專利名稱：海洋擬諾卡氏菌株HY-G及其產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種海洋擬諾卡氏菌菌株HY-G，本發(fā)明還涉 及該菌株的產(chǎn)酶方法及其所產(chǎn)生的葡萄糖苷酶。
背景技術(shù)：
β -葡萄糖苷酶(EC3. 2. 1. 21)，是一類能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β -葡萄 糖苷鍵，同時釋放出β -D-葡萄糖和相應(yīng)的配基的水解酶類。β -葡萄糖苷酶廣泛地存在于自然界許多動植物和微生物體內(nèi)。β “葡萄糖苷酶 的相對分子量范圍一般在40 250KDa之間。目前絕大多數(shù)生物所產(chǎn)生的β _葡萄糖苷酶 最適PH都在酸性范圍，并且變化不大，一般在3. 5-5. 5之間，僅有少數(shù)β -葡萄糖苷酶最適 PH在中性或堿性范圍內(nèi)。β-葡萄糖苷酶的最適溫度在40 110°C之間都有分布。β -葡萄糖苷酶具有多方面的用途。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，由于天然藥物中含有種類 眾多的苷類成分，其中有很大一部分都屬于葡萄糖苷類。研究發(fā)現(xiàn)，天然藥物活性成分 去除葡萄糖基后，往往能提高藥效，因此，采用β _葡萄糖苷酶進(jìn)行天然藥物活性成分 的生物轉(zhuǎn)化受到重視，該方法具有反應(yīng)條件溫和、特異性高、污染少等優(yōu)點。在食品工業(yè)，
葡萄糖苷酶作為一種風(fēng)味酶，可用于果汁風(fēng)味成分的改善、果酒和茶葉等飲料的增香 等；此外，葡萄糖苷酶還在纖維素的水解、醫(yī)學(xué)診斷、植物病害防治等方面有著重要的 價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的能產(chǎn)β _葡萄 糖苷酶的海洋擬諾卡氏菌HY-G (Nocardiopsis sp. HY-G)。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供了上述海洋擬諾卡氏菌 HY-G(Nocardiopsis sp. HY-G)產(chǎn)β -葡萄糖苷酶的方法及產(chǎn)品。本發(fā)明所涉及的菌株是海洋擬諾卡氏菌HY-G(Nocardiopsis sp. HY-G)，該海洋擬 諾卡氏菌HY-G已于2010年5月27日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為 CCTCC NO =M 2010126 ；保藏單位地址中國.武漢.武漢大學(xué)，電話027_68754052。以下對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的闡述。一、本發(fā)明所涉及的培養(yǎng)基。1、固體培養(yǎng)基(固體海水高氏一號培養(yǎng)基)，其組成如下20g可溶性淀粉；Ig KNO3 ；0. 5g K2HPO4 ；0. 5g MgSO4 · 7H20 ；0. Olg FeSO4 · 7H20 ；IOOOmL 海水。其制法是將上 述成分用海水溶解后，再用NaOH調(diào)節(jié)初始pH至7. 6-7. 8，然后加入15g瓊脂，121°C滅菌 15-20min,即得固體培養(yǎng)基。用于初次平板涂布分離時，還需在調(diào)節(jié)pH值之前加入0. 03% 的重鉻酸鉀以抑制樣品中真菌和細(xì)菌的生長。2、液體發(fā)酵培養(yǎng)基(液體海水高氏一號培養(yǎng)基)，其組成如下20g可溶性淀粉； Ig KNO3 ；0. 5g K2HPO4 ；0. 5g MgSO4 · 7H20 ；0. Olg FeSO4 · 7H20 ；IOOOmL 海水。其制法是將
