專利名稱：一種蘇子種培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
一種蘇子種培養(yǎng)基及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物培養(yǎng)基，具體地說，是一種蘇子種培養(yǎng)基及其在新生和格 特隱球菌鑒定中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
新生隱球菌主要感染免疫抑制人群，感染率約為5 10% ；為HIV感染患者最常 見的致病真菌，感染率可高達30% ；常引起腦膜腦炎、肺部感染。格特隱球菌主要感染免疫正常人群，主要引起肺部感染、腦膜腦炎，其中部分亞型 如VGII，可引起區(qū)域性的暴發(fā)流行，發(fā)病率為平常的10 30倍。鑒定新生和格特隱球菌，多采用植物的種子或其他部分制作培養(yǎng)基，以及一些 用化學試劑制作的培養(yǎng)基，包括多巴培養(yǎng)基、咖啡酸培養(yǎng)基。其中常用的植物種子包括 ^MIl (Guizotia abyssinica) > ^f ^lff (Brassica juncea)、jft 巾·豐公白勺禾中 (Pinus hal印ensis)、刺毛黎豆(Cowitch seed)、葵花籽(sunflower)等。常用的植物的其他部分 包括指甲花葉(Lawsonia inermis)、黑莓果實(blackberry)、紅辣椒(red hot pepper)、煙 草(tobacco)等。這些培養(yǎng)基均不同程度的存在以下問題1.由植物葉子或新鮮果實為原料的培養(yǎng)基，如指甲花葉、黑莓果實等，其原料不能 長期保存，必需用新鮮的原料；2.部分原料如刺毛黎豆、黑莓果實、紅辣椒、煙草為原料制作的培養(yǎng)基顏色很深， 不易于菌株顏色的早期快速分辨；3.部分原料不易在市場上直接獲得，如小葵子、地中海松的種子、刺毛黎豆、指甲 花葉等；4.價格相對昂貴，如煙草等；5.未對新生和格特隱球菌中的所有分子類型進行鑒定的評價。中國專利公開號CN1092468A，
公開日1994年9月21日，發(fā)明創(chuàng)造的名稱為新生 隱球菌的鑒定方法及其所用的培養(yǎng)基，該發(fā)明公開了一種新生隱球菌的鑒定方法及其所用 的培養(yǎng)基，可以在一種培養(yǎng)基上同時檢測新生隱球菌的兩種生物特性。中國專利公開號 CN101724682A，
公開日2010年6月9日，發(fā)明創(chuàng)造的名稱為一種快速檢測新型隱球菌的染 色液和方法，該發(fā)明公開了一種快速檢測新型隱球菌的染色液和方法，能夠快速靈敏的檢 測新型隱球菌。但是關(guān)于蘇子(紫蘇或白蘇)種培養(yǎng)基及其用途目前還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種由植物種子為原料制作的能夠 快速、簡便的鑒定新生和格特隱球菌的培養(yǎng)基。本發(fā)明的第二個目的是提供了一種蘇子種培養(yǎng)基的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種蘇子種培養(yǎng)基，用蘇子種子、瓊脂和水配制而成。所述，每升培養(yǎng)基中含有蘇子種子提取物按蘇子種子原材料計30-70克，瓊脂 15-20 克。所述蘇子種子原材料50克，瓊脂18克。所述蘇子種子是白蘇種子或紫蘇種子。所述蘇子種子是紫蘇種子。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種蘇子種培養(yǎng)基，在鑒定致病真菌新生和格特隱球菌中應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點在于1.培養(yǎng)基所用原材料蘇子種子和瓊脂容易獲得，價格低廉，培養(yǎng)基采用傳統(tǒng)方法 可以制得，所得培養(yǎng)基易于保存。2.本發(fā)明對蘇子種培養(yǎng)基發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。3.經(jīng)大量真菌鑒定實驗研究證明，蘇子種培養(yǎng)基能夠快速鑒定新生和格特隱球 菌，鑒別特異性高，鑒定效果良好。

附圖1是在蘇子種培養(yǎng)基上格特隱球菌WM178 (Cg)和白念珠菌ATCC10231 (Ca)的 菌落顏色和形態(tài)。附圖2是不同時間段產(chǎn)生色素的菌株數(shù)及其所占比例的條狀圖。
具體實施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例1取50g蘇子種子(紫蘇)在中藥粉碎機中粉碎Imin后，加IL蒸餾水煮沸20min， 4層紗布濾過后，加入18g瓊脂，補足水份至1L。培養(yǎng)基于121°C下滅菌15min，制得蘇子種
