專利名稱：一種產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物的篩選方法，特別涉及一種生物合成產(chǎn)Y-氨基丁酸乳酸 菌的篩選方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Y-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid, GABA)，又叫氨酪酸，是一種非蛋白質(zhì)組成 的天然氨基酸，為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有重要的生理功 能如降血壓作用；改善腦機能，延長記憶力；鎮(zhèn)靜神經(jīng)，抗焦慮作用；改善肝功能；活化腎 功能，降低膽固醇。GABA除具有上述的生理作用外，還有調(diào)節(jié)激素分泌，改善更年期綜合癥， 促進(jìn)酒精代謝、消臭、高效減肥、誘發(fā)人精子頂體、促進(jìn)動物的抗病和生長等功能。另外，大 量研究證明，GABA的缺乏將導(dǎo)致癲癇病的發(fā)生，因此在飲食中適當(dāng)補充GABA對由于GABA的 缺乏引起的癲癇病有一定預(yù)防作用。由于其特殊生理功能，GABA已經(jīng)成為一種新型功能性 因子，正被廣泛用于食品保健、醫(yī)藥、化工和農(nóng)業(yè)等行業(yè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。制備GABA的方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法，其中生物合成法又包括植 物富集法和微生物發(fā)酵法。生物合成法是利用生物體內(nèi)的谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)作為催化劑，將L-谷氨酸或其鈉鹽α -脫羧生成GABA。相比而言， 化學(xué)合成反應(yīng)條件劇烈，采用的化學(xué)溶劑具有毒性和腐蝕性，副產(chǎn)物多，安全性差，主要應(yīng) 用于化工行業(yè)。生物合成法較化學(xué)合成法具有條件溫和，環(huán)境污染相對較低、安全性高等優(yōu) 點。另外，由于微生物具有生長速度快、生長條件較簡單、代謝過程特殊和分布廣泛等特點， 是生物酶的重要來源。因此，利用微生物生產(chǎn)GABA，不受資源、環(huán)境和空間的限制，具有顯著 的優(yōu)點。目前已在多種微生物中發(fā)現(xiàn)了 GAD的存在。文摘用海藻酸鈣包埋法將大腸桿菌 制成固定化細(xì)胞，與谷氨酸溶液進(jìn)行間歇反應(yīng)、連續(xù)攪拌式反應(yīng)及柱式反應(yīng)生產(chǎn)GABA。 間歇反應(yīng)5h轉(zhuǎn)化率達(dá)到100% ；連續(xù)攪拌式反應(yīng)在三角瓶中進(jìn)行，以6mL/h的流速輸入底 物溶液和輸出反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化率達(dá)85% ；連續(xù)柱式反應(yīng)器中進(jìn)行，控制流速12mL/h，轉(zhuǎn)化率達(dá) 95%。趙景聯(lián)等，《生物工程學(xué)報》，1989，5 (2) 124-128。文摘用海藻酸鈣包埋法將大腸桿 菌制成固定化細(xì)胞，對后道味精母液提取谷氨酸后的廢液進(jìn)行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA，獲得了 GABA 含量達(dá)到了 98.94%。章汝平等，長沙電力學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，1998，13(4) :433 435。文摘Kono等對紅曲beni-koji制作中的GABA含量變化進(jìn)行了研究，GABA含量最 高達(dá)到 120yg/g。KonoI 等，Biosci Biotechnol Biochem, 2000,64 (3) :617 619。文 摘Wang等利用Monascus purpureus NTU 601進(jìn)行固體發(fā)酵，GABA含量達(dá)到了 5004mg/ kg。Wang J 等，J Ind Microbiol Biotechnol，2003，30 :669 676。文摘介紹了從生 產(chǎn)奶酪的菌株中分離到一株Lactococcus Iactis 01_7，用于奶酪的生產(chǎn)，奶酪中GABA的 含量達(dá)至IJ 383mg/kg。Nomura M 等，J dairy Sci.