專利名稱：重組鼠李糖乳桿菌工程菌株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及提高抗氧化能力的重組鼠李糖乳桿 菌工程菌株及其制備方法。
背景技術(shù)：
乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)是能夠發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì) 菌的泛稱，是國(guó)際公認(rèn)的一大類益生菌，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品已經(jīng)成為最主要的功能性食品。乳 酸菌大多數(shù)屬于兼性厭氧細(xì)菌，生長(zhǎng)過(guò)程一般不需要氧氣，而且氧氣的存在可能對(duì)其造成 危害。氧化脅迫主要來(lái)自于各種活性氧品種(Reactive oxygen spicies，R0S)，包括超氧 陰離子(02_)、過(guò)氧化氫(H202)、羥基自由基(·0Η)等，ROS能夠破壞蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞膜等 生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞衰亡，其中· OH危害性最大。在進(jìn)化過(guò)程中，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了各種抗氧化酶類，其中最重要的是超氧化物歧 化酶(Superoxide dismutase, SOD)和過(guò)氧化氫酶(Catalase, CAT)，前者能夠降解02_，后 者能夠清除H2O2，最終阻止· OH的積累，保護(hù)細(xì)胞不受氧化壓力的危害。然而，大多數(shù)乳桿 菌屬缺乏超氧化物歧化酶基因，只有少數(shù)菌種含有過(guò)氧化氫酶基因，因而耐氧化壓力弱。研究表明，鼠李糖乳桿菌是一種典型的具有益生功能的乳桿菌，其染色體上不含 有CAT和SOD基因，抗氧化脅迫能力較弱，作為一種常用的功能性乳酸菌，在發(fā)酵產(chǎn)品加工 過(guò)程中會(huì)受到各種氧化條件的危害，造成產(chǎn)品品質(zhì)下降。近年來(lái)，通過(guò)導(dǎo)入外源基因的方法提高受體菌株抗氧化能力的技術(shù)飛速發(fā)展。人 們將來(lái)自于植物乳桿菌、清酒乳桿菌、枯草桿菌和嗜熱鏈球菌中的CAT基因和SOD基因轉(zhuǎn)入 各種耐氧能力弱的乳酸菌受體中，成功提高了這些乳酸菌的抗氧化水平，在鼠李糖乳桿菌 中卻并未報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組載體，攜帶有細(xì)菌過(guò)氧化氫酶基因和超氧化物歧化 酶基因，能夠表達(dá)出過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶。所述過(guò)氧化氫酶基因克隆自清酒乳桿菌，所述超氧化物歧化酶基因克隆自嗜熱鏈 球菌。所述超氧化物歧化酶基因還包括其自身啟動(dòng)子。所述PCR擴(kuò)增過(guò)氧化氫酶基因的引物為5，-CATGCCATGGCAAATCAACTAACGACT-3， 和5，-CCGCTCGAGAAAATAGGTGTCCCAAAC-3 ’ ；所述PCR擴(kuò)增超氧化物歧化酶基因的引物為 5’ -CCGCTCGAGCAAGATTTTGTAAG-3 ‘和 5’ -GGGGTACCTGAGGATGATTCTAGAC-3 ’。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組鼠李糖乳桿菌工程菌株，該菌株含有能表達(dá) 過(guò)氧化氫化酶和超氧化物歧化酶的重組載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組鼠李糖乳桿菌工程菌株的制備方法，包括如 下步驟
1)通過(guò)PCR的方法分別從清酒乳桿菌和嗜熱鏈球菌的基因組中擴(kuò)增過(guò)氧化氫酶 基因和超氧化物歧化酶基因片段；2)將擴(kuò)增得到的過(guò)氧化氫酶基因和超氧化物歧化酶基因串聯(lián)構(gòu)建到大腸桿 菌-乳桿菌穿梭質(zhì)粒載體pSIP502(Sorvig et al. ,2003)上，獲得重組質(zhì)粒；3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)大腸桿菌并提取質(zhì)粒；4)通過(guò)電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到鼠李糖乳桿菌AS 1. 2466。其中鼠李糖乳桿菌 AS 1. 