培養(yǎng)基。實施例2取30g蘇子種子(紫蘇)在中藥粉碎機中粉碎Imin后，加IL蒸餾水煮沸20min， 4層紗布濾過后，加入15g瓊脂，補足水份至1L。培養(yǎng)基于121°C下滅菌15min，制得蘇子種
培養(yǎng)基。實施例3取40g蘇子種子(紫蘇)在中藥粉碎機中粉碎Imin后，加IL蒸餾水煮沸20min， 4層紗布濾過后，加入16g瓊脂，補足水份至1L。培養(yǎng)基于121°C下滅菌15min，制得蘇子種
培養(yǎng)基。實施例4取60g蘇子種子(紫蘇)在中藥粉碎機中粉碎1. 5min后，加IL蒸餾水煮沸30min， 4層紗布濾過后，加入18g瓊脂，補足水份至1L。培養(yǎng)基于121°C下滅菌15min，制得蘇子種
培養(yǎng)基。實施例5
取70g蘇子種子(紫蘇)在中藥粉碎機中粉碎2min后，加IL蒸餾水煮沸30min， 4層紗布濾過后，加入20g瓊脂，補足水份至1L。培養(yǎng)基于121°C下滅菌15min，制得蘇子種
培養(yǎng)基。實施例6取40g蘇子種子(紫蘇)在中藥粉碎機中粉碎Imin后，加IL蒸餾水煮沸25min， 4層紗布濾過后，加入20g瓊脂，補足水份至1L。培養(yǎng)基于121°C下滅菌15min，制得蘇子種
培養(yǎng)基。實施例7取70g蘇子種子(紫蘇)在中藥粉碎機中粉碎2min后，加IL蒸餾水煮沸30min， 4層紗布濾過后，加入15g瓊脂，補足水份至1L。培養(yǎng)基于121°C下滅菌15min，制得蘇子種
培養(yǎng)基。實施例8取50g蘇子種子(白蘇)在中藥粉碎機中粉碎Imin后，加IL蒸餾水煮沸20min， 4層紗布濾過后，加入18g瓊脂，補足水份至1L。培養(yǎng)基于121°C下滅菌15min，制得蘇子種
培養(yǎng)基。實施例9取30g蘇子種子(白蘇)在中藥粉碎機中粉碎Imin后，加IL蒸餾水煮沸20min， 4層紗布濾過后，加入15g瓊脂，補足水份至1L。培養(yǎng)基于121°C下滅菌15min，制得蘇子種
培養(yǎng)基。實施例10取40g蘇子種子(白蘇)在中藥粉碎機中粉碎Imin后，加IL蒸餾水煮沸20min， 4層紗布濾過后，加入16g瓊脂，補足水份至1L。培養(yǎng)基于121°C下滅菌15min，制得蘇子種
培養(yǎng)基。實施例11培養(yǎng)基對致病真菌的鑒定效果試驗處理A 蘇子種培養(yǎng)基(采用實施例1制備)。B 小葵子培養(yǎng)基取50g小葵子在中藥粉碎機中粉碎Imin后，加IL蒸餾水煮沸20min，4層紗布濾 過后，加入18g瓊脂，補足水份至1L。培養(yǎng)基于121°C下滅菌15min，制得小葵子培養(yǎng)基。C 葵花子培養(yǎng)基取50g葵花子在中藥粉碎機中粉碎Imin后，加IL蒸餾水煮沸20min，4層紗布濾 過后，加入18g瓊脂，補足水份至1L。培養(yǎng)基于121°C下滅菌15min，制得葵花子培養(yǎng)基。待測菌株92株新生和格特隱球菌，包括新生隱球菌VNI基因型(34株)、VNB基 因型(3株)、VNII基因型(4株)、VNIII基因型(6株)、VNIV基因型(6株)；格特隱球菌 包括VGI基因型(19株)、VGII基因型(6株)、VGIII基因型(8株)、VGIV基因型(6株)； 其他相似致病酵母菌包括羅倫隱球菌(3株)、淺白隱球菌(3株)、白念珠菌(6株)、都柏 林念珠菌(2株)、熱帶念珠菌(3株)、近平滑念珠菌(5株)、季也蒙念珠菌(4株)、皺落念 珠菌(2株)、克柔念珠菌(2株)、光滑念珠菌(2株)、西弗念珠菌(1株)、法碼念珠菌(1
5株)、葡萄牙念珠菌(1株)、產(chǎn)膜念珠菌(1株)。測試前，受試菌株在28°C條件下，YPD培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2天。取1環(huán)菌分別接種于 上述3種培養(yǎng)基，置28 °C下培養(yǎng)至48h，在3h、6h、12h、24h和48h 5個時間點上觀察色素的 生成情況。測試結(jié)果所有除新生和格特隱球菌外的其他受試酵母菌在3種培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 天均不變色。與小葵子和葵花子培養(yǎng)基上新生和格特隱球菌產(chǎn)生棕褐色色素不同，在蘇子 種培養(yǎng)基上，該菌產(chǎn)生的色素為紅棕色。附圖1為蘇子種培養(yǎng)基上格特隱球菌WM178 (Cg) 和白念珠菌ATCC10231 (Ca)的菌落顏色和形態(tài)。