qū)域，在細(xì)胞膜上的分布主要取決于膜蛋白的跨膜區(qū)和膜內(nèi)域。未經(jīng)改造的F和HA 蛋白有可能在表達(dá)后分布于細(xì)胞膜的不同微區(qū)域，因而當(dāng)未經(jīng)改造的F和HA蛋白同時表達(dá)時，他們有可能同時整合到同一 VLP，但他們在VLP中的含量和比例有很大差異。本發(fā)明將 F蛋白的部分膜外域融合到缺失部分膜外域的HA上，這樣F/HA融合蛋白和HA蛋白含有同樣的HA的部分膜外域，跨膜區(qū)和膜內(nèi)域；這樣保證F/HA融合蛋白和HA蛋白分布在同一細(xì)胞膜的微區(qū)域；因此在VLP的形成過程中，F(xiàn)/HA融合蛋白和HA蛋白非?？赡艿乇灰粯佑行У卣系絍LP上，他們在VLP中的含量和比例得到保證。另外，流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白作為二價VLP的骨架是因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)流感病毒VLP高產(chǎn)、穩(wěn)定；同時HA蛋白的整合到VLP是高效的；這樣可以保證在VLP的表面有足夠的HA蛋白，可以作為有效的疫苗使用。實(shí)施列1 :H5m的Ml、NP、HA、HA基因和融合基因F/HA的擴(kuò)增(1) H5N1亞型禽流感病毒RNA抽提和RT-PCR按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取試劑盒的使用說明書(方法)進(jìn)行。分別取250 μ L禽流感病毒H5m亞型毒株感染尿囊液和750 μ L TRIzol LS，加入1.5mL微量離心管內(nèi)，用吸管吹打充分混勻，室溫放置IOmin ；加入200 μ L氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置5分鐘后，4°C下12000rpm離心15min ；取上清于一新的滅菌1. 5mL離心管內(nèi)，加入 500 μ L異丙醇，充分混勻，室溫放置lOmin，在4°C下12000rpm離心IOmin ；傾去上清，沉淀中加入70%的乙醇750 μ L，輕輕混勻，洗滌一次，4°C下12000rpm離心15min，棄去上清，風(fēng)干；加入10 μ L用DEPC水處理的無RNA酶的三蒸水溶解病毒RNA (沉淀)，直接用于RT-PCR 或_80°C保存?zhèn)溆?。參照TaKaRa的AMV反轉(zhuǎn)錄酶的使用說明進(jìn)行，在20 μ L反應(yīng)體系中分別加入以下組分:RNA :3μ L ；5 X RT buffer :4 μ L ； dNTP :4 μ L ；RNA 酶抑制劑0. 5 μ L ；引物 UP :1μ L ；引物 DN :1μ L ； AMV :2μ L ；DEPC /K 補(bǔ)至 20 μ L0 混勻后，室溫放置 10min，42°C 保溫lh，冰浴2min，RT產(chǎn)物直接用于PCR擴(kuò)增或_20°C保存。(2)M1、NP、HA、NA 基因的 PCR 擴(kuò)增來源于(1)的RT-PCR產(chǎn)物可用于Ml、NP、HA、NA基因的擴(kuò)增。根據(jù)HA基因序列(SEQ ID NO 1)設(shè)計(jì)的1對引物，用于擴(kuò)增HA基因，其兩端分別加上了 Bio I和Nco I/酶切位點(diǎn)，位于PlO啟動子下，引物序列如下HA Xho I 5' -GCCCTCGAGATGAAGGCAATACTAGTG-3，(SEQ ID NO 11)HA Nco I :5’ -GCCCCATGGTTAAATACATATTCTGCACTG-3，(SEQ ID NO 12)根據(jù)NA基因序列(SEQ ID NO 3)設(shè)計(jì)的1對引物，用于擴(kuò)增NA基因，其兩端分別加上了 Ml I和Hind III的酶切位點(diǎn)位于Pph啟動子下，這2個引物序列分別是NA Sal I :5，-GCCGTCGACATGAATCCAAACCAAAG-3，(SEQ ID NO 13)NA Hind III:5，-GCCAAGCTTCTACTTGTCAATGGTG-3，(SEQ ID NO 14)根據(jù)Ml基因序列(SEQ ID NO 5)設(shè)計(jì)的1對引物，用于擴(kuò)增Ml基因，其兩端分別加上了 Ml I和Hind III的酶切位點(diǎn)，位于Pph啟動子下，這2個引物序列分別是MlSal I :5’ -GCCGTCGACATGAGTCTTCTAACCGAG-3，(SEQ ID NO 15)MlHind III :5，-GCCAAGCTTTCACTTGAATCGTTG-3，(SEQ ID NO 16)根據(jù)NP基因序列(SEQ ID NO 7)設(shè)計(jì)的1對引物，用于擴(kuò)增NP基因，其兩端分別加上了 Bio I和Nco I/酶切位點(diǎn)，位于PlO啟動子下，引物序列如下NP Xho I ,5' -AGTCTCGAG ATGAGTGACATCGGAGCCAT-3，(SEQ ID NO 17)NP Nco I :5’ -CATGCCATGGTTAATTGTCATACTCCTCTGCATTG-3，(SEQ ID NO 18)(3)融合基因F/HA的擴(kuò)增F/HA基因的核酸序列見SEQ ID NO 9 ；F/HA蛋白質(zhì)的氨基酸序列見SEQ ID NO 10。融合基因根據(jù)其核酸序列合成。融合基因F/HA包含新城疫F基因5’端的1-200氨基酸和H5W的HA基因的3，端185-568(共384)氨基酸。融合基因F/HA編碼584氨基酸， 其基因序列如SEQ ID NO 9所示。融合基因F/HA由人工合成。根據(jù)融合基因F/HA的序列 (SEQ ID NO :9)，設(shè)計(jì)的1對引物，用于擴(kuò)增融合基因F/HA，其兩端分別加上了 B10 I和Sph I酶切位點(diǎn)，位于PlO啟動子下，引物序列如下F/HA EcoR I :5，-CCGGAATTCATGGGCTCCAGACCTTC-3，(SEQ ID NO 19)F/HA Hind III :5，-CCCAAGCTTTTAAATGCAAATTCTGCATT-3，(SEQ ID NO 20)采用Ml、NP、HA、ΝΑ、F/HA各自特異性引物，將反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物或合成的DNA片斷直接用作PCR擴(kuò)增Ml、NP、HA、ΝΑ、F/HA基因的模板。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，94°C 變性40S，56°C退火90s，72°C延伸90s，循環(huán)30次，最后延伸lOmin, PCR產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠(含0.5ug/ml溴化乙錠，EB)電泳檢測。PCR擴(kuò)增的HA基因的長度約1. 7Kb (圖 la)，NA基因的長度約1. 35Kb (圖la)，Ml基因的長度約0. 75Kb (圖lb)，NP基因的長度約為1. 5Kb (圖Ic)，融合基因F/HA的長度約為1. 7Kb (圖Id)。所有的PCR產(chǎn)物樣品經(jīng)電泳凝膠抽提后，獲得純化的Ml、NP、HA、ΝΑ、F/HA基因DNA片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶)(ho I/+Nco I (消化 HA 片段)、Ml/Hind 111(消化 NA 片段)Jho I/Nco I (消化 NP 片段)、&il I/Hind III (消化Ml片段)Jho I和Sph I (消化F/HA片斷)37°C分別消化后，再進(jìn)一步純化，以備下一步構(gòu)建重組質(zhì)粒用。具體操作如下制備瓊脂糖凝膠含0. 5ug/ml溴化乙錠，將所有PCR樣品加入凝膠的樣品槽內(nèi)，設(shè)置電壓100V，電泳時間40min在長波紫外燈下，切下含有樣品帶的凝膠條，裝入小塑料離心管中。參照膠回收試劑盒(Qiagen公司產(chǎn)品)說明書，抽提純化M1、NP、HA、F/HA和NA基因DNA片段。經(jīng)限制性內(nèi)切酶37°C過夜消化后，用膠回收試劑盒Oliagen公司產(chǎn)品)，按照說明指導(dǎo)，離心過柱，純化回收酶切消化后的Ml、NP、 HA、ΝΑ、F/HA 片段。實(shí)施例2 構(gòu)津表汰Ml、NP、HA、ΝΑ、F/HA基因的昆蟲桿狀病毒表汰質(zhì)粒及在昆蟲細(xì)胞中合成重組的昆蟲桿狀病毒(1)構(gòu)建表達(dá)Ml和NP基因的重組質(zhì)粒昆蟲桿狀病毒質(zhì)粒Pi^astBac anvitrogen公司產(chǎn)品)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ml I/Hind III 37°c酶切3小時后，用膠回收試劑盒回收純化酶切后的質(zhì)粒PFastBac。