，1998，81 1486 1491。文摘從乳酸 菌中篩選到了高產(chǎn)GABA的Lactococcus Iactis菌株，25L罐發(fā)酵發(fā)酵72h，發(fā)酵液的GABA 含量達(dá)到了 2.50mg/mL。徐建軍，博士學(xué)位論文，江南大學(xué)，2004年2月。文摘對高產(chǎn)GABA乳酸菌篩選和發(fā)酵條件進(jìn)行了報道，發(fā)酵液中的GABA達(dá)到3. lg/L。劉清等，氨基酸和 生物資源，2004，26(1) :40 43。文摘報道了利用 Lactobacillus brevis IF0-12005 對酒糟進(jìn)行發(fā)酵，GABA的含量達(dá)到了 10. 18mM，通過離心、絮凝、脫色和脫臭處理獲得了 較好的 GABA 溶液，可用于食品強化 GABA。Yokoyama S 等，Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002,93 (1) :95 97。i；·
MM Lactobacillus ρlantarum ^lJffi 米糠抽提液的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)GABA，在干粉中含量達(dá)到了 5 %。愛宕世高等，食品i科學(xué)， 2001，(8) :81 85。文摘從日本傳統(tǒng)發(fā)酵魚(fima sushi)中分離到了一株副干酪乳桿 菌Lactobacillus paracasei NFRI 7415，經(jīng)過對發(fā)酵條件優(yōu)化，發(fā)酵液中GABA含量達(dá)到了 302mM, Komatsuzaki 等，F(xiàn)ood Microbiol, 2005, 22 497 504。til|ffi Streptococcus salivarius subsp. thermophilus Y_2細(xì)胞轉(zhuǎn)化谷氨酸，在含有90g/L谷氨酸的反應(yīng)體系中 使轉(zhuǎn)化液中的GABA濃度達(dá)到了 87. 16g/L。利用嗜熱鏈球菌Y-發(fā)酵，建立二步發(fā)酵法，優(yōu)化 了發(fā)酵條件后，75L發(fā)酵罐的發(fā)酵醪中GABA濃度達(dá)到了 6. 27g/L。楊勝遠(yuǎn)，博士學(xué)位論文， 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006年6月。乳酸菌是具保健作用的益生菌，是一種公認(rèn)安全的微生物，在國內(nèi)外長期廣泛應(yīng) 用于酸奶、奶酪和泡菜等食品的生產(chǎn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種乳酸菌具有GAD活力。因此，可從 乳酸菌中定向篩選高產(chǎn)GAD的菌株，建立優(yōu)良功能特性的益生菌有效的篩選方法。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)Y -氨基丁酸乳酸菌的篩選方法，探索了優(yōu)良功能 特性的益生菌定向篩選的有效方法。技術(shù)方案本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的通過常規(guī)方法分離純化乳酸菌，將純化后的菌種接種于 MRS培養(yǎng)基中，待菌體生長達(dá)到穩(wěn)定期時，離心收集菌體，采用全細(xì)胞催化，以L-谷氨酸或 L-谷氨酸鈉為唯一底物，以醋酸_醋酸鈉為緩沖體系，在PH3. 2 8. 0，20 80°C下進(jìn)行 攪拌反應(yīng)1 24h，利用乳酸菌含有的谷氨酸脫羧酶使L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉發(fā)生脫羧 作用生成Y-氨基丁酸，然后通過紙層析分析反應(yīng)體系中是否含有Y-氨基丁酸來篩選產(chǎn) Y-氨基丁酸的乳酸菌。Y -氨基丁酸乳酸菌的篩選方法具體步驟如下1. 一種產(chǎn)Y-氨基丁酸乳酸菌的篩選方法，其特征為1)乳酸菌的富集培養(yǎng)選擇富含乳酸菌食品新鮮牛奶、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品、發(fā)酵蔬菜制品或發(fā)酵谷 物為富集樣品，加入到脫脂牛乳或MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，25 40°C靜置培養(yǎng) 24 48h，富集培養(yǎng)液；2)乳酸菌的初步分離純化取上述富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋(即10倍梯度倍比稀釋)成10_4、10_5、10_6的稀 釋菌液，涂布于MRS平板上，于30°C培養(yǎng)48h，挑取肉眼可見、生長較快、單個有溶鈣圈的菌 落分離并純化，根據(jù)菌落特征進(jìn)行初步歸類，將革蘭氏染色陽性、無芽孢、接觸酶陰性菌株 作為進(jìn)一步篩選的乳酸菌疑似菌株，并將其編號、保存；