經(jīng)卡方配對檢驗，結(jié)果顯示，在3h時，蘇子 種培養(yǎng)基上菌株的顯色比例與小葵子培養(yǎng)基有顯著差異(P = 0.016)，與葵花子無顯著差 異(P = 0. 250)；在6h時，蘇子種培養(yǎng)基上菌株的顯色比例與小葵子和葵花子培養(yǎng)基均有 顯著差異(P = 0. 031)。在12、24、48h時間段，均無統(tǒng)計學差異。不同時間段產(chǎn)生色素的菌 株數(shù)及其所占比例見表1，表1數(shù)據(jù)總結(jié)后的條狀圖見附圖2。表1和圖2顯示本研究發(fā)明的蘇子種培養(yǎng)基在早期(3h、6h)2個時間段發(fā)生變色 的菌株百分比明顯高于其余2種培養(yǎng)基。其中3h時，與小葵子培養(yǎng)基具有顯著差異；在6h 時，與小葵子和葵花子均有顯著差異。實施例12試驗處理A 蘇子種(紫蘇)培養(yǎng)基(采用實施例1制備)。B 蘇子種(白蘇)培養(yǎng)基(采用實施例8制備)。待測菌株92株新生和格特隱球菌，包括新生隱球菌VNI基因型(34株)、VNB基 因型(3株)、VNII基因型(4株)、VNIII基因型(6株)、VNIV基因型(6株)；格特隱球菌 包括VGI基因型(19株)、VGII基因型(6株)、VGIII基因型(8株)、VGIV基因型(6株)； 其他相似致病酵母菌包括羅倫隱球菌(3株)、淺白隱球菌(3株)、白念珠菌(6株)、都柏 林念珠菌(2株)、熱帶念珠菌(3株)、近平滑念珠菌(5株)、季也蒙念珠菌(4株)、皺落念 珠菌(2株)、克柔念珠菌(2株)、光滑念珠菌(2株)、西弗念珠菌(1株)、法碼念珠菌(1 株)、葡萄牙念珠菌(1株)、產(chǎn)膜念珠菌(1株)。測試前，受試菌株在28°C條件下，YPD培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2天。取1環(huán)菌分別接種于 上述2種培養(yǎng)基，置28 °C下培養(yǎng)至48h，在3h、6h、12h、24h和48h 5個時間點上觀察色素的 生成情況。測試結(jié)果顯示無論在顯色深度，還是在變色時間上，紫蘇種培養(yǎng)基對新生和格特 隱球菌的鑒定效果均明顯優(yōu)于白蘇。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種蘇子種培養(yǎng)基，其特征在于，所述的蘇子種培養(yǎng)基用蘇子種子、瓊脂和水配制而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘇子種培養(yǎng)基，其特征在于，每升培養(yǎng)基中含有蘇子種子提 取物按蘇子種子原材料計30-70克，瓊脂15-20克。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蘇子種培養(yǎng)基，其特征在于，所述的蘇子種子原材料50克，瓊 脂18克。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的蘇子種培養(yǎng)基，其特征在于，所述的蘇子種子是白蘇 種子或紫蘇種子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蘇子種培養(yǎng)基，其特征在于，所述的蘇子種子是紫蘇種子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的蘇子種培養(yǎng)基，其特征在于，在鑒定致病真菌新生和 格特隱球菌中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蘇子種培養(yǎng)基，所述的蘇子種培養(yǎng)基是用蘇子種子、瓊脂和水配制而成。所述，每升培養(yǎng)基中含有蘇子種子提取物按蘇子種子原材料計30-70克，瓊脂15-20克。本發(fā)明還提供了一種蘇子種培養(yǎng)基的用途。本發(fā)明優(yōu)點在于培養(yǎng)基所用原材料蘇子種子和瓊脂容易獲得，價格低廉，培養(yǎng)基采用傳統(tǒng)方法可以制得，所得培養(yǎng)基易于保存。對蘇子種培養(yǎng)基發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。經(jīng)大量真菌鑒定實驗研究證明，蘇子種培養(yǎng)基能夠快速鑒定新生和格特隱球菌，鑒別特異性高，鑒定效果良好。
文檔編號C12Q1/04GK101974608SQ201010248930
公開日2011年2月16日 申請日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者馮曉博, 姚志榮 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院