在T4 DNA連接酶的作用下，酶切后的質(zhì)粒與酶切后的Ml DNA片段于16°C連接過夜。反應(yīng)體系如下 10XT4連接緩沖液lml，Ml酶切回收的DNA片段:3ml，酶切PFastBac質(zhì)?；厥债a(chǎn)物lul，T4 DNA連接酶lul，ddH20補(bǔ)至IOul。采用熱休克方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)入ToplO感受態(tài)細(xì)胞中加入到于一小塑料離心管中，輕輕混合后將小管置于冰上30min，轉(zhuǎn)入42°C水浴中熱休克 90s，迅速放回冰上5分鐘，向其中加入200ulLB培養(yǎng)液。37°C搖床培養(yǎng)1小時。取IOOul 菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基(含有氨芐和慶大霉素兩種抗生素)上，37°C培養(yǎng)16h，從平板上挑取陽性克隆菌落，進(jìn)行菌液PCR，抽提質(zhì)粒后用Ml I /Hind III進(jìn)行單雙酶切鑒定。DNA 序列測定后，獲得重組質(zhì)粒PFastBac-Ml。表達(dá)NP基因的重組質(zhì)粒PFastBac-NP的構(gòu)建方法同上。(2)構(gòu)建表達(dá)HA或F/HA和NA基因的重組質(zhì)粒昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒PFastBac-dual (Invitrogen公司產(chǎn)品)經(jīng)限制性內(nèi)切酶 Xho I/Ncol酶切后，在T4DNA連接酶的作用下，將被同樣的內(nèi)切酶消化后的HA基因DNA片段插入到PlO啟動子的下方，此連接產(chǎn)物隨后經(jīng)熱體克法轉(zhuǎn)導(dǎo)入ToplO感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)、抽提數(shù)個陽性克隆菌落的重組質(zhì)粒DNA，菌液PCR和)(h0 I/Nco I酶切鑒定及DNA序列測序確定無誤后，挑選其中的1個重組質(zhì)粒DNA，進(jìn)行第二次酶切。所用的限制性內(nèi)切酶為 Sal Ι/HindIIL·用同樣的內(nèi)切酶酶切NA基因DNA片段，并將其插入到重組質(zhì)粒的另一個啟動子Pph的下方，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、培養(yǎng)、抽提，獲得二度重組的質(zhì)粒。DNA測序后，即為所需的重組昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒PFastBac-dual-HA-NA。同時表達(dá)融合基因F/HA和NA基因的重組質(zhì)粒PFastBac-dual-F/HA_NA的構(gòu)建方法同上。(3)重組昆蟲桿狀病毒基因組的合成及提取將純化的重組PfatBac-Ml、PfatBac-NP、PFastBac-dual-HA-NA 禾口PFastBac-dual-F/HA-NA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入特殊的E. coli感受態(tài)細(xì)胞株DH 10 Bac細(xì)胞中 (美國hvitrogen公司產(chǎn)品)。DHlOBac細(xì)胞含有一特殊的大分子質(zhì)粒Bacmid，其內(nèi)包含有昆蟲桿狀病毒AcMNPV的全部基因組。一旦重組的表達(dá)質(zhì)粒整合入大分子質(zhì)粒Bacmid的特別位點(diǎn)后，經(jīng)3種抗菌素(慶大霉素、四環(huán)素和卡那霉素)的篩選及IPIG的誘導(dǎo)和X-Gal 底物反應(yīng)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，陽性克隆菌落呈白色，而非重組的野生菌落呈蘭色。實(shí)驗(yàn)條件均按照^witrogen公司提供的實(shí)驗(yàn)手冊指導(dǎo)而設(shè)定。挑選的陽性克隆置于3ml的LB培養(yǎng)液中(含上述3種抗生素)，經(jīng)37°C搖床培養(yǎng)M小時，按照實(shí)驗(yàn)手冊標(biāo)明的大分子質(zhì)粒 Bacmid小量制備法，提取純化帶有Ml基因、NP基因、HA-NA或F/HA-NA基因的重組大分子質(zhì)粒 Bacmid。