專利名稱：一種檢測黃牛AdPLA基因單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測，特別涉及 一種檢測黃牛AdPLA基因第23076位單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替 換而引起的多態(tài)性。因此，通常所說的SNPs包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝 數(shù)的變化。一個SNP表示在基因組某個位點上有一個核苷酸的變化，主要由單個堿基的轉(zhuǎn) 換或者顛換所引起；具有轉(zhuǎn)換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫 去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的SNPs，根據(jù)它們在 基因組中分布的位置可分為基因編碼區(qū)SNPs (cSNPs)、基因周邊SNPs (pSNPs)和基因間 SNPs(iSNPs)等三類。總的說來，cSNP比較少，因為在外顯子內(nèi)的變異率僅占周圍序列的 1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關(guān)注。根據(jù)對遺傳性狀的影響， cSNPs又可分為兩種一種是同義cSNPs，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的 蛋白質(zhì)中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含義”相同；另一種是非同義cSNPs，即堿 基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋 白質(zhì)的功能。雖然同義突變未能改變目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，但有研究顯示同義突變會 影響目的蛋白質(zhì)的翻譯效率，進而對基因功能產(chǎn)生重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究 中，這些SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。由于SNPs是二等位基因分子標記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs 可能是由2個、3個或4個等位基因構(gòu)成，但實際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見， 故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標記。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn) SNPs 即DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核 苷酸連接反應等。在這些SNP檢測技術(shù)中，DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法， 但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非 常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗，所以，DNA序列測定法不是一種應用于生產(chǎn)實際的理想SNP檢 測方法；當然，利用PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是， PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非 理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應用領(lǐng)域中具 有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時， 檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應用的特點；而引物延伸法和寡核苷 酸連接反應技術(shù)檢測SNP位點，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測 平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。PCR-RFLP方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點后使用限制性內(nèi)切酶進行切割，然后進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。PCR-RFLP方 法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢 測的序列位點無特殊性要求。在脊椎動物，甘油三酯貯存在脂肪細胞內(nèi)的脂滴中。脂滴是一種亞細胞結(jié)構(gòu)，是體 內(nèi)最重要的能量貯庫。白色脂肪的主要作用是從貯存的甘油三酯中釋放能量供給其他組織 利用。