2466為中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心中國(guó)科學(xué)院微生物研究所保藏的標(biāo)準(zhǔn)菌 株，保藏號(hào)為CGMCC 1.2466T。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的重組鼠李糖乳桿菌在發(fā)酵食品工業(yè)上的應(yīng)用。本發(fā)明提供的含有katA和sodA共整合重組質(zhì)粒的鼠李糖乳桿菌能顯著提高該鼠 李糖乳桿菌的耐H202毒性的能力。經(jīng)過(guò)測(cè)定，轉(zhuǎn)入katA重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)入katA和sodA共整 合重組質(zhì)粒的鼠李糖乳桿菌在6mM H202處理lh后的存活率分別為81. 5%和100%，比含有 空白對(duì)照質(zhì)粒的鼠李糖乳桿菌的存活率高出近一千倍；而轉(zhuǎn)入共整合質(zhì)粒PSIPCS的鼠李 糖乳桿菌在更高濃度的H202處理之后的存活率比只含有CAT的鼠李糖乳桿菌又高出100多 倍。同時(shí)，轉(zhuǎn)入katA和sodA共整合重組質(zhì)粒的鼠李糖乳桿菌，能在通氣的培養(yǎng)條件下有更 多的活菌數(shù)，存活的天數(shù)也更長(zhǎng)，大大提高了抗氧化能力。


圖1所示為重組質(zhì)粒pSIPCAT和pSIPCS的構(gòu)建示意圖。圖中A 大腸桿菌-乳桿 菌穿梭質(zhì)粒PSIP502 ；B 重組質(zhì)粒pSIPCAT ；C 共整合重組質(zhì)粒pSIPCS。圖2所示為鼠李糖乳桿菌中重組質(zhì)粒pSIPCS雙酶切鑒定。圖中A為Ncol/Xhol 雙酶切鑒定katA基因。M，DL15000 ;1，PCR擴(kuò)增katA基因；2，質(zhì)粒pSIPCS的雙酶切。B為 Xhol/Kpnl雙酶切鑒定sodA基因。M，DL15000 ；1，PCR擴(kuò)增sodA基因；2，質(zhì)粒pSIPCS的雙 酶切。圖3所示為重組鼠李糖乳桿菌菌體降解過(guò)氧化氫的檢測(cè)。圖中1為轉(zhuǎn)入對(duì)照載體 PSIPCK的鼠李糖乳桿菌菌體；2為轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pSIPCAT的鼠李糖乳桿菌菌體；3為轉(zhuǎn)入共 整合重組質(zhì)粒pSIPCS的鼠李糖乳桿菌菌體。圖4所示為長(zhǎng)期通氣條件下重組鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)情況。圖中□表示含有重組質(zhì) 粒pSIPCAT的鼠李糖乳桿菌； 表示含有對(duì)照載體pSIPCK的鼠李糖乳桿菌。圖5所示為低糖培養(yǎng)基中重組鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)情況。圖中A表示含有共整合重 組質(zhì)粒pSIPCS的鼠李糖乳桿菌； 表示含有重組質(zhì)粒pSIPCAT的鼠李糖乳桿菌。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1攜帶有目的基因katA的質(zhì)粒載體的構(gòu)建1. 1清酒乳桿菌基因組DNA提取基因組提取采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，方法如下(1)取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的清酒乳桿菌菌液5ml，12000rpm離心1分鐘，棄去上清，加入 200 u 1 TES重懸一次，12000rpm離心1分鐘，盡量吸去上清；(2)加入180 u 1溶菌酶(20mg/ml)，37°C水浴處理1小時(shí);(3)加入20 u 1 RNase (10mg/ml)，輕微震蕩15秒，室溫放置5分鐘；(4)加入20iU蛋白酶K溶液，輕輕混勻；(5)加入220 u 1緩沖液GB，振蕩15秒，70°C水浴處理10分鐘，簡(jiǎn)短離心去除管蓋 和內(nèi)壁的水珠；(6)加入220 u 1無(wú)水乙醇，充分混勻15秒，簡(jiǎn)短離心；(7)將上一步所得溶液和絮狀沉淀轉(zhuǎn)移到吸附柱CB3中，套上收集管，12000rpm離 心30秒，倒掉廢液；(8)向吸附柱中加入500 u 1緩沖液GD，12000rpm離心30秒，倒掉廢液；(9)向吸附柱中加入700 ill漂洗液PW，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，再加入 500 u 1漂洗液PW洗滌一次；(10)將吸附柱放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，置于室溫放置數(shù)分 鐘，徹底晾干吸附材料中的殘余漂洗液；(11)將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50iU經(jīng) 65-70°C預(yù)熱的洗脫緩沖液TE，室溫放置5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心 管，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取結(jié)果，并保存于-20°C備用。1. 2PCR擴(kuò)增過(guò)氧化氫酶基因片段katA上游引物5，-CATGCCATGGCAAATCAACTAACGACT-3’；