(4)重組昆蟲桿狀病毒的制備將昆蟲細(xì)胞株sf9細(xì)胞(美國hvitrogen公司產(chǎn)品)培養(yǎng)于無血清的sf_900II 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中anvitrogen公司產(chǎn)品)，溫度設(shè)置為27 °C，根據(jù)hvitrogen公司提供的實(shí)驗(yàn)手冊，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將純化的重組大分子質(zhì)粒Bacmid與脂質(zhì)溶液 eellfectin (Invitrogen公司產(chǎn)品)混合，轉(zhuǎn)染入sf9細(xì)胞中，27°C培養(yǎng)4至5天后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3000rpm離心10分鐘收集上清液，獲得低滴度的重組昆蟲桿狀病毒，再用此上清液感染新培養(yǎng)的sf-9細(xì)胞；3天后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，即為所需的放大培養(yǎng)后的高濃度重組昆蟲桿狀病毒，命名為Bac-Ml，Bac-NP, Bac-HA-NA和Bac-F/HA_NA。對獲取的用于放大培養(yǎng)和蛋白表達(dá)的重組昆蟲桿狀病毒進(jìn)行蝕斑實(shí)驗(yàn)，確定病毒的噬斑形成單位 (plaque forming units, PFU)。1)用含10% FBS的Grace氏培養(yǎng)基將Sf9細(xì)胞傳代接種到六孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為約1 X IO6個細(xì)胞/ml，每孔加2ml (6孔板)，輕輕混勻，室溫使細(xì)胞貼壁1小時以上。2)將P3代種毒液用不含F(xiàn)BS的Grace’ s培養(yǎng)基做10倍倍比稀釋待用。3)棄去六孔板中的培養(yǎng)基，用不含血清的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次，然后將上述稀釋好的重組病毒液加入孔中，每個稀釋度做兩個復(fù)孔，室溫下感染1小時。4)制備覆蓋液(以下為一塊六孔板的量)7ml 2 X Grace氏培養(yǎng)基+140 μ 1的雙抗+7ml2%的高壓滅菌瓊脂糖凝膠+1. 4ml FBS,輕輕地混勻，然后將瓶再放置42°C水浴，病毒感染Ih后吸盡每孔中的病毒液，并快速用上述制備的覆蓋液覆蓋細(xì)胞。5)待瓊脂糖凝固后將六孔板用保鮮膜包好并置于27°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。6)加入Iml濃度為lmg/ml的中性紅，室溫孵育2小時后吸去染液，觀察到重組病毒形成的近似透明的小點(diǎn)即為空斑。計(jì)算統(tǒng)計(jì)觀察病毒空斑的形成情況(PFU)。用于放大培養(yǎng)重組桿狀病毒Bac-Ml，Bac-NP, Bac-HA-NA和Bac-F/HA-NA的細(xì)胞離心沉淀物，經(jīng)細(xì)胞裂解緩沖液處理后，4°C離心(13，OOOrpm) 10分鐘(或者將細(xì)胞在冰浴的情況下進(jìn)行超聲波破碎)，收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分析基質(zhì)蛋白Ml (或者 NP、HA、F/HA和NA蛋白)是否在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)。簡單而言，將10 μ 1上清液樣品中加入IOul的2XSDS上樣緩沖液，100°C處理5min后，IOOOOrpm離心5分鐘，將所有20ul的上清樣品加入4%-12%505-聚丙烯酰胺凝膠(11^1廿呢611公司產(chǎn)品)的點(diǎn)樣孔中。設(shè)置電泳條件為恒定電壓100V，溫度為4°C，電泳時間約3小時。待指示液溴酚蘭接近凝膠底部時，停止電泳。凝膠置于R型考馬斯亮藍(lán)染色液中，搖晃染色1小時，然后置于脫色液中脫色過夜。