脂肪特異性磷脂酶 A2 (adipose-specific phospholipase A2，AdPLA，也叫 PLA2G16， HRASLS3, HREV107, HREV107-3, MGCl 18754 或者 H-REV107-1)只在脂肪組織中進行高表達， 屬于胞內(nèi)鈣依賴性PLA2超家族中的一員，PLA2超家族的酶能夠催化磷脂中sn-2位脂肪酸 的水解。另外，磷脂的sn-2位脂肪酸通常都是花生四烯酸或者其他不飽和脂肪酸，PLA2酶 是催化類花生酸類物質(zhì)產(chǎn)生的限速酶。類花生酸類物質(zhì)，比如PG(前列腺素)是局部信號轉(zhuǎn) 導的介質(zhì)，調(diào)控著許多已知的生理學系統(tǒng)。這些信號分子發(fā)揮自分泌、旁分泌或兩者兼有途 徑，通過增強或抑制結(jié)合特異性G蛋白受體來發(fā)揮眾多的生物學效應，包括通過調(diào)節(jié)cAMP 的水平來調(diào)控脂解作用。因為AdPLA是脂肪組織中最主要的PLA2酶，它通過PGE2以自分 泌和旁分泌的途徑來調(diào)節(jié)脂肪水解。盡管高脂肪飲食或L印tin缺失條件下，缺失AdPLA小 鼠能通過PGE2-EP3-CAMP通路來調(diào)節(jié)脂肪水解從而抑制肥胖。目前，對于AdPLA基因的研究多在小鼠和人類上，國內(nèi)外尚未見關(guān)于動物AdPLA基 因遺傳變異的研究。中國黃牛AdPLA基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，基因位點的功能研究 及其遺傳變異與經(jīng)濟性狀(如初生重、日增重、體重、體斜長、胸圍等性狀)的關(guān)聯(lián)研究仍 是空白。由于AdPLA基因功能涉及初生重、體重、日增重、體斜長、胸圍等生長和體尺性狀， 本發(fā)明提供的檢測方法為AdPLA基因SNP與生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中 國黃牛生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于利用PCR-RFLP方法檢測黃牛AdPLA基因的多態(tài)性，并將其 與生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，驗證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標記，從 而加快良種選育速度。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種檢測黃牛AdPLA基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含AdPLA基因的待測黃牛 全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛AdPLA基因；用限制性內(nèi)切酶FbaI 消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電 泳結(jié)果鑒定黃牛AdPLA基因第23076位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為上游引物5，-AGATACTCGCCATTGCCTCC-3，20bp ；下游引物5，-GATGGGGGCACACTGAGGACCCACCTGATC-3，30bp。所述的PCR擴增反應程序為94°C 預變性 5min ；30 35 個循環(huán) 94°C 變性 30s，61 °C 退火 30s，72 °C 延伸 30s ； 72°C延伸 IOmin0所述的瓊脂糖凝膠電泳為3%的瓊脂糖凝膠電泳。所述根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛AdPLA基因第23076位的單核苷酸多態(tài)性為TT基因型表現(xiàn)為135bp和30bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為165bp、135bp和30bp條帶；CC 基因型表現(xiàn)為165bp條帶，其中30bp條帶在3%瓊脂糖凝膠電泳中因片段太小不可見，但不
影響鑒定基因型。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明根據(jù)AdPLA基因的序列設(shè)計引物，分別以5個黃牛品種的基因組DNA為模 板，進行PCR擴增，并對PCR產(chǎn)物進行測序，測序后得到黃牛AdPLA基因的部分序列。與 NCBI公布的序列進行比較后，發(fā)現(xiàn)在第23076位存在SNP多態(tài)性。當AdPLA基因第23076 位的T突變?yōu)镃時，導致編碼第127位氨基酸的密碼子由AGT突變?yōu)锳GC，由于密碼子AGT 和AGC均編碼絲氨酸，所以該突變沒有導致氨基酸的變化。但是以下材料證明同義突變?nèi)?然會對蛋白質(zhì)的翻譯速度、含量、折疊結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生影響，進而影響機體的表型性狀。首先， 蛋白質(zhì)的翻譯是通過攜帶相應氨基酸的tRNA識別特定密碼子來實現(xiàn)的，同義密碼子將被 不同的tRNA識別，但在不同物種、組織中，攜帶相同氨基酸的tRNA的量是不同的，這將會 影響蛋白質(zhì)的翻譯速度、含量等；其次，蛋白質(zhì)只有經(jīng)過正確的折疊形成高級結(jié)構(gòu)后才能 發(fā)揮作用，越來越多的研究證明，密碼子的作用不僅決定蛋白質(zhì)的氨基酸序列，還在蛋白質(zhì) 的卷曲折疊中發(fā)揮作用，即同義密碼子也會導致蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響蛋白質(zhì) 的功能。