專利名稱：一種豬蛔蟲性別表達差異的miRNA、相應(yīng)的前體、反義寡核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寄生蟲學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬蛔蟲性別表達差異的 miRNA、相應(yīng)的前體、反義寡核苷酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬蛔蟲(Ascaris smim)是豬體內(nèi)最常見的寄生蟲之一。豬蛔蟲病流行廣泛，是危 害廣、造成嚴重經(jīng)濟損失、呈全球性分布的一大類寄生蟲，對養(yǎng)殖業(yè)危害尤為嚴重。雖 然豬蛔蟲感染通常并不致命，但由此導(dǎo)致的飼養(yǎng)豬營養(yǎng)不良及幼齡豬發(fā)育不良給農(nóng)業(yè)和 畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。而長期過度的使用抗蠕蟲藥物已造成呈全球性分布的寄生蟲 抗藥性問題以及動物產(chǎn)品及環(huán)境中的藥物殘留問題。因此，加快對豬蛔蟲的研究、尋找 有效防治豬蛔蟲的新途徑已經(jīng)迫在眉睫。miRNA是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA，廣泛存在于真核生物中，具有發(fā)育階段 的特異性、時序性或者組織特異性的表達特點，其功能主要為從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的水平調(diào)節(jié) 個體生長及發(fā)育相關(guān)基因表達。研究業(yè)已表明，寄生線蟲存在獨特的miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控 機制，它們可以通過miRNA實現(xiàn)對宿主和自身基因表達模式的精確調(diào)控，從而提高感染 和自身增殖的幾率并逃避免疫監(jiān)視。通過選擇性地抑制或阻斷某一特定發(fā)育期線蟲的發(fā) 育，從而減少或阻斷寄生線蟲的傳播很可能是防治線蟲感染的新思路、新途徑。豬蛔蟲 物種特異性miRNA有可能成為豬蛔蟲免疫預(yù)防或化學(xué)防治的新的“關(guān)鍵”分子，為核酸 疫苗制備提供基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的抗蠕蟲藥物造成的寄生蟲抗藥性問題，以及動物 產(chǎn)品和環(huán)境中的藥物殘留問題，提供一種豬蛔蟲性別表達差異的miRNA、相應(yīng)的前體、 反義寡核苷酸。本發(fā)明另一目的在于提供上述豬蛔蟲性別表達差異的miRNA、相應(yīng)的前體、反 義寡核苷酸的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)一種豬蛔蟲性別表達差異的miRNA，其核苷酸序列為SEQ ID NO 1 3所示 的任意一條序列，其中，SEQ ID NO 1所示序列為miR-1，SEQ IDNO 2所示序列為 miR-2, SEQ ID NO 3 所示序列為 miR_3。與所述豬蛔蟲性別表達差異的miRNA相應(yīng)的前體，其核苷酸序列如SEQ IDNO 4 6所示。與所述豬蛔蟲性別表達差異的miRNA相應(yīng)的反義寡核苷酸，其核苷酸序列如 SEQ ID NO 7 9 所示。其中，所述反義寡核苷酸為DNA或RNA。
作為一種優(yōu)選方案，所述反義寡核苷酸為經(jīng)過修飾的反義寡核苷酸，如硫代修 飾或甲氧基修飾。本發(fā)明所提供的豬蛔蟲性別表達差異的miRNA前體基因在馬來 布魯線蟲(bragia malayi)染色體上的定位分別是，miR-1前體基因定位于 gi|154235311|gb|AAQA01000505.1| 22866 22942 +77 (nt) ； miR-2 前體基因定位 于 gi|154235343|gb|AAQA01000473.1| 4581 4661 -81 (nt) ； miR_3 前體基因定位于 gi|154235359|gb|AAQA01000457.1| 25285 25373 -89 (nt)。據(jù)此，本發(fā)明所提供的三種新型miRNA均克隆自豬蛔蟲成蟲，成熟的miRNA 序列長度為20 23nt，其前體序列均可形成miRNA前體的典型二級結(jié)構(gòu)，符合miRNA 的結(jié)構(gòu)特征。熒光實時定量PCR檢測結(jié)果表明，三種新型miRNA在豬蛔蟲雌蟲和雄蟲 中均有表達，但是在雌蟲中表達量明顯高于雄蟲，在雌蟲中miRNA-1的相對表達量為雄 蟲的2.7倍；在雌蟲中miRNA-2的相對表達量為雄蟲的33.7倍；在雌蟲中miRNA_l的 相對表達量為雄蟲的2.69倍；說明三種新型miRNA分子在豬蛔蟲中具有重要的生物學(xué)功 能，并且其功能與豬蛔蟲性別密切相關(guān)。因此，在豬蛔蟲體內(nèi)過表達miR-1 miR-3前 體分子或采用miRNA反義寡核苷酸抑制miR-1 miR_3的表達將影響豬蛔蟲生理功能及 與性別發(fā)育或性別分化相關(guān)的功能。此外，鑒于豬蛔蟲和人蛔蟲的物種相似性，本發(fā)明 所提供的三種新型miRNA前體及其反義寡核苷酸亦可應(yīng)用于影響人蛔蟲生理功能及與性 別發(fā)育或性別分化相關(guān)的功能。因此，本發(fā)明所述的miRNA、相應(yīng)的前體或反義寡核苷 酸可以用于制備蛔蟲疫苗，特別是豬蛔蟲疫苗或人蛔蟲疫苗。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明豬蛔蟲性別表達差異的miRNA均克隆自豬蛔蟲成蟲，在豬蛔蟲雌蟲和雄 蟲中均有表達，但在雌蟲中的表達量顯著高于雄蟲，可以用于制備蛔蟲疫苗，在豬蛔蟲 中具有重要的生物學(xué)功能，并且其功能與豬蛔蟲性別密切相關(guān)，因此可以用于影響人蛔 蟲生理功能或與性別發(fā)育、分化相關(guān)的功能。