3上述成分用海水溶解后得混合物，然后按大豆異黃酮苷混合物=150 200mg/L的比例 向混合物中加入大豆異黃酮苷作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物(以誘導(dǎo)其產(chǎn)葡萄糖苷酶)，再用NaOH 調(diào)節(jié)初始PH至7. 6-7. 8，121°C滅菌15-20min，即得液體發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明所述的產(chǎn)酶 誘導(dǎo)物大豆異黃酮苷為由染料木苷、大豆苷和黃豆黃苷組成的混合物，該混合物中，含大豆 苷46. 80% (重量百分比)、染料木苷12. 98%、黃豆黃苷23. 73%，其中的黃豆黃苷對本發(fā) 明的菌株HY-G的產(chǎn)酶無誘導(dǎo)作用。也可以采用市售的其它比例的大豆異黃酮苷，優(yōu)選其中 含大豆苷40-50%，染料木苷10-15%，其余為黃豆黃苷。二、本發(fā)明海洋擬諾卡氏菌HY-G(Nocardiopsis sp. HY-G)(以下簡稱菌株HY-G) 的分離。1、樣品的采集與處理。海洋潮間帶沉積物樣品采自河北省樂亭縣溧河入?？冢帽欣鋮s帶回實驗室 后，立即進(jìn)行微生物分離。分離時，稱取Ig泥樣加入到裝有99mL無菌海水的錐形瓶中，震 蕩30min，使泥樣與無菌海水充分混合，即成10_2倍稀釋度泥樣稀釋液，再對其做10_3、10_4、 10_5倍的梯度稀釋。2、菌株的分離。用無菌移液器吸取0.2mL各個稀釋度的稀釋液，加至含有固體培養(yǎng)基的平板上， 然后用無菌玻璃涂棒將稀釋均勻涂布在整個平板上。將各稀釋度平板于28°C的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)10天左右。待平板上長出放線菌菌落后，挑取單菌落的菌體、氣生菌絲或孢子，進(jìn)行平板劃線 法分離，然后將平板倒置于28°C恒溫箱中培養(yǎng)。通過反復(fù)的劃線分離，通過培養(yǎng)形態(tài)和光學(xué) 顯微鏡鏡檢觀察，各菌落形態(tài)一致，即純化得到單一菌株。采用上述方法，分離得到包括菌株HY-G在內(nèi)的數(shù)十種海洋放線菌菌株。三、菌株HY-G的16S rRNA基因分子生物學(xué)鑒定用上海賽百盛 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，-20°C保存?zhèn)?用。PCR引物為通用引物，序列為F27(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)；R1492(5，-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，)；PCR 反應(yīng)體系(50 μ 1) =Tag 酶 0· 25 μ 1 ；Buffer (Mg2+free) 5 μ 1 ；Mg2+ 溶液 3 μ 1 ； dNTP 4μ1;模板DNA 1 μ 1 ；引物F27和引物R1492各1 μ 1。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 2min，然后94°C變性30s、55°C退火45s、72°C延伸45s (循環(huán)33次)，最后72°C延伸7min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，然后用江蘇碧云天 DNA凝膠回收試劑盒回收。將純化 后的PCR產(chǎn)物送到上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果通過與GenBank上的序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)與擬諾卡氏菌 Nocardiopsis tangguensis等菌株相似度較高，選擇相似度> 98%的8株擬諾卡氏菌，并 以Macrococcus bovicus、Sporosarcina ureae等菌株為夕卜群，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如

圖1所 示。由圖1中可以看出，菌株HY-G與擬諾卡氏菌聚集在一起，表明屬于擬諾卡氏菌屬；其中 與Nocardiopsis tangguensis>Nocardiopsis aegyptia聚成一簇，說明與這些菌株親緣關(guān) 系較近。四、菌株HY-G所產(chǎn)生的β -葡萄糖苷酶。