Saunders等人2010年研究發(fā)現(xiàn)同義密碼子的偏愛性會導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化， Kimchi-Sarfaty等人2007年報道MDRl基因的一個同義突變引起蛋白質(zhì)底物特異性的改 變。針對上述第23076位的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其篩查和檢測方法，通過設(shè)計 特定的引物，PCR擴增目的片段，然后用特定的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，能夠簡單、快速、成 本低、精確的檢測其單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明對5個黃牛品種的SNP基因型進行了檢測和基因頻率分析，對上述SNP位 點與黃牛部分生長性狀(初生重、體重、日增重、體斜長和胸圍)進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該 位點能夠作為提高黃牛體斜長和胸圍的分子標記。


圖1為黃牛AdPLA基因PCR產(chǎn)物電泳；圖2為黃牛AdPLA基因第23076位不同基因型PCR產(chǎn)物的FbaI酶切電泳結(jié)果；圖3為黃牛AdPLA基因第23076位不同基因型的測序圖。
具體實施例方式本發(fā)明利用PCR-RFLP方法對黃牛AdPLA基因第23076位同義密碼子突變的單核 苷酸多態(tài)性進行檢測，下面對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是 限定。A、黃牛AdPLA基因第四外顯子區(qū)域PCR引物的設(shè)計以NCBI所公布的牛(NC_007330. 4)序列為參考，利用Primer 5. 0軟件設(shè)計能夠 擴增包含黃牛AdPLA基因第四外顯子區(qū)域的PCR引物，其引物序列如下上游引物5，-AGATACTCGCCATTGCCTCC-3，20bp ；下游引物5，-GATGGGGGCACACTGAGGACCCACCTGATC-3，30bp。
其中下游引物3’端起第3位引入錯配堿基G->A，從而人為構(gòu)建了一個FbaI的 酶切位點TGATCA，可以使用PCR-RFLP方法進行基因型的判定。以上述引物對黃牛基因組擴增，能夠擴增包含黃牛AdPLA基因(NC_007314. 3序 列)第四外顯子區(qū)域第22942bp 23106bp的165bp的基因片段，擴增后片段的電泳檢測 如圖1所示，其中，泳道1 4為檢測片段，泳道M為Marker ；對擴增的片段進行測序鑒定 后，其中，第23051bp 23100bp的序列為如下所示AGCTGCGCTA CGGGGTCCCC CGC|AGT|GACC AGGTGGGTCCTCAGTGTGCC ；經(jīng)過分析，發(fā)現(xiàn)AdPLA基因第23076位(即⑶S區(qū)第381位)存在SNP多態(tài)性；當 AdPLA基因第23076位由T突變?yōu)镃，導致編碼第127位氨基酸的密碼子由AGT突變?yōu)锳GC， 由于密碼子AGT和AGC均編碼絲氨酸，所以該突變沒有引起氨基酸的變化。但是以下材料 證明同義突變?nèi)匀粫Φ鞍踪|(zhì)的翻譯速度、含量、折疊和高級結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生影響，進而影響機 體的表型性狀。首先，蛋白質(zhì)的翻譯是通過攜帶相應氨基酸的tRNA識別特定密碼子來實現(xiàn) 的，同義密碼子將被不同的tRNA識別，但在不同物種、組織中，攜帶相同氨基酸的tRNA的量 是不同的，這將會影響蛋白質(zhì)的翻譯速度、含量等；其次，蛋白質(zhì)只有經(jīng)過正確的折疊形成 高級結(jié)構(gòu)后才能發(fā)揮作用，越來越多的研究證明，密碼子的作用不僅決定蛋白質(zhì)的氨基酸 序列，還在蛋白質(zhì)的卷曲折疊中發(fā)揮作用，即同義密碼子也會導致蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)發(fā)生 變化，影響蛋白質(zhì)的功能。Saunders等人2010年研究發(fā)現(xiàn)同義密碼子的偏愛性會導致蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，Kimchi-Sarfaty等人2007年報道MDRl基因的一個同義突變引起蛋白質(zhì)底 物特異性的改變。由于在P引物對的下游引物中引入了錯配堿基，導致AdPLA基因第23079位堿 基(即上面所示序列中斜體下劃線標注的核苷酸)由C變?yōu)門，所以當?shù)?3076位為T時， PCR擴增AdPLA基因產(chǎn)物的第23076bp 2308Ibp序列為tgatca，形成了限制性內(nèi)切酶 FbaI的酶切位點t/gatca，當在23076位點由T突變?yōu)镃時，PCR擴增AdPLA基因產(chǎn)物的第 23076bp 23081bp序列為cgatca，限制性內(nèi)切酶FbaI不能識別；這樣就可以對該位點SNP 多態(tài)性進行檢測。