圖1為熒光定量PCR檢測豬蛔蟲miRNA在不同性別中的表達情況。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例ImiRNA的獲得1.總 RNA 抽提1)豬蛔蟲成蟲整體稱重，用液氮研磨組織至粉末，加入lOOmg/mL加入 Trizol(Invitrogen)溶液，吹打混勻，使組織充分裂解，靜置5min ；2)取裂解液Iml加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機相充分接 觸，室溫靜置15min;3)4°C下，10,000g離心15min，可見分為三層，RNA在上層水相，移至另一個 新的 RNase free EP 管；
4)沉淀RNA:加入0.5ml異丙醇，輕柔地充分混勻，室溫靜置IOmin ；5)4°C下，10,000g離心lOmin，收集RNA沉淀，去上清；6)用75%乙醇洗滌兩次，超凈臺風干；7)加入15 60 μ 1 DEPC水溶解沉淀。2.總RNA純度和完整性檢測1)純度檢測取1 μ 1 RNA樣品50倍稀釋，在BioPhotometer plus核酸蛋白測定 儀上測定OD值，OD260/C)D280的比值大于1.8。2)總RNA完整性檢測取RNA樣品1 μ 1，1 %瓊脂糖凝膠電泳80VX 20min， 用凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA條帶，三條條帶完整。3.small RNA序列的獲得和篩選用 15% PAGE 膠回收 20-30nt 的 small RNA,加上 5 ‘和 3 ‘接頭(購自 Illumina 公司)后實施RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司)。產(chǎn)物經(jīng)6 % TBE PAGE膠 純化后進行Solexa測序。然后屏蔽掉可能為接頭序列的部分、測序質(zhì)量差的序列(例如 測序信號很低等)及長度小于18nt的序列獲得cleanreads。4.miRNA 的鑒定用BLAST 程序(NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)將 clean reads 與 GenBank 禾口 Rfam database (version 9.0) (http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/mirna)進 亍比對分 析，去除非編碼 RNA 序列，包括 rRNA，tRNA, snRNA, snoRNA,禾Π other ncRNA ； 通過RepeatMasker (http://www.repeatmasker.org)去除轉(zhuǎn)座子等重復(fù)序列；然后搜索 Sanger miRBase (version 13.0)數(shù)據(jù)庫去除保守性 miRNA ； clean reads 用 Short Oligo nucleotideAnalysis Package(SOAP)程序?qū)⑹Ｓ嘈蛄卸ㄎ坏今R來布魯線蟲基因組(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)上；能夠完全匹配的未知 small RNA 用于 miRNA 預(yù)測。 預(yù)測使用 Mfold (http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold)軟件進行。同時滿足如下 條件的small RNA被鑒定為miRNA ①miRNA定位在前體結(jié)構(gòu)的某一個臂上，并且前體結(jié)構(gòu)自由能低于-ISkcal/ mol ；②以miRNA為中心的25nt序列中，錯配數(shù)小于2 ；③前體結(jié)構(gòu)的頸上沒有大的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。共獲得3條新的miRNA，及其前體RNA序列。miRNA分別命名為miR-1 miR-3。三種新型miRNA前體均可以形成miRNA前體的典型的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。染色體定位分析表明，miR-1前體基因定位于gi|154235311|gb |AAQA01000505.1| 22866 22942 +77 (nt) ； miR-2 前體基因定位于 gi|154235343|gb|AAQA01000473.1| 4581 4661 -81 (nt) ； miR-3 前體基因定位于 gi|154235359|gb|AAQA01000457.1| 25285 25373 -89 (nt)。實施例2熒光定量PCR分析三種新型miRNA在不同性別豬蛔蟲中的表達反應(yīng)體系如下cDNA(l 20)5.0 μ 1上游引物0.5 μ 1下游引物0.5 μ 1
2x SYBR Green PCR MasterMixH20總體積反應(yīng)條件如下
10 μ 1 4.0 μ 1
95°C 5min.