實(shí)施例3 :M1、NP、HA、F/HA和NA基因在共同轉(zhuǎn)染的懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞sf_9中的表汰將200ml sf-9細(xì)胞混合液懸浮培養(yǎng)于1升體積的三角搖瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)液為無血清的sf-900II (或hvitrigen公司的Grace昆蟲培養(yǎng)基)，搖床的搖速為lOOrpm，溫度恒定于 27°C。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到 2 X 106 細(xì)胞 /ml 時，用 Bac-Ml、Bac-NP、Bac-HA-NA、Bac-F/HA-NA 昆蟲桿狀病毒共同轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞。病毒的MOI比例為3 (Bac-Ml和Bac-NP) =I(Bac-HA-NA) 1 (Bac-F/HA-NA)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)恒溫?fù)u動培養(yǎng)3天后，收集所有樣品，4°C離心30分鐘，離速為3000rpm，收集上清液。離心下來的細(xì)胞沉淀物用細(xì)胞裂解液處理后，4°C離心10分鐘， 離速10，000rpm。保留離心后的上清液。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的同時構(gòu)建合成的野生型昆蟲桿狀病毒用于轉(zhuǎn)染懸浮培養(yǎng)的sf-9細(xì)胞，MOI為5。作為設(shè)置的陰性對照，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)、樣品的收集及細(xì)胞裂解的條件與步驟與上述實(shí)驗(yàn)一樣。收集的所有樣品，用于Western blots 分析。其實(shí)驗(yàn)操作如下每個樣品(包括陰性對照)分別取10 μ 1的細(xì)胞裂解抽提液及細(xì)胞培養(yǎng)上清液，再各自加入IOul的2XSDS上樣緩沖液。100°C處理5min后，將所有20μ1 的混合樣品加入4% -12% SDS聚丙烯酰胺凝膠的點(diǎn)樣孔中。設(shè)置恒定電壓120V，溫度為 4°C，時間3小時，當(dāng)藍(lán)色指示劑溴酚蘭完全靠入凝膠底端時，停止電泳，取出凝膠。剪一張與凝膠相同大小的硝酸纖維素膜(PVDF膜)及兩張濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡5分鐘后與凝膠、濾紙一起浸入預(yù)冷2小時以上的轉(zhuǎn)移緩沖液中，按濾紙——凝膠——硝酸纖維素膜—— 濾紙的順序安裝入轉(zhuǎn)印夾。將夾中靠近凝膠的一側(cè)接負(fù)極，恒壓25V轉(zhuǎn)移電泳lh。用鑷子夾取出硝酸纖維素膜，用PBS-T漂洗液洗滌，而后轉(zhuǎn)移至5%的脫脂奶粉/PBS溶液中，搖蕩封閉1小時。用PBS-T漂洗液洗滌3次，每次3分鐘；然后將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)入一塑料袋中， 加入:3ml以1 500稀釋于5%脫脂奶粉/PBS中抗H5W禽流感病毒雞源多克隆抗體(一抗)，置于4°C平緩搖動過夜。翌日，取出纖維素膜，用PBS-T漂洗液洗滌3次，每次10分鐘， 將此硝酸纖維素膜再裝入另一新的塑料袋中，加入5ml以1 10000稀釋于5%脫脂奶粉/ PBS中的辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗雞IgG (二抗)，室溫下?lián)u動溫育lh。棄二抗，PBS-T漂洗纖維素膜3次，每次10分鐘，將漂洗后的硝酸纖維素膜移至一平皿中，加入DAB第五顯色液，可見在各自相對應(yīng)的分子量位置上，M1、NP、HA/F/HA和NA的特異性條帶。說明M1，NP， HA/F/HA和NA在轉(zhuǎn)染的懸浮培養(yǎng)的SF-9昆蟲細(xì)胞中有效地表達(dá)了。實(shí)施例4 病毒樣顆粒的純化及間接免疫熒光檢測和電鏡觀察。將上述離心收集的細(xì)胞上清液裝入13ml的超速離心管內(nèi)，稱重、平衡、封管后，放入超速離心機(jī)(Bechmem公司產(chǎn)品)內(nèi)，4°C 100, OOOrpm離心1小時，然后取出離心管，小心倒掉上清液，保留離心管底的深沉物。加入5ml的PBS，放入4°C冰箱內(nèi)，溶解M小時。次日，在另一個13ml的超速離心管內(nèi)，先小心地加入Iml 60%的庶糖溶液，然后依次加入Iml 30%及:3ml 20%的庶糖溶液，最后將5ml的溶解后的樣品液置于其上。