3)產(chǎn)Y _氨基丁酸乳酸菌的篩選將上述分離純化后的菌種接種于MRS培養(yǎng)基中，待菌體生長達(dá)到穩(wěn)定期時，離心 收集菌體，加入0. 5 3倍培養(yǎng)液體積的滅菌生理鹽水洗滌菌體2 4次，取濕菌體0. 1 lg，懸浮于5 50mL含有5 IOOmM的L-谷氨酸(L-Glu)或L-谷氨酸鈉溶液的0. 2mol化一1 醋酸_醋酸鈉緩沖體系中，在PH3. 2 8. 0，20 80°C下進(jìn)行攪拌反應(yīng)1 24h，反應(yīng)結(jié)束 后，將混合液離心后，取上清進(jìn)行紙層析分析，所述的紙層析分析方法為，展開劑組成正丁 醇冰乙酸水體積比=4:1:3，內(nèi)含質(zhì)量濃度為0. 4g/100mL的茚三酮，以GABA標(biāo)準(zhǔn) 品做參比，待測樣品點樣5 μ L，采用新華一號層析紙展開后于90°C下烘干顯色20min ；4)產(chǎn)Y-氨基丁酸乳酸菌的判斷如果紙層析分析反應(yīng)體系中存在與GABA相對標(biāo)準(zhǔn)品Rf —致的茚三酮顯色斑點， 則含有Y-氨基丁酸，即為篩選得到產(chǎn)Y-氨基丁酸的乳酸菌。5)產(chǎn)Y-氨基丁酸乳酸菌的鑒定(1)形態(tài)學(xué)鑒定培養(yǎng)特征、細(xì)胞形態(tài)及其染色特性、特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、運動性等。(2)生理生化鑒定糖醇類發(fā)酵試驗，耐鹽試驗，不同溫度試驗等。(3) 16S rDNA序列分析進(jìn)行菌株的鑒定采用細(xì)菌總DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物進(jìn)行 PCR擴增。PCR結(jié)束后，吸取PCR產(chǎn)物5 μ L與1 μ L loading buffer混合，用1. 0%的瓊脂 糖凝膠電泳，電壓為100V。電泳結(jié)束后用溴化乙錠EB染色20 30min，拍照。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后測序。將16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行 同源性分析。通過以上形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA序列測定并進(jìn)行同源性比對分 析，對產(chǎn)Y-氨基丁酸的乳酸菌進(jìn)行鑒定。有益效果(1)本發(fā)明的優(yōu)點是采用全細(xì)胞催化，以L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉為唯一底物，以 醋酸-醋酸鈉為緩沖體系，轉(zhuǎn)化液中無其他培養(yǎng)基成分，利用乳酸菌可能存在的谷氨酸脫 羧酶，將底物L(fēng)-谷氨酸或L-谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化為Y -氨基丁酸，然后通過紙層析分析轉(zhuǎn)化液中 是否存在GABA，紙層析后表現(xiàn)為顯色條帶僅為一條或兩條，很容易判斷菌株是否為GABA產(chǎn) 生菌株，大大提高篩選效率。(2)本發(fā)明的另一個優(yōu)點是反應(yīng)條件溫和、方法簡單、易于操作。 四

圖1菌株轉(zhuǎn)化液紙層析圖。1. 5mmol/L L-Glu (5 μ L) ；2. 5mmol/L L-GABA (5 μ L) ；3. 5mmol/L L-Glu+5mmol/L L-GABA (各 2. 5 μ L) ；4. fmbll2_4 的細(xì)胞轉(zhuǎn)化液(5 μ L)。圖2菌株fmbll2_4的16S rDNA擴增條帶。圖3基于具有谷氨酸脫羧酶GAD活性細(xì)菌的16S rDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹。五具體實施例方式(1)乳酸菌的富集培養(yǎng)取10 20mL的發(fā)酵乳制品(上海光明乳業(yè)股份有限公司、南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公 司)、新鮮牛奶(取自安徽科技學(xué)院畜牧科技園)、發(fā)酵果蔬制品(揚州三和醬菜)等為原 料，經(jīng)滅菌蒸餾水稀釋后，取10 20mL加入到100 20mL脫脂牛乳或MRS液體培養(yǎng)基中 進(jìn)行富集培養(yǎng)，37 °C培養(yǎng)48h，得富集培養(yǎng)液。所述的脫脂牛乳培養(yǎng)基10g脫脂乳粉加入到IOOmL蒸餾水中，115°C滅菌lOmin。所述的MRS液體培養(yǎng)基蛋白胨10. Og，牛肉膏10. Og，酵母膏5. 0g，葡萄糖20. Og, 乙酸鈉5. Og,檸檬酸三銨2. Og,磷酸氫二鉀2. Og,七水硫酸鎂0. 58g，一水硫酸錳0. 20g， I￥EEN-801mL，蒸餾水 lOOOmL，調(diào)節(jié) pH 至 6. 5，121°C 滅菌 15min。(2)乳酸菌的分離純化無菌操作，取ImL上述富集培養(yǎng)液至9mL滅菌生理鹽水中，充分震蕩混勻，制成菌 懸液，然后用10倍梯度稀釋成10-4、10_5、10-6的稀釋菌液，取上述的三個稀釋度的樣品各 0. ImL涂布于含有CaCO3的MRS平板上，37 °C恒溫培養(yǎng)24 48h ；挑取肉眼可見、生長較快、 菌落周圍有溶鈣圈、革蘭氏染色陽性、接觸酶試驗陰性的菌株，繼續(xù)進(jìn)行反復(fù)劃線分離、純 化，直至純的單菌落為止，并將所獲得的菌株編號、保存?zhèn)溆谩?3)產(chǎn)Y _氨基丁酸的乳酸菌的篩選菌株經(jīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8 24h后，以 0. 5 5%的接種量轉(zhuǎn)接于MRS培養(yǎng)基中，在25 45°C下靜置培養(yǎng)12 36h，即得含菌體的 培養(yǎng)物，取培養(yǎng)物在5000 10000r/min、2 40°C下離心5 20min收集菌體，加入0. 5 3倍培養(yǎng)液體積的滅菌生理鹽水洗滌菌體2 4次。取濕菌體0. 1 lg，懸浮于5 50mL 含有5 IOOmM的L-谷氨酸(L-Glu)或L-谷氨酸鈉溶液的0. 2mol · Γ1醋酸-醋酸鈉緩 沖體系中，在ΡΗ3. 2 8. 0，20 80°C下進(jìn)行攪拌反應(yīng)1 24h。反應(yīng)結(jié)束后，將混合液離 心后，取上清進(jìn)行紙層析分析體系中是否存在Y-氨基丁酸(GABA)。進(jìn)而判斷所篩選的菌 株是否為產(chǎn)Y-氨基丁酸的菌株。所述的紙層析分析方法如下展開劑組成V(正丁醇)V(冰乙酸)V(水)=4 1 3，內(nèi)含質(zhì)量濃度為 0.4g/100mL的茚三酮。以GABA標(biāo)準(zhǔn)品做參比，待測樣品點樣5 μ L。采用新華一號層析紙 展開后于90°C下烘干顯色20min。利用上述方法，從新鮮牛奶中篩選到一株產(chǎn)GABA的乳酸菌株fmbll2_4。如圖1 所示，fmbll2-4全細(xì)胞催化反應(yīng)液存在明顯與GABA標(biāo)準(zhǔn)品Rf —致的茚三酮顯色斑點，同 時GAD是生物催化L-Glu及其鹽類的α -羧基脫羧反應(yīng)生成GABA的唯一酶，進(jìn)而判斷菌株 fmbll2-4存在GAD，將底物L(fēng)-Glu轉(zhuǎn)化為GABA。(4)產(chǎn)Y _氨基丁酸的乳酸菌的鑒定1)形態(tài)學(xué)特征鑒定菌株fmb 112-4在MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，其菌落表面光滑、濕潤、呈乳白色、邊 緣整齊，直徑約1mm，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為陽性，符合乳酸菌特性。2)生理生化鑒定表1菌株fmbll2_4生理生化鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
一種產(chǎn)γ 氨基丁酸乳酸菌的篩選方法，其特征為1)乳酸菌的富集培養(yǎng)選擇富含乳酸菌食品新鮮牛奶、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品、發(fā)酵蔬菜制品或發(fā)酵谷物為富集樣品，加入到脫脂牛乳或MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，25～40℃靜置培養(yǎng)24～48h，富集培養(yǎng)液；2)乳酸菌的初步分離純化取上述富集培養(yǎng)液進(jìn)行10梯度倍比梯度稀釋成10 4、10 5、10 