95 °C 15s，
40 cycles
65 °C 30s
^ 72°C 32s 讀板;融解曲線分析溫度60°C -950C。每個樣重復(fù)3次。定量PCR 用的 SYBR Green PCR Master Mix 購自 TOYOBO 公司定量PCR 儀ABI PRISM 7500Sequence Detection System內(nèi)參片段為β-actin。實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明，miR-1 miR-3三種新型miRNA在豬蛔蟲
雌蟲和雄蟲中均有表達，但是在雌蟲中表達量明顯高于雄蟲在雌蟲中miRNA-1的相對 表達量為雄蟲的2.7倍；在雌蟲中miRNA-2的相對表達量為雄蟲的33.7倍；在雌蟲中 miRNA-1的相對表達量為雄蟲的2.69倍(圖1)；說明三種新型miRNA分子在豬蛔蟲中 具有重要的生物學(xué)功能，并且其功能與豬蛔蟲性別密切相關(guān)。因此，在豬蛔蟲體內(nèi)過表 達miR-1 miR-3前體分子或采用miRNA反義寡核苷酸抑制miR-1 miR_3的表達將 影響豬蛔蟲生理功能及與性別發(fā)育或性別分化相關(guān)的功能。鑒于豬蛔蟲和人蛔蟲的物種 相似性，本發(fā)明所提供的三種新型miRNA前體及其反義寡核苷酸亦可應(yīng)用于影響人蛔蟲 生理功能及與性別發(fā)育或性別分化相關(guān)的功能。此外，為了提高反義寡核苷酸的作用和細胞內(nèi)的穩(wěn)定性，上述豬蛔蟲三種新型 miRNA的反義寡核苷酸可以是DNA或RNA，還可以對反義寡核苷酸進行硫代、甲氧基 等修飾。
權(quán)利要求
1.一種豬蛔蟲性別表達差異的miRNA，其核苷酸序列為SEQ ID NO 1 3所示的任意一條序列。
2.權(quán)利要求1所述豬蛔蟲性別表達差異的miRNA相應(yīng)的前體，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4 6所示。
3.權(quán)利要求1所述豬蛔蟲性別表達差異的miRNA相應(yīng)的反義寡核苷酸，其核苷酸序 列如SEQ IDNO 7 9所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬蛔蟲性別表達差異的miRNA相應(yīng)的反義寡核苷酸，其特 征在于所述反義寡核苷酸為DNA或RNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豬蛔蟲性別表達差異的miRNA相應(yīng)的反義寡核苷酸，其特 征在于所述反義寡核苷酸為經(jīng)過修飾的反義寡核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬蛔蟲性別表達差異的miRNA相應(yīng)的反義寡核苷酸，其特 征在于所述修飾為硫代修飾或甲氧基修飾。
7.權(quán)利要求1 6中任意一條權(quán)利要求所述的miRNA、相應(yīng)的前體或反義寡核苷酸 在制備蛔蟲疫苗中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的miRNA、相應(yīng)的前體或反義寡核苷酸在應(yīng)用，其特征在于 所述miRNA、相應(yīng)的前體或反義寡核苷酸用于制備豬蛔蟲疫苗或人蛔蟲疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬蛔蟲性別表達差異的miRNA、相應(yīng)的前體、反義寡核苷酸及其應(yīng)用。本發(fā)明豬蛔蟲性別表達差異的miRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO1～3所示的任意一條序列；與本發(fā)明豬蛔蟲性別表達差異的miRNA相應(yīng)的前體序列如SEQ ID NO4～6所示；與本發(fā)明豬蛔蟲性別表達差異的miRNA相應(yīng)的反義寡核苷酸序列如SEQ ID NO7～9所示。本發(fā)明豬蛔蟲性別表達差異的miRNA均克隆自豬蛔蟲成蟲，在豬蛔蟲雌蟲和雄蟲中均有表達，但在雌蟲中的表達量顯著高于雄蟲，可以用于制備蛔蟲疫苗。
文檔編號C12N15/113GK102010863SQ201010250378
公開日2011年4月13日 申請日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者劉春艷, 宋慧群, 徐民俊, 朱興全, 林瑞慶, 袁子國, 賀現(xiàn)輝 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)