精確稱重、平衡后， 封管上超速離心機(jī)。4°C 100，OOOrpm離心1小時。取出離心管，分別收集位于20%與30% 及30%與60%濃度交界處的二條帶，即純化的病毒樣顆粒。Weatern blots分析純化濃縮后的病毒樣顆粒樣品。其操作步驟與上述實(shí)施例3中Western blots分析一樣，只是將所取的樣品進(jìn)行了稀釋，即1μ 1的病毒樣顆粒樣品，加入9ul的水，再加入IOul的2XSDS上樣緩沖液。100°C變性5min后，上樣入4% -12%聚丙烯酰氨凝膠樣品槽內(nèi)，Western blots 結(jié)果顯示，從這二條帶所獲得的大分子顆粒，的確是由Ml、NP、HA/F/HA和NA構(gòu)成的病毒樣
10顆粒。尤其是從30%與60%濃度交界處取得的似病毒顆粒含量大，特異性條帶濃度深。說明轉(zhuǎn)染后，病毒樣顆粒在宿主細(xì)胞中有效地自我組裝，并釋放入細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，進(jìn)一步的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和電鏡結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)(圖4、圖5)。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)操作步驟如下將sf9細(xì)胞種到M孔板中，每孔10萬細(xì)胞，實(shí)施例3的操作步驟，對所種細(xì)胞進(jìn)行感染，感染72小時后，用PBS將細(xì)胞洗滌3次，每次5 分鐘，然后加入100%預(yù)冷的甲醇-20°固定細(xì)胞10分鐘，再加入0.05%的1Triton χ-100 室溫處理10分鐘，加入3%的BSA四度封閉過夜，第二天用PBS將細(xì)胞洗滌3次，每次5分鐘，然后向孔中加入RBITC標(biāo)記的A型流感特異的Ml單克隆抗體，或者FITC標(biāo)記的抗新城疫病毒F蛋白的單抗，37°反應(yīng)1小時，反應(yīng)結(jié)束后用PBS將細(xì)胞洗滌3次，每次5分鐘，洗滌結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察。用抗Ml的單抗和F的單抗進(jìn)行免疫電鏡觀察，可以看到熒光標(biāo)記的病毒樣顆粒，其中抗Ml的抗體為RBITC標(biāo)記，顯示橙色熒光(圖4Α)，抗F的抗體為FITC標(biāo)記，顯示綠色熒光(圖4C)，而對照沒有熒光信號((圖4B、D)。電鏡拍片實(shí)驗(yàn)操作如下將少量的純化濃縮后的似病毒顆粒樣品固定處理后，置于新制備的無負(fù)荷的塑膠/碳包被網(wǎng)絡(luò)格上，用數(shù)滴蒸餾水輕輕沖洗幾次后，加上2%磷鎢酸鈉溶液進(jìn)行負(fù)染色。電子透視顯微鏡下觀察并拍片，如圖5所示，病毒樣顆粒的外觀及體積大小相近。實(shí)施例5 :H5N1禽流感和新城疫二價VLP免疫SPF雞60只SPF雞購自廣東溫氏食品集團(tuán)SPF雞場，各組免疫動物具體免疫實(shí)施方式見表1。2周齡的SPF雞在免疫后21天翼靜脈采血，常規(guī)分離血清。分別用H5W全病毒滅活抗原和新城疫病毒滅活抗原(購自哈爾濱獸醫(yī)研究所)，采用血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測血清中H5W禽流感抗體和新城疫抗體，參照甘孟侯000 方法進(jìn)行進(jìn)行。結(jié)果表明，H5N1禽流感和新城疫二價VLPs免疫2周齡SPF雞，免疫雞血清中既有抗H5W禽流感的抗體，也產(chǎn)生了新城疫病毒的HI抗體(表2)。 表1 H5m豬流感和新城疫二價VLP免疫SPF雞實(shí)驗(yàn)方案
組別接種材料實(shí)驗(yàn)動物數(shù)(只)1VLP+油佐劑(約1 μ g HA/只)202H5N1滅活病毒+油佐劑(約1 μ g HA/只)203新城疫滅活病毒+油佐劑204PBS+油佐劑20只表2 H5N1禽流感和新城疫二價VLP免疫SPF雞血清HI檢測結(jié)果
組別樣本數(shù)H5N1禽流感HI抗體(2n)新城疫HI抗體(2n)1206. 57. 22206. 3<2320<27. 5420<2<權(quán)利要求