下游引物5，-CCGCTCGAGAAAATAGGTGTCCCAAAC-3，。上下游引物中分別引物了 Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)，即序列中帶橫線的部分。PCR反應(yīng)程序_組分加量(單位ii 1)_清酒乳桿菌基因組DNA 1上游引物(10iiM)0.5下游引物(10iiM)0.5dNTPs(10mM each)0.5Ex Taq 酶0.510 X反應(yīng)緩沖液2無(wú)菌雙蒸水15_PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 5min，94°C變性 60s，58°C退火 30s，72°C延伸 60s，72°C終延伸 lOmin， 共30個(gè)循環(huán)。1. 3katA 連接到質(zhì)粒 pSIP502
PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pSIP502經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切，酶切體系見下表
權(quán)利要求
一種重組載體，其特征在于，攜帶有細(xì)菌過(guò)氧化氫酶基因和超氧化物歧化酶基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其特征在于，所述超氧化物歧化酶基因包含自身 啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其特征在于，所述過(guò)氧化氫酶基因克隆自清酒乳 桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組載體，其特征在于，所述超氧化物歧化酶基因克隆自 嗜熱鏈球菌。
5.含有權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的重組載體的鼠李糖乳桿菌工程菌株。
6.權(quán)利要求5所述的重組鼠李糖乳桿菌工程菌株的制備方法，包括如下步驟1)通過(guò)PCR的方法分別從清酒乳桿菌和嗜熱鏈球菌的基因組中擴(kuò)增過(guò)氧化氫酶基因 和超氧化物歧化酶基因；2)將擴(kuò)增得到的過(guò)氧化氫酶基因和超氧化物歧化酶基因串聯(lián)構(gòu)建到大腸桿菌_乳桿 菌穿梭質(zhì)粒載體PSIP502上，獲得重組質(zhì)粒；3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)大腸桿菌并提取質(zhì)粒；4)通過(guò)電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到鼠李糖乳桿菌中。
7.權(quán)利要求5所述的重組鼠李糖乳桿菌工程菌株在發(fā)酵食品工業(yè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組鼠李糖乳桿菌工程菌株及其制備方法，該鼠李糖乳桿菌工程菌株攜帶有串聯(lián)的過(guò)氧化氫酶基因和超氧化物歧化酶基因的表達(dá)載體。該工程菌株的制備方法包括如下步驟1)通過(guò)PCR的方法分別從清酒乳桿菌和嗜熱鏈球菌的基因組中擴(kuò)增過(guò)氧化氫酶基因和超氧化物歧化酶基因片段；2)設(shè)計(jì)特定的限制性酶切位點(diǎn)，串聯(lián)構(gòu)建到大腸桿菌-乳桿菌穿梭質(zhì)粒載體pSIP502上；3)通過(guò)電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到鼠李糖乳桿菌中。通過(guò)本發(fā)明制備的重組鼠李糖乳桿菌工程菌株能顯著提高抗氧化能力，能應(yīng)用于發(fā)酵食品工業(yè)中。
文檔編號(hào)A23L1/00GK101948856SQ20101025423
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者安浩然, 羅云波, 郝彥玲 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)