當用限制性內(nèi)切酶FbaI對引物P擴增的基因片段進行酶切消化時，可以 將PCR產(chǎn)物切成2段或不能切開。B、以引物P進行PCR擴增待測黃牛的AdPLA基因片段1、黃牛樣本的采集本發(fā)明具體以5個中國地方黃牛品種的種群作為檢測對象，具體采集樣本見表1 河南南陽牛(210頭)，陜西秦川牛(224頭)，河南平頂山市郟縣紅牛(414頭)，山東魯西牛 (168頭)，吉林草原紅牛(237頭)；表1黃牛樣本的采集信息 2、基因組DNA的提取、純化、檢測a.從血樣中提取基因組DNA1)冷凍血樣(主要為血細胞)室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 μ L至1. 5mLEppendorf離心管， 加入等體積PBS液，充分混勻，12000r/min離心IOmin (4°C )，棄去上清液，重復上述步驟至 上清液透明、沉淀呈淡黃色；2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 μ L，搖動，使血細胞沉淀脫離離心管管壁， 37°C 水浴 Ih ；3)加蛋白酶K至3yL(20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加 ι μ L蛋白酶κ混勻繼續(xù)消化直至澄清；4)將反應液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 μ L，溫和搖動離心管20min，使其充 分混勻；4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中，重復一次；5)加氯仿500 μ L，充分混勻20min，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另 一 1. 5mL離心管中；6)加氯仿、異戊醇混合液(24 1) 500 μ L，充分混勻20min, 4°C，12000r/min離心 lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中；7)加0. 1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動離心管， 直至白色的絮狀沉淀析出，_20°C放置30 60min ；8) 40C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；9)4°C,12000r/min離心lOmin，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈；10)干燥后的DNA溶于80 100 μ L的TE液，4°C保存直至DNA完全溶解，0. 8%瓊 脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-80°C保存。
b. DNA 的純化l)500yL的DNA溶液中加入10% SDS使其終濃度為0. 1%，加入蛋白酶K至終濃 度達到100 μ g/mL ；2) 5 °C 保溫 IOh 左右；3)等體積苯酚氯仿異戊醇(25 24 1)和氯仿各抽提一次；4) 12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中；5)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉淀DNA ；6)倒掉液體，70%乙醇洗滌后晾干，加入60 μ L滅菌超純水溶解，4°C待檢測；c.分光光度法檢測DNA用紫外光光度計測定DNA樣品在260歷、280歷處的OD值。計算DNA含量和OD26tl/ OD280的比值。如0D26(i/0D28(i比值小于1. 6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應進行純 化；若比值大于1. 8，則應該考慮去除RNA純化。DNA 濃度(ng) = 50 X OD260 值 X 稀釋倍數(shù)DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/ μ L，存于_20°C備用，其余的存放 于-80 0C ο3、PCR 擴增PCR反應體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個反應體系所需的各種組分的數(shù)量和 1次反應所需的PCR反應的個數(shù)，算出各種反應組分的總量，加入到1個1. 5mL離心管中，充 分混勻后瞬時離心，再分裝到每個0. 2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時離 心后進行PCR擴增；PCR反應體系見表2:表2PCR反應體系
_體系成分_越(UL)
滅菌超純水(H20)10.8
2xbuffer (內(nèi)含 Mg2+、dNTPs 等)12.5
^co1引物P上游引物(10pmol/L)0.5
L0068」 25 4 1^反應體系包括0.仙Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2XBuffer 12. 5 μ L (內(nèi)含Mg2\dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng/ μ L含AdPLA基因的黃 ?；蚪MDNA 0. 45 μ L，IOpmol/ μ L上、下游引物各0. 5 μ L ；PCR反應程序為94°C預變性 5min;