1.混合病毒樣顆粒，其特征在于，包含流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml ；流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA ；一個融合膜蛋白，其包含新城疫病毒F蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；所述含新城疫病毒F蛋白的主要表面抗原的膜外域替換流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的5’端的大致相同長度的膜外域；在所述混合病毒樣顆粒的表面上同時表達(dá)流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA和新城疫病毒的表面抗原F蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的混合病毒樣顆粒，其中所述混合病毒樣顆粒還含有流感病毒的神經(jīng)氨酸苷酶NA。
3.如權(quán)利要求1或2所述的混合病毒樣顆粒，其中所述混合病毒樣顆粒還含有流感病毒的核蛋白NP。
4.如權(quán)利要求1所述的混合病毒樣顆粒，其中融合膜蛋白的序列如SEQID N0:10
5.禽流感和新城疫二價疫苗，其特征在于，包含如權(quán)利要求1-4所述的混合病毒樣顆粒和佐劑。
6.制備混合病毒樣顆粒的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟構(gòu)建昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體，其表達(dá)載體含有流感病毒的基質(zhì)蛋白M1，流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA，或一個融合膜蛋白，其包含新城疫病毒F蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；所述含新城疫病毒F蛋白的主要表面抗原的膜外域替換流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的5’端的大致相同長度的膜外域；用所述構(gòu)建的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體按比例同時感染昆蟲細(xì)胞，包裝出混合病毒樣顆粒，其表面上同時表達(dá)流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA和新城疫病毒的表面抗原F蛋白。
7.如權(quán)利要求6制備混合病毒樣顆粒的方法，其特征在于，其中所述構(gòu)建昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體還含有流感病毒的神經(jīng)氨酸苷酶NA，其包裝出混合病毒樣顆粒含有流感病毒的神經(jīng)氨酸苷酶NA。
8.如權(quán)利要求6或7制備混合病毒樣顆粒的方法，其特征在于，其中所述構(gòu)建昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體還含有流感病毒的核蛋白NP，其包裝出混合病毒樣顆粒含有流感病毒的核蛋白NP。
全文摘要
本發(fā)明提供混合病毒樣顆粒包含流感病毒的基質(zhì)蛋白M1，流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA，一個融合膜蛋白，其包含新城疫病毒F蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；所述含新城疫病毒F蛋白的主要表面抗原的膜外域替換流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的5’端的大致相同長度的膜外域；在所述混合病毒樣顆粒的表面上同時表達(dá)流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA和新城疫病毒的表面抗原F蛋白。本發(fā)明還提供禽流感和新城疫二價疫苗，包含所述的混合病毒樣顆粒和佐劑。本發(fā)明還提供制備混合病毒樣顆粒的方法。
文檔編號C12N15/866GK102373183SQ20101024867
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者劉大才, 曹永長, 薛春宜 申請人:中山大學(xué)