6的稀釋菌液，涂布于MRS平板上，于30℃培養(yǎng)48h，挑取肉眼可見、生長較快、單個有溶鈣圈的菌落分離并純化，根據(jù)菌落特征進(jìn)行初步歸類，將革蘭氏染色陽性、無芽孢、接觸酶陰性菌株作為進(jìn)一步篩選的乳酸菌疑似菌株，并將其編號、保存；3)產(chǎn)γ 氨基丁酸乳酸菌的篩選將上述分離純化后的菌種接種于MRS培養(yǎng)基中，待菌體生長達(dá)到穩(wěn)定期時，離心收集菌體，加入0.5～3倍培養(yǎng)液體積的滅菌生理鹽水洗滌菌體2～4次，取濕菌體0.1～1g，懸浮于5～50mL含有5～100mM的L 谷氨酸或L 谷氨酸鈉溶液的0.2mol·L 1醋酸 醋酸鈉緩沖體系中，在pH3.2～8.0，20～80℃下進(jìn)行攪拌反應(yīng)1～24h，反應(yīng)結(jié)束后，將混合液離心后，取上清進(jìn)行紙層析分析，所述的紙層析分析方法為，展開劑組成正丁醇∶冰乙酸∶水體積比＝4∶1∶3，內(nèi)含質(zhì)量濃度為0.4g/100mL的茚三酮，以GABA標(biāo)準(zhǔn)品做參比，待測樣品點樣5μL，采用新華一號層析紙展開后于90℃下烘干顯色20min；4)產(chǎn)γ 氨基丁酸乳酸菌的判斷如果紙層析分析反應(yīng)體系中存在與GABA標(biāo)準(zhǔn)品相對遷移率Rf一致的茚三酮顯色斑點，則含有γ 氨基丁酸，即為即為篩選得到產(chǎn)γ 氨基丁酸的乳酸菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種產(chǎn)Y-氨基丁酸乳酸菌的篩選方法，其篩選得到產(chǎn)Y-氨 基丁酸的乳酸菌鑒定方法為(1)形態(tài)學(xué)鑒定培養(yǎng)特征、細(xì)胞形態(tài)及其染色特性、特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、運動性；(2)生理生化鑒定糖醇類發(fā)酵試驗，耐鹽試驗，不同溫度試驗；(3)16S rDNA序列分析進(jìn)行菌株的鑒定采用細(xì)菌總DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR 擴增，PCR結(jié)束后，吸取PCR產(chǎn)物5 μ L與1 μ L loading buffer混合，用1. 0%的瓊脂糖凝 膠電泳，電壓為100V，電泳結(jié)束后用溴化乙錠EB染色20 30min，拍照；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，將16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行同源 性分析；通過以上形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA序列測定并進(jìn)行同源性比對分析，對 產(chǎn)Y-氨基丁酸的乳酸菌進(jìn)行鑒定。
全文摘要
本發(fā)明闡述了一種產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。取經(jīng)分離純化的乳酸菌，接種于MRS培養(yǎng)基中，待菌體生長達(dá)到穩(wěn)定期時，離心收集菌體，采用全細(xì)胞催化，以L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉為唯一底物，以醋酸-醋酸鈉為緩沖體系，在pH3.2～8.0，20～80℃下進(jìn)行攪拌反應(yīng)1～24h，利用產(chǎn)GAD乳酸菌含有的谷氨酸脫羧酶使L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉發(fā)生脫羧作用生成γ-氨基丁酸，然后通過紙層析分析反應(yīng)體系中是否含有γ-氨基丁酸來篩選產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌，并通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析對所產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌株進(jìn)行鑒定。本發(fā)明的方法可以大大提高功能性益生菌的定向篩選效率。
文檔編號C12Q1/68GK101948767SQ201010256208
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者別小妹, 呂鳳霞, 李遠(yuǎn)宏, 鄒曉葵, 陸兆新 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)