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1、酶的產(chǎn)生方法與酶活力測定1. 1發(fā)酵采用搖瓶發(fā)酵法，在250mL三角瓶中加入IOOmL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按照 接種量為的比例接種海洋擬諾卡氏菌株HY-G的孢子懸液，孢子懸液的濃度為106/mL ； 然后在23 38°C的培養(yǎng)溫度下、在60 120轉(zhuǎn)/分鐘的搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)72h，得發(fā)酵液；1. 2粗酶液的制備取上述發(fā)酵液在8000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，收獲菌體；菌體 用0. Olmol/L.pH 6. 8的Tris-HCl緩沖溶液洗滌2次并離心后，加入適量的上述Tris-HCl 緩沖溶液重新懸浮菌體，在0°C冰浴的條件下，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體細(xì)胞，得菌體 破碎液；取菌體破碎液在12000轉(zhuǎn)/分鐘下離心20分鐘除去菌體碎片，所得上清液即為粗 酶液。1. 3酶活力測定(以糖苷型大豆異黃酮為底物)用0. Olmol/L、pH 6. 8Tris_HCl 緩沖溶液將大豆異黃酮苷配成濃度為lOmg/mL的底物溶液(由于大豆異黃酮苷的溶解性較 小，可加適量乙醇助溶)。取粗酶液和底物溶液按照1 1的比例混合，40°C下反應(yīng)2h后， 加2倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，取萃取物20yL作薄層層析(TLC)。展開劑為氯仿甲 醇(10 7)，展開約6cm，揮干溶劑，用雙波長薄層掃描儀掃描，根據(jù)斑點面積的積分值計算 酶活力。薄層掃描測定方法采用反射單波長鋸齒掃描法，測定波長為260nm，光斑大小為 0. 07X0. 07mm。所得到的測定數(shù)據(jù)通過儀器自帶的CS-9301PC軟件進(jìn)行底線校正、峰面積 計算等處理，得出大豆異黃酮苷元的峰面積值。本發(fā)明所述的粗酶液可以采用以下方法進(jìn)行分離純化(1)取粗酶液，加入硫酸銨至40%飽和度，離心去除沉淀得上清液；用1. 7mol/L硫 酸銨溶于0. Olmol/L、pH 6. 8的Tris-HCl緩沖溶液中制成平衡緩沖溶液，然后用平衡緩沖 溶液平衡Phenyl-S印harose柱，再用平衡過的Phenyl-S印harose柱吸附上清液中的蛋白， 用含0. 34mol/L硫酸銨的0. Olmol/L、pH 6. 8的Tris-HCl緩沖溶液洗脫去除雜蛋白，再用 0. Olmol/L、pH 6. 8的Tris-HCl緩沖溶液洗脫得到初步純化的β -葡萄糖苷酶液；(2)用 0. 01mol/L、pH 6. 8 的 Tris-HCl 緩沖溶液平衡 DEAE-Sephrose 柱，然后取 初步純化的β-葡萄糖苷酶液用DEAE-S印hrose柱吸附，通過梯度洗脫得到純化的β-葡 萄糖苷酶。以上所得到的純化的β-葡萄糖苷酶還可以采用以下方法進(jìn)一步純化先用 0. 01mol/L、pH 6. 8的Tris-HCl緩沖溶液平衡Superdex 200凝膠色譜柱；然后對純化的 β -葡萄糖苷酶進(jìn)行透析處理后用Superdex 200HR凝膠色譜柱吸附，再用0. Olmol/L、pH 6. 8的Tris-HCl緩沖溶液洗脫，收集A28tl最大吸收峰并檢測活性，活性組分即為進(jìn)一步純化 的葡萄糖苷酶。2產(chǎn)酶條件2. 1培養(yǎng)基對產(chǎn)酶的影響2. 1. 1培養(yǎng)基中碳源對產(chǎn)酶的影響以不含可溶性淀粉的海水高氏一號液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入的10° 麥芽汁、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥麩作為碳源，氮源為0. 的硝酸鉀，按照1. 2的發(fā)酵 方法進(jìn)行培養(yǎng)48h后測定其酶活力。結(jié)果如下表所示。不同碳源對大豆異黃酮苷水解酶產(chǎn)酶的影響
權(quán)利要求
一種海洋擬諾卡氏菌株HY G(Nocardiopsis sp.HY G)CCTCC NOM 2010126。