94°C變性 30 s，-S
61°C退火30 s, Uo~35個循環(huán)；72°C延伸 30s，72°C延伸 IOmin ；對5個黃牛品種共1255個樣本的基因組DNA進行PCR擴增，獲得1255個個體的 黃牛AdPLA基因片段，即包含該SNP位點的165bp的DNA片段。C、FbaI酶切消化PCR擴增的AdPLA基因片段1、FbaI酶切反應消化體系(25 30 μ L) 10 ~ 15μ L PCR產(chǎn)物，IOX緩沖液 2. 5 3. 0 μ L，F(xiàn)baIdOU/μ L)為 1· 0 1. 5 μ L，滅菌純水(H2O) 11. 5 16. 5 μ L ；2、酶切消化條件37°C恒溫培養(yǎng)箱中消化5 10h。D、FbaI消化PCR產(chǎn)物后瓊脂糖凝膠電泳分析1、制作3%的瓊脂糖凝膠，點樣后120V電壓電泳40min，直至分子量不同的DNA片 段分離清晰，電泳結(jié)束后EB染色；2、EB染色后，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)成像；3、根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析SNP多態(tài)性用BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)照相分析，判斷SNP的多態(tài)性當?shù)?3076位為T時，PCR擴增AdPLA基因產(chǎn)物的第23076bp 23081bp序列為 tgatca，形成了限制性內(nèi)切酶FbaI的酶切位點t/gatca，當在23076位點由T突變?yōu)镃時， PCR擴增AdPLA基因產(chǎn)物的第23076bp 23081bp序列為cgatca，限制性內(nèi)切酶FbaI不能 識別；這樣就可以對該位點SNP多態(tài)性進行檢測。由于黃牛為2倍體，所以黃?；蚪MAdPLA基因第23076位SNP多態(tài)性的瓊脂糖 凝膠電泳結(jié)果為TT基因型表現(xiàn)為135bp和30bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為165bp、135bp和30bp條帶； CC基因型表現(xiàn)為165bp條帶，其中30bp條帶在3%瓊脂糖凝膠電泳中因片段太小不可見， 但通過165bp和135bp這兩條帶還是能夠準確的鑒定TT基因型、TC基因型和CC基因型 只有165bp條帶的為CC基因型個體；只有135bp條帶為TT基因型個體；同時包含165bp和 135bp條帶為TC基因型個體。如圖2所示，其中，左起第2泳道只有165bp —條帶，為CC基因型個體，左起第3 泳道只有135bp —條帶，為TT基因型個體，左起第4泳道包含165bp和135bp兩條帶，為TC 基因型個體，泳道 M 為 Marker I (600bp, 500bp,400bp, 300bp, 200bp, IOObp)。4、TC基因型個體PCR產(chǎn)物的測序驗證利用ABI 377和ABI 3730測序儀對不同基因型個體PCR產(chǎn)物分別進行正反雙向 測序；同時，進行SNP位置分析，結(jié)果表明包含165bp和135bp條帶的雜合子TC基因型個 體，其23076位的測序圖確實表示為T和C雜合子，如圖3c左起第5位核苷酸所示；同時只 有165bp條帶的純合子CC，其23076位的測序圖如圖3a左起第5位核苷酸所示為C ；只有 135bp條帶的純合子TT，其23076位的測序圖如圖3b左起第5位核苷酸所示為C。
E、黃牛AdPLA基因SNP位點的頻率統(tǒng)計分析1、基因和基因型頻率基因型頻率是指一個群體中某一性狀的某種基因型個體數(shù)占總個體數(shù)的比率。Paa =NAA/N，其中Paa代表某一位點的AA基因型頻率；Naa表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)； N為檢測群體的總數(shù)量?；蝾l率是指一個群體中某一基因數(shù)對其等位基因總數(shù)的相對比率。計算的公式
可以寫成PA = (2NM+NAal+NAa2+NAa3+NAa4+......+NAan)/2N式中，Pa表示等位基因A頻率，Naa表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)量，NAai表 示群體中具有Aai基因型個體數(shù)量，al-an為等位基因A的η個互不相同的復等位基因。本研究所涉及的等位基因為T和C，所以具體的基因頻率計算公式為Pc = (2NCC+NTC) /2NPt = (2NTT+NTC) /2N式中，PT，Pc分別表示等位基因T和C等位基因的頻率，NTT、NTe和Nee分別表示TT、 TC和CC基因型的個體數(shù)量，N表示總?cè)后w數(shù)目。在不同黃牛品種AdPLA基因SNP中的T等位基因頻率變化幅度在24. 71. 7%, C等位基因頻率變化幅度在28. 3% 75. 9%之間，如表3所示。表3黃牛AdPLA基因第23076位SNP基因頻率分布表 F、黃牛AdPLA基因SNP位點基因效應的關(guān)聯(lián)分析基因型數(shù)據(jù)FbaI識別的基因型(TT、TC和CC)；生產(chǎn)數(shù)據(jù)南陽牛6月、12月、18月和24月齡的體重、日增重、體斜長和胸圍數(shù)據(jù)；關(guān)聯(lián)分析模型先對數(shù)據(jù)進行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對數(shù)據(jù)校正； 根據(jù)數(shù)據(jù)特征，應用SAS (9. 1)軟件的GLM過程分析基因型和品種對各性狀效應。在對基因 型效應進行分析時采用了固定模型Yijkl = μ+BFJMonthfG1^eijkl其中Yijkl為性狀觀察值，μ為總體均值，BFi為第i個品種和農(nóng)場的固定效， Monthj為第j個月觀測的固定效應，Gk為第k個單SNP標記基因型的固定效應，eiJkl為隨機誤差。結(jié)果表明(見表4)黃牛AdPLA基因第四外顯子FbaI位點，18月齡和24月齡TT 基因型的個體體斜長均高于CC基因型個體且差異顯著(P < 0. 05)，TT基因型個體相對于 CC基因型個體，18月齡和24月齡體斜長性狀分布提高了 6. 22%和5. 40%,TT基因型18月 齡和24月齡體斜長也均高于TC基因型，但未達到顯著水平(P>0.05) ；24月齡TT基因型 個體胸圍顯著大于CC基因型和TC基因型個體(P < 0. 05)，分別提高了 8. 24%和6. 58%。 以上說明TT基因型可以作為一個提高黃牛體斜長和胸圍的候選分子遺傳標記。表4AdPLA基因FbaI多態(tài)位點與南陽牛各月齡體斜長和胸圍之間的方差分析 注具有相同字母表示差異不顯著(P >0.05)，字母不同表示差異顯著(P < 0. 05)。
權(quán)利要求
一種檢測黃牛AdPLA基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含AdPLA基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛AdPLA基因；用限制性內(nèi)切酶FbaI消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛AdPLA基因第23076位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為上游引物5’ AGATACTCGCCATTGCCTCC 3’20bp；下游引物5’ GATGGGGGCACACTGAGGACCCACCTGATC 3’ 30bp。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛AdPLA基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述 的PCR擴增反應程序為94°C預變性5min ；30 35個循環(huán)94°C變性30s，61°C退火30s，72°C延伸30s ；72°C延 伸 IOmin0
3.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛AdPLA基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述 的瓊脂糖凝膠電泳為3%瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛AdPLA基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，根據(jù) 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛AdPLA基因第23076位的單核苷酸多態(tài)性為TT基因型表現(xiàn) 為135bp和30bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為165bp、135bp和30bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為165bp 條帶，其中30bp條帶在3%瓊脂糖凝膠電泳中因片段太小不可見，但不影響鑒定基因型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測黃牛AdPLA基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含AdPLA基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛AdPLA基因；用限制性內(nèi)切酶FbaI消化PCR產(chǎn)物后，再進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定黃牛AdPLA基因第23076位的基因型；由于AdPLA基因功能涉及初生重、體重、日增重、體斜長、胸圍等生長和體尺性狀，基因型數(shù)據(jù)與這些性狀關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)18月齡和24月齡TT基因型個體的體斜長顯著大于CC基因型個體(P＜0.05)；24月齡時TT基因型個體胸圍顯著大于CC基因型個體(P＜0.05)。以上說明TT基因型可以作為一個提高黃牛體斜長和胸圍的候選分子遺傳標記。本發(fā)明提供的檢測方法可以用于中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
文檔編號C12Q1/68GK101921852SQ20101025560
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者侯飛, 張亞, 朱金龍, 藍賢勇, 陳宏 , 雷初朝 申請人:西北農(nóng)林科技大學