2.一種如權(quán)利要求1所述的海洋擬諾卡氏菌株HY-G CCTCC N0:M2010126產(chǎn)0 -葡萄 糖苷酶的方法，其特征在于其步驟如下(1)發(fā)酵采用搖瓶發(fā)酵法，在250mL三角瓶中加入100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按照接種 量為的比例接種海洋擬諾卡氏菌株HY-G的孢子懸液，孢子懸液的濃度為106/mL ；然后 在23 38°C的培養(yǎng)溫度下、在60 120轉(zhuǎn)/分鐘的搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)72h，得發(fā)酵液；(2)粗酶液的制備取上述發(fā)酵液在8000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，收獲菌體；菌體用 0. 01mol/L、pH 6. 8的Tris_HCl緩沖溶液洗滌2次并離心后，加入適量的上述Tris_HCl緩 沖溶液重新懸浮菌體，在0°C冰浴的條件下，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體細(xì)胞，得菌體破 碎液；取菌體破碎液在12000轉(zhuǎn)/分鐘下離心20分鐘除去菌體碎片，所得上清液即為粗酶 液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的粗酶液采用以下方法進(jìn)行分離純化(1)取粗酶液，加入硫酸銨至40%飽和度，離心去除沉淀得上清液；用1.7mol/L硫酸 銨溶于0. Olmol/L、pH 6. 8的Tris_HCl緩沖溶液中制成平衡緩沖溶液，然后用平衡緩沖溶 液平衡Phenyl-S印harose柱，再用平衡過的Phenyl-S印harose柱吸附上清液中的蛋白， 用含0. 34mol/L硫酸銨的0. Olmol/L、pH 6. 8的Tris_HCl緩沖溶液洗脫去除雜蛋白，再用 0. Olmol/L、pH 6. 8的Tris_HCl緩沖溶液洗脫得到初步純化的3 -葡萄糖苷酶液；(2)用0.01mol/L、pH 6. 8的Tris_HCl緩沖溶液平衡DEAE-S印hrose柱，然后取初步 純化的葡萄糖苷酶液用DEAE-S印hrose柱吸附，通過梯度洗脫得到純化的0 -葡萄糖 苷酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所得到的純化的葡萄糖苷酶采用以 下方法進(jìn)一步純化先用0. 01mol/L,pH 6. 8的Tris-HCl緩沖溶液平衡Superdex 200HR凝 膠色譜柱；然后對純化的葡萄糖苷酶進(jìn)行透析處理后用Superdex 200HR凝膠色譜柱吸 附，再用0. Olmol/L、pH 6. 8的Tris-HCl緩沖溶液洗脫，收集A28(1最大吸收峰并檢測活性， 活性組分即為進(jìn)一步純化的_葡萄糖苷酶。
5.一種如權(quán)利要求4所述的方法所述的葡萄糖苷酶，其特征在于所產(chǎn)葡萄糖 苷酶的酶學(xué)性質(zhì)為所述擬諾卡氏菌HY-G產(chǎn)生的葡萄糖苷酶屬于胞內(nèi)酶，其分子量為 43 45kDa ；該酶在以p-NPG為底物時，測得在pH 6. 0-9. 0有酶活力，其中在pH 7.0-8.0 時酶活力強(qiáng)；該酶在40-60°C下具有有酶活性；Fe2+、Mg2+、Pb2+、Na\ Fe3+對該酶活性有促進(jìn) 作用，其中Fe2+、Fe3+促進(jìn)作用強(qiáng)，Ca2+、Zn2+、Ag+、Cu2+、K+對該酶活性有抑制作用，其中Zn2+、 Ag+、Cu2+抑制作用強(qiáng)。全文摘要
本發(fā)明是一種海洋擬諾卡氏菌株HY-G(Nocardiopsis sp.HY-G)CCTCCNOM 2010126。本發(fā)明還公開了海洋擬諾卡氏菌株HY-G CCTCC NOM2010126產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的方法及產(chǎn)品；所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶屬于胞內(nèi)酶，其分子量為43～45kDa；該酶在以p-NPG為底物時，測得在pH 6.0-9.0有酶活力，其中在pH 7.0-8.0時酶活力強(qiáng)；該酶在40-60℃下具有有酶活性；Fe2+、Mg2+、pb2+、Na+、Fe3+對該酶活性有促進(jìn)作用，其中Fe2+、Fe3+促進(jìn)作用強(qiáng)，Ca2+、Zn2+、Ag+、Cu2+、K+對該酶活性有抑制作用，其中Zn2+、Ag+、Cu2+抑制作用強(qiáng)。
文檔編號C12N9/42GK101942406SQ201010251259
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月12日
發(fā)明者吳少杰, 暴增海, 焦豫良, 王淑軍, 王淑芳, 陳麗, 馬桂珍 申請人:淮海工學(xué)院